Name: 이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 배우세요 교모세포종 세포가 패턴 뉴런에서 이동하는 공동 배양 시스템을 통해 신경과학 및 암 생물학 연구를 수행하는 방법을. 이 기법은 재현성 높은 정량 분석과 임상 적용 가능성을 제공합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

이 작품은 Fondation ARC 2020, 리그 콘트르 르 암 (코미트 드 라 지롱드), ARTC, 계획 암 2021, INCA PLBIO에 의해 지원되었다. 알베올은 에이전시 내셔널 드 라 레체쉬 (그랜트 라벡스 브레인 ANR-10-LABX-43)에 의해 지원됩니다. 조리스 가이온은 툴루즈 대학 병원(추 툴루즈)의 펠로우십 수혜자입니다.

통보 된 서면 동의는 모든 환자로부터 얻어졌다 (지역 윤리위원회 규정에 따라, 노르웨이 베르겐, 하우켈랜드 병원에서). 이 프로토콜은 보르도 대학 인간 및 동물 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다. 임신 한 쥐는 보르도 대학의 동물 시설에서 보관및 치료되었다. E18 시간 임신 쥐의 안락사는 CO2를사용하여 수행되었다. 모든 동물 절차는 제도적 지침에 따라 수행되었으며 지역 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 모든 상용 제품은 재료 표에서참조됩니다.
1. 패턴 슬라이드의 준비
<ol><li>마이크로패터닝을 위한 기판 준비<ol>
<li>공기/플라즈마 활성화로 18mm 원형 유리 커버립을 5분 동안 처리합니다. 커버립을 1시간 동안 건조기(3-aminopropyl) 트리에톡시실레인100 μL로 닫힌 챔버에 놓습니다.</li>
		<li>100 mg/mL의 폴리(에틸렌 글리콜)-succinimidyl valerate(분자량 5,000(Peg-SVA)를 10mM 의 탄산완충제, pH > 8, 1h로 배양한다. 초순수물로 광범위하게 헹구고 화학 후드 아래에서 건조시다. 참고: 이 단계에서 는 샘플을 어두운 상태에서 4°C로 저장하여 추가 사용을 위해 할 수 있습니다.</li>
		<li>포산염 완충식식염수(PBS)에서 14.7 mg/mL에서 광시니티에이터, 4-벤조일벤질-트리메틸라모늄 염화물(PLPP)을 추가합니다. 참고: PLPP 젤인 PLPP의 농축 된 형태도 사용할 수 있습니다. PEG 브러시(100mJ/mm2)를저하시키는 데 필요한 자외선(UV) 조명 시간이 짧아지도록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>포토니티에이터 젤 증착<ol>
<li>PLPP 젤 3μL과 절대 에탄올 50 μL의 혼합물을 사용하여 슬라이드 중앙에 증착합니다. 절대 에탄올의 완전한 증발이 될 때까지 화학 후드 아래에 샘플을 놓습니다. 참고: 이 단계에서 는 샘플을 어두운 상태에서 4°C로 저장하여 추가 사용을 위해 할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>유리 슬라이드 마이크로 패터닝<ol>
<li>루딘 챔버에 커버슬립을 장착하고 자동 초점 시스템을 갖춘 현미경의 전동 단계에 놓습니다.</li>
		<li>구상된 마이크로패턴에 해당하는 이미지를 소프트웨어에 로드합니다. 복제 4 x 4회, 200 μm 간격, 1,000mJ/mm2의UV 용량 등 이러한 매개변수를 적용한다. 자동 UV 조명 서열 후 여러 PBS 세차처리로 PLPP를 헹구습니다. 참고: PLPP 젤을 사용한 경우, 탈이온화된 물로 광범위하게 세싱하여 제거하고N2의스트림에서 건조하고 4°C에 보관하십시오.</li>
		<li>라미닌(PBS의 50 μg/mL)을 30분 동안 배양합니다. PBS로 광범위하게 씻으시면 됩니다. 참고: 정제된 녹색 형광 단백질(GFP, PBS의 10 μg/mL)의 형광용액을 라미닌과 혼합하여 형광 현미경검사법에 의해 미세 패턴을 시각화할 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 공동 배양을위한 뉴런 및 GBM 세포의 준비
<ol><li>배아 쥐 해마 뉴런의 배양<ol>
<li>배아(E18) 쥐의 해마를 해부하고, 조직을 행크의 균형 잡힌 염액(HBSS)/1 mM 4-(2-하이드록세틸)-1-파이프라진에탄황포닉산(HEPES)/페니실린-스트렙토마이신 용액으로 15mL 튜브로 이송한다. 해마를 건조하지 않고 과도한 용액을 제거합니다.</li>
		<li>페니실린(10,000단위/mL)/연쇄절제술(10,000μg/mL)과 1mM HEPES로 보충된 트립신-에틸렌디아민 테트라아세틱산(EDTA)을 5mL, 37°C에서 15분 동안 배양한다. HBSS/HEPES/페니실린 연쇄 절제술용액으로 2x를 세척하고, 조직이 2-3분 동안 이 용액에 남아 있게 하십시오.</li>
		<li>각 조직별로 10배 위아래로 파이프를 피킹하여 발포를 최소화하는 두 개의 화염 광택 파스퇴파이펫을 사용하여 조직을 분리합니다. 세포를 계산하고 셀 서스펜션의 생존 가능성을 평가합니다. 아래에 표시된 것처럼 미세 패턴 커버립에 뉴런을 플레이트. 참고: 셀 생존율은 추출 후 85-90%입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마이크로 패턴 커버립에 뉴런을위한 세포 배양<ol>
<li>PBS로 마이크로 패턴 유리 슬라이드를 재수화하고 완전한 뉴런 세포 배양 배지를 배양합니다.</li>
		<li>E18 Sprague-Dawley 쥐로부터 얻은 해마 뉴런을 마이크로패턴 유리 커버슬립 위에 직접 심은 신경물질 배지(NBM)에서cm2당 50,000개의 세포가 3%의 말 혈청으로 농축되어 있습니다. 48h에 대한 인큐베이터 (37 °C, 5 % CO2)에마이크로 패턴 뉴런을 배치합니다. 참고 : ~ 6 시간 후, 1 차 해마 뉴런은 라미닌 미세 패턴을 준수 볼 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>뉴런에 인간 GBM 줄기 같이 세포의 공동 배양 참고: 이 연구를 위해, 멤브레인 GFP 양성 및 핵-토마토 환자 유래 GBM 세포는 이전 출판프로토콜(10)에따라 성장하였다.<ol>
<li>스페로이드 모양의 세포가 현탁액에서 증가함에 따라, 원심분리는 200 × g에서 5분 동안 현탁액을 분리한다. PBS의 5mL로 스페로이드를 세척하고 세포 해리 시약의 0.5 mL로 세포를 배양 (재료의 표참조) 37 °C에서 5 분 동안.</li>
		<li>완전한 NBM의 4.5 mL을 추가 (B27 보충으로 보완, 헤파린, 섬유 아세포 성장 인자 2, 페니실린, 및 연쇄 상혈구, 이전 설명 대로8),자동 계수 기술을 사용하여 세포를 계산.</li>
