Name: 현장 기반 열 생리학 분석: 주변 조건에서 감기 충격 회복 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
Description: 학습하세요 나비의 냉충격 회복을 평가하는 저비용 현장 생리학 프로토콜을. 얼음물 노출 후 회복 시간을 측정하여 환경 요인이 생리적 반응에 미치는 영향을 밝히고, 다양한 종 간 특성 비교가 가능합니다.

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자렛 다니엘스, 이사벨라 플러머, 브렛 셰프퍼스, 댄 한 덕분에 프로토콜에 대한 입력이 처음 개발되었습니다. 제이미 하가드, 세바스티안 듀란, 인디애나 크리스토발 로이스-말라버에게 이 프로토콜의 여러 반복을 구현하고 주요 구성 요소에 대한 의견을 전해 준 것에 대해 추가감사를 표합니다. 원고 전체에 대한 피드백에 대한 익명의 검토자에게도 감사드립니다. 지원은 Lepidoptera 및 생물 다양성의 간행 기금에 대한 맥과이어 센터, 농업 및 생명 과학 대학, 천연 자원 및 환경 학교, UF의 야생 동물 생태 및 보존 부서에 의해 제공되었다.

1. 관심종의 식별
<ol><li>차가운 충격 복구 시간을 결정하기 위해 관심 종을 식별합니다. 각 그룹은 냉각 혼수 상태를 유도하는 데 걸리는 시간이 다를 때(즉, 곤충이 아직 살아 있지만 움직이지 않고 반응하지 않음). 마찬가지로, 유기체 및 데이터의 사용에 기초하여, 초점이 비행하지 않는 경우 실험을 중지하는 다른 차단 점을 선택 (섹션 4 참조). 참고: 이 프로토콜은 Lepidoptera에서 사용하기 위해 설계 및 개발되었습니다. 그러나, 큰, 휘발성, 육상 곤충, 특히, 운동과 손상을 제한하는 유리 봉투에 평평하게 보관할 수 있는 곤충(예: 나비와 잠자리/담셀프)에 적용됩니다.</li>
</ol>2. 예심 실시
<ol><li>주요 매개 변수를 결정하기 위해 개인의 작은 샘플에 예심을 수행합니다. 아래 프로토콜의 섹션 3에서 5까지 5-10 명의 개인이 예심을 수행하십시오.<ol>
<li>얼음에 필요한 시간을 테스트하여 차가운 혼수상태를 유도(움직이지 않음),하지만 30분, 60분, 90분의 치료를 사용하여 5.1단계를 따라 초점 종을 죽이지 않는다. 참고: 냉각 혼수를 유도하는 데 필요한 시간은 개인의 크기, 위치 및 자연사/행동에 따라 달라집니다.</li>
		<li>4.1-4.4단계의 결과와 초점 곤충의 생태에 대한 지식을 사용하여 주어진 개인이 완전한 회복을 하지 않으면 재판을 마무리할 시간을 선택하십시오. 이 시간뿐만 아니라 종의 생태에 기본 차단, 비행할 수없는 많은 분 후, 많은 곤충이 선행되는 것을 명심유지. 참고: 예를 들어 대부분의 예비 시험이 15분 후에 비행으로 끝나면 이상치가 완전히 복구할 수 있도록 25분 후에 시험을 종료하기로 결정할 수 있습니다(예: 비행). 이 프로토콜은 30분 의 컷오프 시간(단계 5.4)을 기반으로 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>예심 전 데이터의 매개 변수를 사용하여 실험에 대한 데이터 수집을 알립니다. 얼음 슬러리에서의 시간, 끝까지 시험을 호출하는 시간 및 데이터 시트에 문서화 된 동작 (예를 들어, 떨림은 선택의 곤충에 대한 부적절한 행동일 수 있음)을 포함하여 초점 유기체의 요구에 따라 아래에 설명 된 프로토콜을 수정합니다.<ol>
<li>매개 변수를 구체화하는 동안 이러한 데이터로 답변할 특정 연구 질문을 정의합니다. 참고: 예를 들어, 연구원이 회복에 장기간 노출되는 효과에 관심이 있다면 얼음의 시간은 수정해야 할 주요 변수입니다. 연구원이 빛과 어두운 색깔의 종 사이 생리학에 있는 다름에 관심이 있는 경우에, 그(것)들은 두 개의 명백하게 색깔한 종 중 하나를 선택하거나 복구 시간에 날개 색깔의 효력을 측정하기 위하여 곤충의 날개 색깔을 수정할 수 있습니다. 중요한 것은,이 방법은 제기 된 요구 사항 및 연구 질문에 매우 사용자 정의 할 수 있습니다 (토론 섹션 참조).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 곤충 의 수집
