헬름홀츠 젠트럼 베를린에서 결정화 조각 검사를 위한 워크플로우 및 도구
2021년 3월 3일
헬름홀츠 젠트럼 베를린의 결정적 단편 스크리닝은 전용 복합 라이브러리, 크리스탈 처리 도구, 빠른 데이터 수집 시설 및 대부분 자동화된 데이터 분석이 있는 워크플로우를 사용하여 수행됩니다. 제시된 프로토콜은 다운스트림 구조 기반 리간드 설계에 대한 유망한 출발점을 제공하기 위해 이러한 실험의 출력을 극대화할 계획입니다.
엑스레이 결정학을 사용하여 단편에게 불린 더 작은 유기 화합물의 검열은 약 발견 또는 생화확적인 공구 화합물 발달을 위한 출발점인 분자를 확인하는 능률적인 방법입니다. 결정화 단편 스크리닝은 정체성뿐만 아니라 연구 하에 단백질 표면에 파편이 어디에 어떻게 결합되는지를 밝혀냈습니다. 이 기술은 적합한 단백질 결정이 재배될 수 있는 모든 생화학적 또는 의학적으로 관련있는 단백질 표적에 사용될 수 있습니다.
결과의 품질은 샘플 처리의 품질에 밀접하게 연결됩니다. 우리는 다음과 같은 시각적 데모가 연구원이 고품질의 실험을 수행하는 데 도움이 될 것이라고 믿습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 박사 연구원이자 박사 과정 학생인 Tatjana Barthel이 될 것입니다.
시작하려면, 실온에 미리 따뜻하게 스크리닝 플레이트의 가방을 열고, 다음 검사 플레이트에서 뚜껑과 호일을 제거합니다. 시약 저장소에 5 밀리리터 담그용 용액을 데산합니다. 그런 다음 12 채널 파이펫을 사용하여 40 마이크로 리터의 담그용으로 플레이트의 96 개의 저수지를 채웁니다.
스크리닝 플레이트 위에 쉽게 접근할 수 있는 프레임을 배치하고 장치의 왼쪽과 오른쪽으로 슬라이딩하여 포함된 클램프로 고정합니다. 스크리닝 플레이트와 현미경 아래에 쉽게 접근할 수 있는 프레임을 놓고 프레임의 각각아크릴 유리 타일을 이동하여 첫 번째 우물을 엽니다. 0.4 마이크로리터의 침을 흡수용 용액을 저수지에서 신선한 파이펫 팁을 사용하여 잘 함유된 조각에 추가합니다.
드롭이 말린 조각을 덮는지 확인합니다. 제2 현미경 아래에 가장 큰 결정이 포함된 결정화 플레이트를 놓고 우물 중 하나에서 밀봉 호일을 열어 놓습니다. 적절한 크기의 루프를 사용하여 첫 번째 현미경하에서 스크리닝 플레이트의 우물로 크리스탈을 전달합니다.
준비된 유리 반점 플레이트에서 루프를 씻은 다음 조직에 부드럽게 만져 서 말리십시오. 교차 오염을 피하기 위해 모든 전송 후이 작업을 수행합니다. 현미경을 사용하여 결정이 제대로 배치되었는지 확인합니다.
두 번째 결정에 대한 절차를 반복합니다. 다음 우물로 이동하고 남아있는 모든 우물에 대한 절차를 반복합니다. 결정이 스크리닝 플레이트의 모든 96개의 우물로 옮겨진 후, 현미경 아래에서 쉽게 접근할 수 있는 프레임과 함께 스크리닝 플레이트를 제거하고 벤치 나 테이블에 놓습니다.
그런 다음 스크리닝 플레이트에서 쉽게 접근할 수 있는 프레임을 제거하고, 스크리닝 플레이트를 밀봉 호일로 밀봉하고, 이전에 최적화된 담그기 시간 동안 배양하기 위해 결정화 인큐베이터 또는 찬장에 배치한다. 2시간 의 배양으로 충분하지만 하룻밤이 더 편리 할 수 있습니다. 유니퍽 폼 드와르를 유니퍽 뚜껑 3개와 함께 준비하고 절반은 액체 질소로 채우며 땅에 보관합니다.
반쯤 채워진 드와르를 벤치로 옮기고 완전히 가장자리로 채웁니다. 전체 실험 중에 상부 모서리에 채우고 액체 질소를 자주 교체하십시오. 인큐베이터에서 스크리닝 플레이트를 검색하고 호일을 제거합니다.