		<li>종자 1,000 GBM 세포는 3% 말 혈청으로 농축NBM에 있는 마이크로 패턴 뉴런 배양에. 플레이트를 37°C, 5% CO2및 95%의 습도로 배양합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 라이브 세포 이미징
<ol><li>GBM 세포 파종 직후, 온도 조절 챔버가 장착된 반전된 현미경의 단계에 샘플을 놓습니다. 소프트웨어에서 다차원 획득 툴박스를 사용하여 여러 위치를 기록하기 위한 전동 스테이지가 장착된 현미경에서 라이브 셀 이미징을 수행합니다. 온도(37°C) 및 가스 제어(5%CO2)환경에서 20배 의 목표로 12시간 동안 5분마다 밝은 필드 및 피불화 GFP/토마토 이미지를 획득합니다.</li>
</ol>4. 이미지 분석
참고: 피지를 사용하여 2차원(2D) 이미지 스택은 IJ1 매크로 어휘(그림2A)로작성된 수제 및 사용자 친화적인 도구(이 주소: https://github.com/Guyon-J/Coculture_Gliomas-Neurons/blob/main/README.md)를 사용하여 반자동으로 사전 처리되거나 처리되었습니다. 자동화된 워크플로및 프로시저는 그림 2B로요약됩니다.
<ol><li>신경망 분석(도 2Bi)<ol>
<li>스택의 이미지 하나를 선택합니다. 네트워크 도구를 마우스 오른쪽 으로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정(예: 임계값 = 삼각형, 리, 황..., 가우시안 블러및 중앙값 필터 = 1, 2, 3...)을 조정하여 정확한 이미지 세분화를 생성합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>네트워크 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 다음 절차를 자동으로 활성화합니다.<ol>
<li>선택한 이미지를 복제하고 세 가지 색상 채널(빨간색 회색-녹색)으로 분할합니다. </li>
			<li>회색 채널(브라이트필드)을 선택하고 대조 스트레치 향상(CSE)을 수행하여 서로 다른 영역 간의 분리를 향상시킵니다. Sobel Edge 검출기(SED)를 사용하여 찾기 가장자리 명령에서 이미 그룹화된 2D 신호 처리 컨볼루션 작업을 수행합니다.</li>
			<li>이중 필터링(F)의 경우 가우시안 블러 및 중앙값 필터를 적용하여 노이즈를 줄이고 물체 신호를 부드럽게 합니다. 적응된 임계값 알고리즘을 실행하여 검은색 픽셀(셀 영역) 및 흰색 픽셀(배경)이 있는 이진 그림(BIN-grey)을 얻어 마스크(CM)로 변환합니다. 작은 비네트워크 입자를 제거하여 셀 영역을 단순한 네트워크(NET) 및 필터 입자(EP)로 스켈레이트화합니다. </li>
			<li>적색 및 녹색 채널(핵 및 멤브레인)의 경우 이중 필터링을수행하고, 적응된 임계값을 사용하여 마스크로 변환하고, BIN-green이 입자 분석 명령을 사용하여 세포 형태를 결정할 수 있도록 합니다.</li>
			<li>관심 영역(ROI)을 OR(결합) 연산자와 병합하고 초기 색상을 간단한 RGB 이미지로 재조정합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>단세포 운동성 분석(도 2Bii)<ol>
<li>단일 셀 추적 도구를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정을 조정합니다(예: 트레일 유형 = 핵 또는 멤브레인, 임계값 = 삼각형, 리, 황..., Z 프로젝션 = 최대 강도, 합계 슬라이스..., 가우시안 블러 및 중앙필터 = 1, 2, 3.) 이미지의 정확한 세분화를 생성합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>단일 셀 추적 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 다음 절차를 자동으로 활성화합니다.<ol>
<li>회색 채널을 제거합니다. 스택에 Z 프로젝션을 적용하여 시간(T-스택)에 따라 이미지 스택에 해당하는 이미지를 생성합니다. 이중 필터를 사용하여 셀에 의해 남겨진 흔적을 마스크로 변환합니다. 작은 파티클을 BIN-빨간색/녹색 이미지로 제거합니다.</li>
			<li>ROI를 사용하여 셀 추적의 각 윤곽을 선택하고 옵션 대화 상자에서 상자 건너뛰기 가장자리 감지를 선택하여 후속 단계에 대한 이 전처리 단계를 건너뜁니다.</li>
			<li>
원래 스택에서 빨간색채널(트레일 유형 = 핵)을 분리합니다. 하나의 ROI를 선택하고 외부 영역을 제거합니다. 모든 이미지를 이중 으로 필터링하고 마스크(BIN-red)로 변환합니다. 각 비나화된 핵의 중심 X/Y 위치를 결정합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>스프레드시트소프트웨어(13)에이미 게시된 매크로를 사용하여 이 셀의 평균 정사각형 변위, 방향성 비율 및 평균 속도를 계산합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>다중 셀 추적 분석(그림 2Biii)<ol>
<li>추적 도구를 마우스 오른쪽 으로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정(예: 임계값 = 삼각형, 리, 황..., 가우시안 블러 및 중앙값 필터 = 1, 2, 3...)을 조정하여 정확한 이미지 세분화를 생성합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>추적 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 다음 절차를 자동으로 활성화합니다.<ol>
<li>회색 채널을 제거합니다.</li>
			<li>
빨간색 및 녹색 채널을 분할하고 이중 필터를사용하여 마스크로 변환합니다.</li>
			<li>이미지 계산기를사용하여 채널을 병합 ... AND 연산자와 명령하여 멤브레인에서 발견되는 핵 신호만 남깁니다. 참고 : 피지의 여러 플러그인은 동시에이 이진 사전 처리 된 이미지에서 여러 세포의 X / Y 위치를 결정하는 데 사용할 수 있습니다 (재료의 표참조).</li>
		</ol>
</li>
		<li>이전에 설명된매크로(13)를사용하여 궤적 플롯, 평균 정사각형 변위, 방향성 비율 및 이러한 셀의 평균 속도를 계산합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>신경 매트에 스페로이드 이동(그림 2Biv)<ol>