<ol><li>미끼 트랩및 곤충망 과 같은 적절한 방법을 사용하여 곤충을수집합니다(보충도 도 1). 컬렉션이 완료되면 각 개인을 고유한 ID가 있는 별도의 유리 봉투에 놓습니다.</li>
	<li>동물을 포착한 후 차가운 충격 실험에 노출되기 전에 그늘진 시원한 장소에 보관하십시오. 항상 캡처되는 24 시간 이내에 실험 치료에 동물을 노출하고, 시험을 통해 가능한 한이 시간을 표준화.<ol>
<li>보관 조건은 다를 수 있지만 곤충을 직접 태양에서 제외하십시오. 가능하면 시원하고 어두운 방에 실내에 배치하십시오.</li>
		<li>현장에서는 보관하는 동안 그늘을 차려입고 바람(불고)과 봉투에 들어갈 수 있는 다른 곤충 포식자로부터 보호되는지 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 차가운 충격 실험 설정
<ol><li>얼음과 물로 쿨러를 채웁니다. 적어도 1시간 동안 지속하기에 충분한 얼음이 있는지 확인하고, 0°C에서 물 속에서 환경을 유지하기 위해 필요에 따라 주기적으로 얼음을 추가하십시오.</li>
	<li>실험의 라운드를 위해 1과 4 초점 개인 사이에서 선택, 각 개인이 식별 할 수 있는지 확인.<ol>
<li>여러 종을 사용하는 경우 데이터 시트에서 혼동하는 개인을 피하기 위해 각 종 중 하나만 사용하십시오. 하나의 종만 실험하는 경우, 깨진 날개 또는 뚜렷한 표시로 쉽게 구별 할 수있는 개인만 사용합니다.</li>
		<li>실험의 목표가 날개 색채와 관련이 없는 경우, 개인을 구별하기 위해 미세펠트 팁 마커로 독특한 ID(예: 숫자)로 날개를 표시합니다.</li>
		<li>실험이 위의 기준을 충족하지 않으면 한 번에 한 개인에 대한 실험을 수행합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>고유한 ID및 종명 또는구별문자(보충표 1)와같은 노트에 유용한 식별자를 포함하는 각 곤충에 관련된 정보와 데이터 시트의 행을 채웁니다.</li>
	<li>모든 초점 개인 (여전히 개별적으로 표시된 봉투에) 무게(재료의 표)와밀봉 된 비닐 봉지에 놓고 60 분 동안 얼음 물에 가방을 놓고 (또는 차가운 혼수 상태에 의해 유도 될 때까지; 토론을 참조)(보충 그림 2).<ol>
<li>무게가 무겁고(예: 큰 동전, 큰 와셔 또는 매끄러운 바위)가 얼음 물에 잠겨 물 표면에 수직으로 곤충 가방을 보관할 수 있을 만큼 충분히 커지도록 하십시오. 밀봉 된 비닐 봉지에 누출을 일으키지 않는 무게를 사용합니다. 참고: 곤충이 물에 잠긴 상태에서 물에 직접 노출되면 여전히 복구할 수 있지만 젖은 봉투는 각 개인의 제거를 복잡하게 만듭니다. 곤충을 가방에 말리는 것이 가장 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>온도 및 라이트 데이터를 기록합니다.<ol>
<li>데이터 로거(재료 표참조)를 사용하여 5.1 또는 5.2 단계를 사용하여 주변 온도 및 광 데이터를 기록합니다.<ol>
<li>데이터 로거를 프로그래밍하여 곤충이 방출될 때까지 시작하여 온도 및 광 데이터를 10s 간격으로 수집합니다.</li>
			<li>곤충이 얼음 물에 넣었을 때 데이터 로거의 시작 시간을 기준으로 합니다. 데이터 로거 정보(날짜, 시간)가 동기화되어 주변 조건에 대한 데이터가 나중에 각 개별 초점 곤충과 일치할 수 있도록 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>간단한 온도계를 사용하여 온도 및 광 데이터를 짧은 간격으로(두 번째 연구원)에 기록합니다.<ol>
<li>데이터 로거 없이 측정할 수 있는 복구 시간과 연관할 실험 매개 변수를 결정합니다. 독특한 트리트먼트를 사용하세요: 그늘/태양; 황혼 / 정오.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>곤충을 위한 메쉬 케이지를 적절한 위치에 배치하여 온도와 조명 환경이 케이지 내에서 가능한 한 균일하고 케이지의 베이스가 상승하여 관찰자에 의해 탭될 수 있도록 합니다.</li>