쉽게 접근할 수 있는 프레임을 위에 놓습니다. 첫 번째 우물을 엽니다. 드롭에서 하나의 크리스탈을 수확하고 빠른 수직 움직임으로 급락하여 액체 질소로 냉각.
샘플을 적절한 퍽 위치에 삽입하고 샘플 추적 시트에 관련 메모를 작성합니다. 두 번째 결정에 대한 절차를 반복합니다. 다음 우물로 가서 세 개의 퍽이 모두 가득 차날 때까지 다른 결정의 위치를 반복하십시오.
액체 질소에 Unipuck 기지를 미리 냉각하고 뚜껑 위에 추가합니다. 유니퍽을 저장 선반에 보관하여 데와르 또는 스토리지 드와르에 보관하십시오. 측정될 때까지 극저온 온도에서 액체 질소를 보관하십시오.
스크리닝 플레이트에 남아 있는 시료에 대해 유니퍽에 크리스탈을 수확하고 저장하는 동일한 절차를 반복합니다. 파편담그고 결정 수확을 수행한 후 결정 형태학의 가변성이 여기에 도시된다. 다소 악화된 것처럼 보이는 결정조차도 여전히 유용한 데이터를 생성하기 때문에 포함되었습니다.
데이터는 BESSY II 싱크로트론에서 빔라인 14.1 및 14.2에서 수집되었다. 회절 데이터 수집은 각 샘플에 대해 수행되었습니다. 이 데이터는 FragMAXapp을 사용하여 분석되었으며 처리를 위한 XDSAPP, 구조 개선을 위한 fspipeline 및 적중 발견을 위한 PenDA의 조합에 중점을 두였습니다.
이로 인해 DMSO 무료 담그기 조건을 사용하여 AR 단백질 복합체에서 15개의 안타를 기록했습니다. DMSO를 포함한 동일한 대상에 대한 F2X 엔트리 스크린의 이전 캠페인에서 20개의 조회수가 발견되었습니다. 즉, DMSO가 생략된 경우 조회수의 75%를 식별할 수 있습니다.
실험의 성공을 위해, 결정은 절차의 모든 단계에서 적절하고 신중하게 처리되는 것이 중요합니다. 결정성 단편 스크리닝은 학계와 제약 산업에서 종종 적용되는 널리 사용되는 기술로 성숙해졌습니다.
개요
본 논문은 X-선 결정학을 통해 잠재적인 약물 후보 물질을 식별하는 방법인 결정학적 프래그먼트 스크리닝에 대해 다룹니다. 본 프로토콜은 자동화된 데이터 분석과 최적화된 시료 처리를 활용하여 실험의 효율성을 높이는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 결정학
- 신약 개발
- 생화학
배경
- 프래그먼트 스크리닝은 단백질에 결합할 수 있는 작은 유기 화합물을 식별하는 데 사용되는 기술입니다.
- 결과물의 품질은 시료 처리 및 결정화 기술에 크게 좌우됩니다.
- 이 방법은 생화학적으로 유의미한 다양한 단백질 표적에 적용할 수 있습니다.
- 성공적인 데이터 수집을 위해서는 결정의 적절한 취급이 매우 중요합니다.
연구 목적
- 결정학적 프래그먼트 스크리닝을 위한 상세 프로토콜을 제시합니다.
- 단백질 표면에서 프래그먼트의 결합 특성에 대한 통찰을 제공합니다.
- 구조 기반 리간드 설계를 위한 실험 결과의 효율성을 높입니다.
사용된 방법
- 침지 용액을 이용한 스크리닝 플레이트 준비.
- 단백질 결정의 스크리닝 웰로의 이동.
- 최적화된 조건 하에서의 결정 배양.
- 전용 소프트웨어를 이용한 데이터 수집 및 분석.
주요 결과
- DMSO가 없는 조건에서 AR 단백질 복합체에 대한 15개의 히트 화합물 확인.
- 이전 실험과의 비교를 통해 DMSO를 생략하더라도 여전히 유의미한 히트 화합물을 얻을 수 있음을 보여줌.
- 결정 형태의 가변성과 그것이 데이터 품질에 미치는 영향 입증.
결론
- 결정학적 단편 스크리닝은 약물 발견에서 가치 있는 기술입니다.
- 신뢰할 수 있는 데이터를 얻기 위해서는 결정의 세심한 취급이 필수적입니다.