<li>마이그레이션 도구를 마우스 오른쪽 으로 클릭하여 해당 옵션 대화 상자를 열고 설정(예: 임계값 = 삼각형, 리, 황..., 가우시안 블러 및 중앙값 필터 = 1, 2, 3...)을 조정하여 정확한 이미지 세분화를 생성합니다. 그런 다음 확인을 클릭합니다.</li>
		<li>마이그레이션 도구를 왼쪽 단추로 클릭하여 다음 절차를 자동으로 활성화합니다.<ol>
<li>빨간색 채널을 제거합니다.</li>
			<li>
녹색 및 회색 채널을 분할합니다. </li>
			<li>회색 채널의 경우 뉴런 매트의 윤곽을 수동으로 그리고 해당 영역을 측정합니다.</li>
			<li>녹색 채널의 경우 스택을 두 번 필터링하고 마스크로 변환합니다. 패턴(BIN) 외부 영역을 제거하고 각 이미지에 대해 비나화된 셀 영역을 결정합니다. 참고: 위에서 설명한 매개 변수는 관심 아이콘을 왼쪽 클릭하여 값을 변경하여 보정됩니다. 이 처리는 수동으로 수행할 수 있습니다. 그러나 많은 수의 이미지(수집당 약 100개), 채널(일반적으로 3채널), 처리 단계의 경우 자동화또는 반자동 도구가 바람직할 수 있습니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Shergalis, A., Bankhead, A., Luesakul, U., Muangsin, N., Neamati, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+challenges+and+opportunities+in+treating+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Current challenges and opportunities in treating glioblastoma.</a> Pharmacology Reviews. 70, 412-445 (2018).</li>
<li>Scherer, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forms+of+growth+in+gliomas+and+their+practical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">The forms of growth in gliomas and their practical significance.</a> Brain. 63, 1-35 (1940).</li>
<li>Zagzag, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia-+and+vascular+endothelial+growth+factor-induced+stromal+cell-derived+factor-1%CE%B1%2FCXCR4+expression+in+glioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hypoxia- and vascular endothelial growth factor-induced stromal cell-derived factor-1α/CXCR4 expression in glioblastomas.</a> American Journal of Pathology. 173, 545-560 (2008).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasion+of+white+matter+tracts+by+glioma+stem+cells+is+regulated+by+a+NOTCH1-SOX2+positive-feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop.</a> Nature Neurosciences. 22, 91-105 (2019).</li>
<li>Venkataramani, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamatergic+synaptic+input+to+glioma+cells+drives+brain+tumour+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamatergic synaptic input to glioma cells drives brain tumour progression.</a> Nature. 573, 532-538 (2019).</li>
<li>Venkatesh, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+and+synaptic+integration+of+glioma+into+neural+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Electrical and synaptic integration of glioma into neural circuits.</a> Nature. 573, 539-545 (2019).</li>
<li>Boyé, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+CXCR3%2FLRP1+cross-talk+in+the+invasion+of+primary+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The role of CXCR3/LRP1 cross-talk in the invasion of primary brain tumors.</a> Nature Communications. 8, 1571(2017).</li>
<li>Daubon, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+complex+role+of+thrombospondin-1+in+glioblastoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Deciphering the complex role of thrombospondin-1 in glioblastoma development.</a> Nature Communications. 10, 1146(2019).</li>
<li>Gritsenko, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p120-catenin-dependent+collective+brain+infiltration+by+glioma+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p120-catenin-dependent collective brain infiltration by glioma cell networks.</a> Nature Cell Biology. 22, 97-107 (2020).</li>