	<li>데이터 로거를 케이지 바깥이나 케이지 내부에 배치하여 케이지 내부의 작은 움직임에 의해 넘어지거나 영향을 받지 않도록 합니다. 데이터 로거를 사용하지 않는 경우 온도계를 적절히 배치하거나 적절한 구성으로 케이지를 설정합니다. 참고: 기록된 주변 조건이 곤충이 경험하는 조건에 최대한 가깝게 되도록 데이터 로거를 배치해야 합니다.</li>
</ol>5. 콜드 쇼크 실험 시작
<ol><li>60 분 후에 얼음 수조에서 동물을 제거하십시오 (또는 적절한 것으로 결정된 시간; 위 참조). 즉시 비닐 봉지에서 곤충을 제거하고 취급을 최소화하면서 가능한 한 빨리 봉투에서 각 개인을 제거합니다(보충 도 3).</li>
	<li>동물이 메시 케이지에 있는 즉시 스톱워치를 시작합니다(예제 데이터, 보충 표 1참조).</li>
	<li>복구 곤충을 동요하는 연필로 케이지의 기초를 누릅니다. 참고: 회복 중에 자극을 제공하면 초점 곤충이 생리적으로 가능한 즉시 회복 상태와 행동을 입증할 수있습니다(보충 비디오).<ol>
<li>동물이 가능하면 반응할 수 있도록 자주 강하게 탭하지만 응답을 유발하지는 않습니다. 참고 : 예를 들어, 케이지를 두드리는 경우, 동물이 공중으로 발사되어 똑바로 착륙하지만, 그 자체로 서 이동하지 않는 경우, 그 유기체가 실제로 자체적으로 서 있지 않았기 때문에 "스탠드"행동으로 간주되지 않습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>개인이 비행한 후 재판을 완료한 것으로 표시합니다(예: 전체 복구 표시). 시험을 종료하고 30 분 후에 움직이지 않으면 곤충이 완전한 회복을 달성했다고 고려하십시오.</li>
	<li>메쉬 케이지에서 곤충을 제거하고 개인을 라벨이 붙은 유리 봉투에 다시 넣습니다. 동물을 해방하거나 추가 데이터 수집을 위해 동물을 유지하십시오 (예 : 크기, 무게의 개별 특성).</li>
	<li>데이터 로거를 사용하는 경우 데이터 로거 데이터 수집을 중지하고 실험 중에 온도 및 라이트 데이터 파일을 적절한 날짜/시간 정보로 저장합니다.</li>
</ol>6. 데이터 처리
<ol><li>데이터 시트에서 나온 데이터를 스프레드시트(예: MS Excel)에 입력합니다.</li>
	<li>데이터 로거를 사용하는 경우 분석된 각 개별 의 각 응답에 온도 및 라이트 데이터를 추가합니다.<ol>
<li>각 개인의 각 동작에 대해 온도와 빛의 평균 및 표준 편차를 계산합니다. 참고: 데이터 로거가 10초마다 데이터를 기록할 때 한 동물의 스탠드 동작이 48s가 발생하면 해당 평가판에 대한 데이터 로거에서 처음 5개의 항목을 사용하십시오.</li>
		<li>각 개인의 각 복구 동작을 데이터 로거가 기록한 무생물 데이터와 연결하고 필요에 따라 10개의 간격을 반올림합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>데이터를 플롯하고 분석합니다. 그림 1은예를 들어, 온도와 빛의 효과를 차가운 충격 복구 시간에 시각화합니다. 다른 관련 데이터(종 특성, 지역 서식지 특성)를 컴파일하여 테스트된 그룹의 생리적 특성에 있는 생태학적 및 진화적 패턴을 조사합니다. 참고: 그림 1은 R의 ggplot2 패키지를 사용하여 플롯되었습니다. 주변 조건에 대한 데이터의 세부 수준은 주변 조건을 측정하는 데 사용되는 계측기를 기반으로 다릅니다. 데이터 로거를 사용하는 경우 그림 2와 유사한 세부 정보가 있는 수치를 생성할 수 있습니다. 온도계를 사용하는 경우 연구원은 주변 광에 의해 통보 된 플롯을 만들 수 없습니다. 마찬가지로 연구원이 빛 또는 온도 범주를 사용하는 경우 이러한 산란플롯을 상자플롯 또는 다른 적절한 템플릿으로 수정하여 이러한 현상을 설명할 수 있습니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이나 기타 이해 상충이 없습니다.