- 본 프로토콜은 학계 및 산업계 연구자들에게 가이드로 활용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
결정학적 프래그먼트 스크리닝은 원자 수준의 해상도로 리간드 결합 모드를 조기에 식별할 수 있게 하여, 구조 기반 약물 발견에서 표적 검증과 리드 최적화를 지원합니다. HZB에서 제시하는 워크플로우는 자동화된 데이터 처리와 표준화된 결정 핸들링을 통합하여 프래그먼트 히트 발굴의 재현성과 처리량을 향상시킵니다. 이러한 접근 방식은 프래그먼트-단백질 상호작용에 대한 직접적인 구조적 통찰력을 제공함으로써 초기 발견 단계의 메커니즘적 불확실성을 줄여주며, 이후의 의약 화학 연구 진행 여부를 결정하는 데 유용한 정보를 제공합니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 프래그먼트 결합 부위의 직접적인 3D 시각화를 제공하여 타겟 가설의 메커니즘적 리스크 제거를 가능하게 함.
- 운영적 가치: 96종의 프래그먼트 라이브러리를 단백질 결정에 대해 신속하게 스크리닝하여 결합 부위의 가소성을 조사할 수 있도록 지원함.
- 예측적 가치: 강력한 결합제의 구조 기반 최적화를 위한 출발점이 되는 프래그먼트 히트를 식별함.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 파편의 점유율과 결합 형태를 확인하기 위해 정량적인 전자 밀도 맵을 제공합니다.
- 운영적 가치: 수백 개의 결정에 대한 자동화된 데이터 수집을 위해 방사광 가속기 빔라인의 로봇 장착 시료 교환 시스템을 활용합니다.
- 분석 준비도: 재현 가능한 회절 품질의 데이터를 보장하기 위해 표준화된 침지 및 급속 냉각 프로토콜을 적용합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개 연속성: CFS를 통해 확인된 프래그먼트 히트는 전임상 평가를 위해 약리학적 특성이 개선된 리드로 발전시킬 수 있습니다.
- 기전적 위험 감소: 프래그먼트 결합에서 얻은 구조적 데이터는 SAR 개발에 정보를 제공하며 리드 최적화 단계에서의 실패 위험을 줄여줍니다.
- 전임상 관련성: 프래그먼트 효율성 및 리간드 효율성 지표의 평가를 가능하게 하여, 개발 가능성이 유리한 케모타입의 우선순위를 정할 수 있습니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
CFS 워크플로우는 초기 발굴 연속체에 부합하며, 구조적 특성 분석을 통한 타겟 검증을 지원하고 프래그먼트 성장 또는 연결 전략을 통해 리드 화합물 식별을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 소분자가 관심 단백질 표적의 어디에 어떻게 결합하는지를 밝힘으로써 가설 검증을 용이하게 합니다.
- 스크리닝: 자동화된 결정 핸들링과 싱크로트론 기반 데이터 수집을 통해 프래그먼트 라이브러리의 병렬 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 분석: XDSAPP, fspipeline 및 PenDA를 통합하여 회절 데이터 세트로부터 자동화된 처리, 정밀화 및 히트 식별을 수행합니다.
- 중개 연구: 프래그먼트 최적화를 위한 원자 수준의 결합 모드를 제공하여 구조 기반 리간드 설계를 지원합니다.
- 기업적 재사용: 발견 포트폴리오 내의 여러 단백질 표적에 걸쳐 프래그먼트 스크리닝을 위한 표준화되고 재사용 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 결합 모드의 직접적인 실험적 증거를 통해 타겟-리간드 상호작용에 대한 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 결정 침지, 회수 및 저온 저장 절차를 통해 재현성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 의약 화학적으로 유리한 결합 상호작용을 가진 프래그먼트를 우선순위화함으로써 hit-to-lead 효율성을 개선합니다.
- 포트폴리오 영향: 프래그먼트 스크리닝 결과와 구조적 분석 가능성을 바탕으로 타겟의 위험 조정 우선순위 설정을 가능하게 합니다.
실행 시 고려 사항
- 단백질 결정화, 결정 처리 및 싱크로트론 기반 데이터 수집에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 고처리량 스크리닝을 위한 고휘도 빔라인 및 자동 시료 교환기 접근 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 프래그먼트 라이브러리 준비, 소킹 조건 및 데이터 분석 파이프라인을 위한 표준화된 프로토콜이 필수적입니다.
- 구조 생물학, 의약 화학 및 데이터 분석 그룹 간의 팀 간 협업이 수반됩니다.
- 스크리닝 조건 하에서 재현 가능하고 고품질의 결정을 얻고 유지할 수 있는 표적으로 제한됩니다.