<li>Guyon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+spheroid+model+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A 3D spheroid model for glioblastoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (158), (2020).</li>
<li>Strale, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiprotein+Printing+by+Light%3FInduced+Molecular+Adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Multiprotein Printing by Light?Induced Molecular Adsorption.</a> Advanced Materials. , (2015).</li>
<li>Rao, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+white+matter+tract+topography+using+core-shell+electrospun+nanofibers+to+examine+migration+of+malignant+brain+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Mimicking white matter tract topography using core-shell electrospun nanofibers to examine migration of malignant brain tumors.</a> Biomaterials. 34, 5181-5190 (2013).</li>
<li>Visweshwaran, S. P., Maritzen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+3D+cellular+chemotaxis+assay+and+analysis+workflow+suitable+for+a+wide+range+of+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">A simple 3D cellular chemotaxis assay and analysis workflow suitable for a wide range of migrating cells.</a> MethodsX. 6, 2807-2821 (2019).</li>
<li>Qian, H., Sheetz, M. P., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+particle+tracking.+Analysis+of+diffusion+and+flow+in+two-dimensional+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Single particle tracking. Analysis of diffusion and flow in two-dimensional systems.</a> Biophysics Journal. 60, 910-921 (1991).</li>
<li>Pasturel, A., Strale, P. -O., Studer, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailoring+common+hydrogels+into+3D+cell+culture+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Advance+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Tailoring common hydrogels into 3D cell culture templates.</a> Advance Healthcare Materials. 9, 2000519(2020).</li>
<li>Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+brain+in+a+dish%3A+the+promise+of+iPSC-derived+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons.</a> Cell. 145, 831-834 (2011).</li>
<li>Clark, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-cultures+with+stem+cell-derived+human+sensory+neurons+reveal+regulators+of+peripheral+myelination%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Co-cultures with stem cell-derived human sensory neurons reveal regulators of peripheral myelination.</a> Brain. 140, 898-913 (2017).</li>
<li>Linkous, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+patient-derived+glioblastoma+with+cerebral+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Modeling patient-derived glioblastoma with cerebral organoids.</a> Cell Reports. 26, 3203-3211 (2019).</li>
<li>Han, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interfering+with+long+non-coding+RNA+MIR22HG+processing+inhibits+glioblastoma+progression+through+suppression+of+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Interfering with long non-coding RNA MIR22HG processing inhibits glioblastoma progression through suppression of Wnt/β-catenin signalling.</a> Brain. 143, 512-530 (2020).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