열 생리학의 연구는 생존과 적합성의 핵심인 유기체와 그 주변 의 상호 작용을 더 잘 이해하기 위해 종과 환경 적 특성의 측정을 통합합니다. 식물과 동물의 자연사와 생태를 이해하는 데 항상 필수적이지만, 열 특성은 풍경과 기후 변화에 직면하여 중요성이 증가하고 있습니다11,21. 특히, lepidoptera와 오도나탄의 몇몇 그룹은 상대적으로 크고 풍부하며 뚜렷한 행동을 나타내며 조작할 수 있습니다. 여기에 설명된 것은 이러한 곤충의 생리적 반응을 효과적으로 측정하는 효율적이고 저렴한 분석입니다. 이 프로토콜은 실험 전에 처리 시간이 제한되어 있는 분석에 건강한 유기체의 근원을 요구합니다. 한 번에 분석된 유기체의 수에 유연하지만, 실험당 초점 개인의 수는 데이터 수집 및/또는 관찰자 수의 목적에 따라 달라집니다.
예를 들어, 이 프로토콜은 전체 커뮤니티에서 나비에 대한 자세한 개별 데이터를 수집하기 위해 개발되었습니다. 이와 같이, 대표적인 결과는 가능한 한 많은 종의 개인을 위한 데이터 수집을 극대화하고 지역 환경과 관련된 다양한 조건하에서 데이터를 수집하기 위한 노력을 보여 준다. 초점 종의 수에 관계없이 관찰자가 회복을 경험하는 케이지의 각 개인을 식별 할 수 있어야합니다. 목표는 하나의 종에서 데이터를 수집하는 경우, 다음 하나 또는 두 개의 개인 (다른 날개 마모에 따라 식별 할 수있는 경우 또는 개별적으로 표시 하는 경우) 한 번에 분석 한다. 연구 과목은 특정 연구 질문이나 연구 계획에 따라 선택되어야합니다. 제기 된 질문과 데이터 수집의 목적 (예 : 연구 또는 교실)에 따라 샘플 크기와 다른 특성의 수집이 다를 수 있습니다.
이 프로토콜 (냉각 혼수 상태의 유도, 회복 단계, 주변 조건의 역할)에 의해 설명 된 생리학의 기본 구성 요소를 설명하기 위해, 교실 강사는 하나의 종의 두 가지 별개의 종 또는 모프를 선택할 수 있습니다. 초점 개인이 하나의 주요 특성 (예를 들어, 색상)에서만 다른 경우, 더 작은 샘플 크기가 필요하며, 학생들은 밀접하게 그 특성과 유기 체 생리학의 관계를 연구 할 수 있습니다. 생태 생리학에 관심이 있는 연구원은 복잡한 생태학적 및 진화적 질문을 탐구하기 위해 실험 데이터를 사용할 수 있습니다. 연구원은 신중하게 자신의 질문을 해결하는 초점 곤충을 선택해야합니다 (예를 들어, 생활 단계에 따라, 나이, 섹스, 위치), 관련된 변수의 수에 따라, 적절한 샘플 크기를 결정. 복잡한 모델에 대한 샘플 크기는 위에서 설명한 샘플 크기보다 큽습니다. 
행동 복구 데이터를 수집하는 동안 관찰자가 케이지 의 바닥을 탭하여 복구 동작을 유도할 수 있어야 하기 때문에 케이지가 지면 위에 놓여 있는 것이 중요합니다. 이것은 유기체가 생리적으로 그렇게 할 수 있는 즉시 (스탠드, 파리)에 반응하고, 말단 복구 행동 (비행)이 문서화된다는 것을 보장합니다. 이 프로토콜은 유기체 생리학에서 환경의 역할을 연구하고 분열하도록 설계되었기 때문에 감기 충격 회복 중에 주변 상태를 기록하는 것은 열 생리학 연구에 필수적입니다. 데이터 로거(재료 표참조)는 관련 조건(예: 온도, 빛 및 습도)의 표준화된 측정값을 기록하는 데 유용합니다. 그러나 이러한 도구를 사용할 수 없는 경우 디지털 온도계와 같은 다른 방법으로 또는 환경 조건의 변수를 단순화하고 그늘및 태양과 같은 고유한 환경을 사용하여 관련 조건을 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 연구 결과의 목적 그리고 범위에 근거를 둔 감기 충격 복구 도중 조건을 측정하는 연구원 선택권을 줍니다.
