환자 말초 혈액 단핵 세포에서 인간 심근세포의 생성 및 확장

이것은 포괄적인 프로토콜 시설, 원시 부스트 생성, 및 말초 혈액 단핵 세포에서 환자 특정, 배양을 두드리는 것을 사용합니다. 이 전술은 재현 가능하고 따르기 쉽습니다. 그리고 줄기 세포 발라드, 또는 심장 혈관 의학에 특별한 전문을 필요로하지 않습니다.

우리의 프로토콜은 심혈관 질병을 모델링하고 새로운 약의 심장 독성을 시험하는 데 사용할 수있는 단일 혈액 무승부에서 환자 특정 심근세포를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 줄기 세포 재프로그래밍 유지 보수 및 지시 된 분화를 위해 오랜 노력을 필요로한다. 그러나, 당신은 정말 당신의 노력을 주셔서 감사합니다.

접시에 심장 근세포가 뛰는 것을 볼 때. 인간 iPSC 식민지가 90% 이상의 합류에 도달하면, 37°C에서 DPBS에서 0.5 밀리리터의 1밀리리터로 세포를 치료하기 전에 DPBS의 3밀리리터로 각각 잘 헹구는 다. 5~8분 후에 는 iPSC 통과 매체1밀리리터를 각 웰에 넣고 수동으로 세포를 빼낸다.

개별 우물에 세포의 600 ~ 900 마이크로 리터를 전송하는 것은 37 섭씨 와 5 %의 이산화탄소에서 하룻밤 배양을위한 지하 멤브레인 코팅 여섯 우물 플레이트가 있습니다. 그런 다음 3~4일 동안 매일 2밀리리터의 완전한 E8 배지로 문화를 새로 고칩니다. 문화가 합류에 도달하면 배지를 심근 세포 분화 배지의 2 밀리리터로 대체하십시오.

둘째 날에는 초중제를 심근세포 분화 배지 1개 2밀리리터로 교체하십시오. 셋째 날에는 초중제를 심근세포 분화 배지 3의 밀리리터 2개로 교체하십시오. 5일째.

상체를 심근세포 분화 배지 1의 2밀리리터로 교체하십시오. 7일에서 10일째에, 상체를 심근세포 분화 매체 4의 2밀리리터로 교체하십시오. 11일과 13일.

수축 세포가 관찰될 때, 상체를 심근세포 분화 배지 5의 2밀리리터로 교체하십시오. 15일, 17일, 19일, 21일. 상체를 심근세포 분화 매체 4의 2밀리리터로 교체하십시오.

7 일 당 완전한 혈액 배지와 사전 배양 후, PBMC의 눈에 보이는 핵과 세포질로 큰 된다 그들은 센다이 바이러스 재프로그래밍 요인으로 트랜스 페트에 대 한 준비가 표시. 소개 시 완전한 E8 매체. 완전히 다시 프로그래밍 된 세포는 식민지를 연결하고 형성하기 시작합니다.

4~5개의 구절 후에, 고도로 순수한 iPSC 식민지는 관찰된 아주 몇몇 분화한 세포와 재프로그래밍된 세포에서 형성될 것입니다. 이 단계에서, 세포의 대부분은 OCT4와 NANOG 양성 그들의 pluripoteny의 표시. 심근세포는 보통 12일간의 분화 후에 관찰됩니다.

포도당 기아 후, iPSC 심근세포는 상호 작용된 심장 트로포닌 T 및 알파 액틴 발현을 가진 정렬된 사코프레 구조를 나타내고, 자발적인 구타 및 정렬된 사코프레 구조를 나타낸다. 식민지는 트로포닌 T 표현에 의해 입증 된 대로 그들의 순도 유지. iPSC 심근세포는 성인 심근세포에 비해 상대적으로 미숙하지만.

그들은 도매 패치, 클램프에 의해 측정된 작업 잠재력과 같은 심실 및 심방적 을 보여줍니다. 심실 심근세포는 MYOSin 광 사슬 2를 표현하는 반면, 심방 iPSC 심근세포는 NR2F2 발현으로 표시됩니다. Wnt 활성화는 세포 분열을 자극하고 세포 주기 조절기의 발현을 촉진합니다.

흥미롭게도, Wnt 활성화는 또한 이 증식 능력이 시간이 지남에 따라 감소하더라도, 대조군에 비해 두 개의 통로에 대한 초기 iPSC 심근세포의 강력한 증식을 유도합니다. IPSC 재프로그래밍 벡터가 IPSC 재프로그래밍에 매우 중요하기 때문에 IPSC 재프로그래밍 벡터가 도입되기 전에 PBMS가 명확한 핵 및 세포질로 확대되는지 확인하십시오. 환자 특정 심근세포는 체외에서 심혈관 질환을 모델링하고 심장 줄기 세포 치료를 위한 수많은 기증자 세포를 제공하는 데 유용합니다.