교모세포종은 주변 혈관의 공동 옵션, 간질 침입 또는 WMTs18에대한 침략 : 다양한 모드를 사용하여 parenchyma를 광범위하게 침공한다. 이 후자의 모드는 WMT 침공과 관련된 생체 외 또는 생체 내 모델에 적합한 것을 찾는 데 어려움이 있기 때문에 문학에서 잘 특징지 지않습니다. 여기서, 배양된 설치류 뉴런이 라미닌 코팅 표면에 패턴화되고 형광 GBM 줄기와 같은 세포가 뉴런 위에 시드되는 단순화된 모델이 제안되었다. 이 연구에서는 종양 세포 부착, 침략 및 증식의 분석을 개선하기 위해 그리드 형상 패턴이 사용되었습니다. GBM 세포는 이러한 실험에서 라미닌이었던 매트릭스에서 직접보다 뉴런 의 상단에 더 효율적으로 마이그레이션. 셀 형상은 기록 과정 전반에 걸쳐 변경되고 셀 표면적이 동시에 증가했습니다. GBM 줄기 같이 세포는 특정 신호 통로 (즉, NOTCH2/SOX2)4 또는 분비된 요인 및 뉴런...

GBM을 포함하여 1 차적인 악성 gliomas는, GBM 환자를 위해 보고된 12 15 달의 중간 생존율로, 치명적인 종양입니다. 현재 치료는 방사선 요법과 결합된 큰 종양 질량 절제술 및 화학요법에 의존합니다, 이는 단지 몇 달까지 생존율을 연장합니다. 치료 실패는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통해 가난한 약물 전달과 밀접한 관련이 있으며, 경피 공간, 수막 및 WMTs1을따라 침습적인 성장과 관련이 있다. 혈관 공동 선택이라고도 불리는 혈관 침전은 잘 연구된 과정이며 분자 메커니즘이 해명되기 시작했습니다. 그러나, WM을 따라 GBM 세포 침공의 과정은 잘 이해되지 않습니다. 종양 세포는 Scherer의 이차 구조물2를따라 건강한 뇌로 이동합니다. 실제로, 거의 1세기 전, 한스-요아킴 셰러는 GBM의 침략적인 경로를 설명했는데, 이는 현재 복막 사텔리토시스, 각성 사텔리토증, 피증 확산 및 WMT(그림1A)를따라 침략하는 것으로 불린다.
기질 세포 유래 인자-1α(SDF1α) 및 C-X-C 모티프 케모키네 수용체 4(CXCR4)와 같은 일부 체모키네 및 그 수용체는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)가 아닌 WMT 침입3에연루된 것으로 보인다. 최근에는 세포간 NOTCH1-SOX2 축이 GBM 세포4의WMT 침입에 중요한 통로로 나타났다. 저자는 GBM 줄기 같이 세포가 GBM 세포에 의하여 myelinated 신경의 파괴를 건의하는 부분적으로 미켈린 신경에 두뇌 parenchyma를 침입하는 방법을 설명했습니다. 이정표는 3개의 기사가 자연 저널에 연속적으로 간행될 때 2019년에 도달했습니다, 신경교종 발달에 있는 전기 활동의 역할을밑줄5,6. Monje와 협력자들의 정액 작업은 신경교종 발달을 촉진하는 neuroligin-3의 분비에서 전기 활동의 중심 역할에 빛을 비추습니다.
윙클러와 협력자는 GBM 세포 사이의 연결을 설명 (마이크로 튜브) 침습적 인 단계에서 중요하고, 최근, 새로 설명 된 신경 교종 시냅스를 통해 GBM 세포와 뉴런 사이의 상호 작용. 이러한 구조는 종양 발달과 침입을 촉진하는 GBM 세포막에 위치한 α-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이삭사졸프로피오닉산(AMPA) 수용체의 글루타마테게틱 자극을 선호합니다. 종양 세포 침전은 GBM 환자에서 관찰된 바와 같이 전이 또는 먼 이차 포시의 보급에 있는 중앙 과정입니다. 여러 가지 요인이 혈전폰딘-1, 변형성장인자 베타(TGFβ-조절된 수반성 단백질, 또는 체모키네 수용체 CXCR3)7,8과같은 GBM침공에서중요한 것으로 확인되었다.
여기서, 단순화된 생체 mimetic 모델은 GBM 침공을 연구하기 위해 설명되어 왔으며, 여기서 뉴런은 라미닌의 트랙에 패턴화되고, GBM 세포는 단일 세포 또는 스페로이드(도1B)로시드된다. 두 가지 실험 설정은 GBM9,10,11에서관찰되는 뉴런에 대한 침략을 재구성하는 것을 목표로합니다. 이러한 모델은 과거에 기계적 또는 화학적특성을조절하여 세포 이동을 연구할 수 있는 정렬된 나노섬유 생체 재료(코어 쉘 전기방사)로 개발되었다. 이 문서에서 설명 된 공동 배양 모델은 GBM 세포가이 과정에 관련된 새로운 분자 경로를 정의하여 뉴런에서 탈출하는 방법을 더 잘 이해할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>(3-aminopropyl) triethoxysilane</td><td>시그마</td><td>440140-100ML</td><td>아미노기는 mPEG-SVA</td></tr><tr><td>96-well round-bottom plate</td><td>Sarstedt</td><td>2582624</td><td>spheroids</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Gibco</td><td>A11105-01</td>을 준비하는 데 사용됩니다. -<td>20°C에 저장; C (장기) 또는 4 &deg; C (단기), 구 해리 효소</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>12587</td><td>-20 &deg에 저장; C, 사용 전 해동</td></tr><tr><td>기본 섬유아세포 성장 인자</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>-20 &deg에 저장; C, 사용 전 해동</td></tr><tr><td>Countess Cell Counting ChamberSlides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td>세포 계수에 사용</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Marienfeld</td><td>111580</td><td>세포 배양 기질</td></tr><tr><td>Dessicator 카트리지</td><td>Sigma</td><td>Z363456-6EA</td><td>(3-aminopropyl) 트리에톡시실란 처리 중 mosture를 줄이는 데 사용</td></tr><tr><td>DPBS 10x</td><td>Pan Biotech</td><td>P04-53-500</td><td>4에 보관 &데그; C</td></tr><tr><td>Fiji 소프트웨어, MTrack2 매크로</td><td>ImageJ</td><td></td><td>사진을 분석하는 데 사용됨</td></tr><tr><td>Flask 75 cm&sup2;</td><td>Falcon</td><td>10497302</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigma</td><td>H8264-500ML</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 나트륨</td><td>Sigma</td><td>H3149-100KU</td><td>4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>Laminin</td><td></td><td>114956-81-9</td><td>뉴런 접착 촉진</td></tr><tr><td>Leonardo 소프트웨어</td><td></td><td></td><td>구상 된 마이크로 패턴의 로딩</td></tr><tr><td>MetaMorph 소프트웨어&nbsp;</td><td>Molecular Devices LLC</td><td>NA</td><td>현미경 자동화 소프트웨어</td></tr><tr><td>메틸셀룰로오스</td><td>시그마</td><td>M0512</td><td>2% 최종 농도를 위해 NBM에 희석</td></tr><tr><td>Neurobasal 배지</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>4°C에 보관; C</td></tr><tr><td>Nikon TiE (S Fluor, 20x/0.75 NA)</td><td></td><td></td> <td>전동 스테이지가 장착된 도립 현미경&nbsp;</td></tr><tr><td>페니실린 - 스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td> 4°C<td>에 보관; C</td></tr><tr><td>PLPP</td><td>Alveole</td><td>PLPPclassic_1ml</td><td>PEG 브러시 분해에 사용되는 광개시</td></tr>제 <tr><td>폴리(에틸렌 글리콜)-숙시니미딜 발레레이트(mPEG-SVA)</td><td>Laysan Bio</td><td>VA-PEG-VA-5000-5g</td><td>방오 코팅으로 사용</td></tr><tr><td>PRIMO</td><td>Alveole</td><td>PRIMO1</td><td>DMD(Digital micromirror device) 기반 UV 프로젝션 장치</td></tr><tr><td>Trypan blue 0.4%</td><td>ThermoFisher</td><td>T10282</td><td>세포 계수에 사용</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049-100ML</td><td>부착 세포 분리에 사용</td></tr></tbody></table>

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

교모세포종 (GBM), 학년 IV 악성 교모종, 때문에 그들의 공격적인 특성의 인간 암의 치명적인 유형 중 하나입니다. 이 종양의 유전학에 있는 중요한 어드밴스에 있는 중요한 어드밴스에 도 불구하고, GBM 세포가 건강한 두뇌 parenchyma를 침입하는 방법 잘 이해되지 않습니다. 특히, GBM 세포가 다른 경로를 통해 회고적 공간을 침범하는 것으로 나타났습니다. 이 논문의 주요 관심사는 백색 물질 지역(WMT)을 따라 가는 경로입니다. 회고신경세포 성분을 가진 종양 세포의 상호 작용은 잘 특징지 않다. 본명, GBM 세포 침략에 대한 뉴런의 영향을 평가하는 방법이 기재되어 있다. 이 논문은 뉴런에 GBM 줄기 와 같은 세포의 이동을 분석하여 WMT 침공을 모방 하는 체외 분석에서 고급 공동 배양 제시. 뉴런이 있는 GBM 셀의 동작은 오픈 소스 및 자유 액세스 소프트웨어와 함께 자동화된 추적 절차를 사용하여 모니터링됩니다. 이 방법은 많은 응용 프로그램에 유용하다, 특히, 기능 및 기계학 연구뿐만 아니라 뉴런에 GBM 세포 이동을 차단 할 수있는 약리학 에이전트의 효과를 분석하기위한.

형광 GBM 세포와 공동 배양패턴 뉴런은 프로토콜 섹션에 설명된 대로 제조되었고, 추적 실험이 수행되었다. GBM 세포는 뉴런에서 마이그레이션하는 동안 신속하게 모양을 수정(그림 1B: 패널 6 및 비디오 1). 세포는 무작위 운동(비디오 1)에서신경 확장을 따라 마이그레이션되었습니다. 형광GBM 세포 및 비형성 뉴런은 쉽게 구별될 수 있으며, 이는 프로토콜섹션(그림 2)에기재된 바와 같이 피지 매크로를 사용하여 세포 이동의 추적을 허용했다. 피지는 이미지 처리 및 분석을 용이하게 하는 개방형 라이센스 소프트웨어입니다. 수많은 이미지 의 분석에 상대적으로 시간이 많이 걸리는 수동 프로시저는 매크로에서 자동화할 수 있습니다. 이미지는 끌어오기 및 드롭 프로시저, 처리 및 정량화되어 ROI 관리자를 사용하여 사용할 수 있는 데이터를 생성...

여기서는 패턴 뉴런에서 교모세포종(GBM) 마이그레이션을 분석하기 위해 사용하기 쉬운 공동 배양 분석을 제시합니다. 우리는 뉴런에 GBM 세포 마이그레이션의 쉬운 정량화를 위한 FiJi 소프트웨어에 있는 매크로를 개발하고, 뉴런이 GBM 세포 침습 용량을 수정한다는 것을 관찰했습니다.

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...

교모세포종은 높은 침습적 인 프로필을 가진 파괴적인 뇌종양입니다. 이 공동 배양 시스템은 환자에서 관찰된 침략적인 경로 의 한을 recapituure하는 신경에 교모 세포 이주를 모방합니다. 공동 배양 모델의 형상과 구성은 정확하게 제어됩니다.그것은 더 나은 재현성을 용이하게하고 또한 복잡한 생물학적 과정의 간단한 정량화. 이 방법은 새로 해리된 교모세포종 세포 및 뉴런을 공동 배양하여 임상 진단에 적응할 수 있다. 그것은 임상 결과로 매우 중요한 임상 지수를 정의합니다.우리의 방법은 또한 섬유아세포 또는 면역 세포와 같은 그밖 이주세포를 정량화하기 위하여 이용될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 우리 팀의 박사 과정 학생인 조리스 가이온(Joris Guyon)이 될 것입니다. 마이크로패터닝용 기판을 만들기 위해 공기 또는 플라즈마 활성화로 18mm 원형 유리 커버립을 5분 동안 처리한 후 1시간 동안 트리에톡시실레인 100마이크로리터의 디시케이터에 커버립을 넣은 다음, 1시간 동안 페그-SVA 용액을 1밀리리터당 100밀리그램으로 배양합니다.겔 증착의 경우, 인큐베이션의 끝에 PLPP 3마이크로리터와 절대 에탄올 50 마이크로리터를 슬라이드 중앙에 넣고 완전히 건조될 때까지 기다립니다. 유리 슬라이드 마이크로패터닝의 경우, 루딘 챔버에 커버슬립을 장착하고 자동 초점 시스템이 장착된 현미경의 단계에 챔버를 놓습니다. 이미징 후 마이크로패턴 이미지를 소프트웨어에 로드합니다.자동 UV 조명 시퀀싱 후 파이펫을 사용하여 PBS로 커버슬립에서 PLPP를 광범위하게 세척합니다. 그런 다음 커버슬립을 라미닌 밀리리터당 50마이크로그램으로 30분 간 배양한 다음 PBS로 또 다른 세척을 시연합니다. 마이크로패턴 커버립에 배아 쥐 해마 뉴런 배양을 설정하려면, 마지막 세척 후, 신경 세포 배양 배지로 유리 슬라이드를 재수화한다.씨앗 5 회 10 신경 물질 배지에 매달린 네 번째 쥐 해마 뉴런은 37섭에서 5 %의 이산화탄소 인큐베이터에서 24 시간 배양에 각 마이크로 패턴 커버 슬립에 평방 센티미터 당 3 %의 말 세럼으로 농축. 원심분리기는 교모세포종 세포를 1, 000 RPM에서 5분 동안 해리시키고 교모세포종 세포 배양 배지에서 펠릿을 재중단한 다음, 마이크로패턴 뉴런을 통해 10번10을 제3GBM 세포에 증착한다. 세포의 살아있는 세포 화상 진찰을 위해, 37섭씨 온도 조절챔버를 갖춘 반전된 현미경의 단계에 공동 배

co-culture-glioblastoma-stem-like-cells-on-patterned-neurons-to-study

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

암 줄기 세포 이주를 조사하기위한 compartmentalizing 마이크로 유체 장치가 설명되어 있습니다. 이 소설 플랫폼은 가능한 세포 microenvironment를 생성 및 라이브 세포 운동의 미세 시각화 할 수 있습니다. 높은 운동성 암 세포는 잠재적으로보다 효과적인 미래의 치료로 이어지는 공격적인 침투 분자 메커니즘을 공부 절연되어 있습니다.

Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

이 비디오는 교모세포종 줄기 유사 세포가 종양 주위 공간의 뉴런을 타고 이동할 때 수초화된 신경관 침입을 모방한 미세 패턴의 뉴런에서 교모세포종 세포의 공동 배양 분석을 설명합니다. 이 분석은 신경교종의 뉴런에 대한 교모세포종 세포의 이동을 억제하는 약리학적 약물의 효과를 분석하는 데 도움이 될 수 있습니다.

패턴화된 뉴런에서 교모세포종 세포 공동 배양: 체외에서 쥐 해마 뉴런에서 교모세포종 세포의 이동을 모니터링하는 기술

암 세포와 뇌의 Organotypic 슬라이스 공 배양은 뇌 조직의 암 세포 침략의 과정에서 형광뿐만 아니라 시야 (비디오) 현미경으로 형태 학적 변화를 시각화 할 수 있습니다. 이 모델 시스템은 전지 교환 및 보충 접근이 가능하며 조작 및 분석의 다양한 제공합니다.

뇌의 Organotypic 슬라이스와 암 세포의 3 차원 회전 타원체와 공 배양 시스템

혈청이 없는 신경권 배지에서 해리된 고급 신경종 수술 용 시편을 전파하여 암 줄기 세포 표현형을 가진 세포를 선택한다. 신경구로 성장하지 못하는 표본의 경우 대체 프로토콜이 제안됩니다. 면역 세포화학을 위한 3D 신경구 아키텍처를 유지하기 위한 파라핀 임베딩 기술이 설명된다.

임상적으로 관련동물 모델 및 3D 면역화학에 사용하기 위한 외과 표본에서 고학년 신경교종 세포 배양의 최적화

glioblastoma (GBM)의 현재 ex vivo 모델은 생리 학적으로 인간 종양 침습 연구에 최적화되어 있지 않습니다. 여기, 우리는 신선한 인간 GBM 조직에서 organotypic 슬라이스 문화의 생성 및 유지를위한 프로토콜을 제시한다. 시간 경과 현미경 및 정량 세포 이동 분석 기술에 대한 설명이 제공됩니다.

종양 세포 이동 연구를위한 인간 Glioblastoma Organotypic Slice 문화 모델 및 항 침윤성 약물의 환자 특이 적 효과

암의 악성 행동을 이해하려면 종양 세포가 대식세포와 같은 종양 미세환경의 구성 요소와 어떻게 상호 작용하는지에 대한 정확한 모델을 만들어야 합니다. 여기에서는 교모세포종 세포와 종양 관련 대식세포 및 교모세포종 침입에 대한 영향을 평가하는 미세아교세포와의 상호 작용을 연구하는 두 가지 방법을 설명합니다.

공동 배양 시험 법은 아교 모세포종 침략의 대 식세포와 미세 아교 세포 자극을 공부하기

여기, 양적 측정 마이그레이션 및 시간이 지남에 조건 하에서 여러 치료 세포종 뇌 종양 줄기 세포의 내 습을 라이브 세포 이미징 기술을 설명 합니다.

라이브 셀 이미징 분석 실험 연구 세포종 뇌 종양 줄기 세포 이동과 내 습을

여기서 우리는 인간 신경교종 세포(hGC) 이동을 실시간으로 연구하기 위한 전 생체내 혼합 단층 배양 시스템을 제시한다. 이 모형은 구획화된 약실 내의 hGCs와 myelinated 및 비 myelinated 축색둘다 사이 상호 작용을 관찰하는 기능을 제공합니다.

등쪽 뿌리 신경절 축삭-올리고젠드로시트 공동 배양에 대한 인간 신경교종 세포 이동의 실시간 모니터링

여기에서는 교모세포종에 대한 사용하기 쉬운 침략 분석방법을 설명합니다. 이 분석은 교모세포종 줄기 와 같은 세포에 적합합니다. 침략, 마이그레이션 및 확산의 쉬운 정량화를 위한 피지 매크로도 설명되어 있습니다.

교모세포종을 위한 3D 스페로이드 모형

우리는 새로 진단되고 재발한 종양에서 생성된 환자 유도 자기 교모세포를 이용한 3D 교모세포종 이동 모델을 제시합니다. 이 플랫폼은 환자별 이동 역학을 시각화하고 치료 효과 평가를 가능하게 합니다. 이 분석법은 이동 후 다중화되어 단백질 위치와 발현 패턴을 평가할 수 있습니다.

저산소 조건에서 자기 나노입자를 이용한 구형 위치 측정을 이용한 재현 가능한 3D 교모세포종 이동 검사

배우세요 교모세포종 세포가 패턴 뉴런에서 이동하는 공동 배양 시스템을 통해 신경과학 및 암 생물학 연구를 수행하는 방법을. 이 기법은 재현성 높은 정량 분석과 임상 적용 가능성을 제공합니다.

이동 및 세포 상호 작용을 연구하기 위해 패턴 뉴런에 교모 세포 종 줄기 와 같은 세포의 공동 배양

더 많은 동영상 탐색