이 방법은 특정 분류학 그룹에 더 잘 맞게 수정 할 수 있지만, 큰, 관능성 곤충을 사용하는 것이 좋습니다. 독립적으로 비행하는 능력을 되찾는 비행 곤충은 완전한 회복을 성취한 것으로 간주될 수 있습니다. 설명된 바와 같이 이 방법은 열대와 열대 지방의 나비에 성공적으로 사용되었습니다. 주어진 영역의 열 동향(즉, 고도, 위도, 캐노피 커버에 따라 기대에 영향을 미치는 부위에서 경험되는 온도 의 범위)에 기초하여, 유기체는 차가운 혼수 상태에 들어가기 위해 얼음 물 욕조에서 1 시간 미만이 필요할 수 있습니다. 유기체의 크기는 또한 차가운 혼수 상태에 들어가는 데 필요한 시간에 영향을 미칠 수 있습니다. 차가운 혼수 상태를 유도하는 데 필요한 차가운 노출 시간을 찾는 것이 중요하지만 초점 종을 죽이지 않습니다. 차가운 혼수 상태를 유도하는 데 필요한 시간은 개인의 크기, 위치 및 자연사 / 행동에 따라 달라집니다. 본 명세서에 기재된 감기 충격 실험의 결과와 초점 곤충의 생태에 대한 지식을 사용하여, 주어진 개인이 완전한 회복을 하지 않으면 재판을 마무리할 시간을 선택한다. 
연구원의 특정 질문에 기초하여,이 방법은 각각 중요한 변수에 대한 자연 환경 변화와 제어를 모두 허용하기 위해 필드 또는 실험실에서 사용할 수 있습니다. 이 분석법은 간단하고 저렴하며 열 생리학 분야의 기존 격차를 메우는 데 도움이됩니다. 이 프로토콜의 용이성으로 다양한 종류의 택시를 사용할 수 있게 되어 실험실 친화적인 유기체 이상으로 필드를 열어줍니다. 표준화된 주변 열 분석기의 참신함은 실험실과 현장결과(22)사이의 격차를 채웁니다. 유기체 회복을 위한 주변 조건을 활용하면 연구자들이 생리학14,22에서환경 및 종 요인의 역할을 분할하는 데 도움이 될 것이다. 마지막으로, 저렴한 비용과 필요한 재료의 부족으로 인해이 프로토콜은 많은 현장 생물학자뿐만 아니라 교실에서 어린 학생들이 실습 학습 경험을 할 수 있도록 장비가 거의없는 현장의 원격 위치에서 사용할 수 있습니다.

1970년대 후반과 1980년대 초에 열생리학과 생태학의통합은생태생리학 분야를시작했습니다. ectotherm에 실시 된 광범위한 열 연구는 다양한 생태 진화 문맥3,4,5에걸쳐 생태 학적 - 생리적 시너지 효과를 강조한다. ectothermic 유기체의 열 생리학에 대한 연구는 최근 기후 변화와 전 세계 에 걸쳐 변경 된 열 풍경의 얼굴에 관심을 회복하고있다6,7. 생태 생리학의 학문적 분야에서 연구를 알리는 것 외에도 열 생리학 연구는 연구원에게 광범위하게 접근 할 수 있으며 모든 수준에 대한 실습 교육 접근법으로 작용할 수 있습니다. 열 한계 및 온도 충격의 효과를 포함한 열 성능의 구성 요소는 동물의 생태, 행동 및 생명력 의 기본8,9.
특히, 내분은 주변 온도와 유기체 온도 사이의 불가분의 연결을 지시하기 때문에, ecototherms는 생리학의 질문을 해결하기 위해 사용됩니다. 유기체가 견딜 수 있는 온도 범위(최대 열 범위까지의 중요한 열 최소) 및 행동과 체력이 최대화되는 온도(열 최적화)는 종종 생태학적 및 진화 적 과정에 뿌리를 두고 있습니다. 이러한 생리적 특성은 기온, 수단과 극단 모두10을증가시키고 있기 때문에 중요성이 증가하고 있습니다. 예를 들어, 온도 상승을 포함한 비생물적 변화는 서식지 파괴 및 단편화를 동반하여 항문항을 포함한 동체공동체에 영향을 미쳤으며, 생리학적으로 취약한 종(열내성이 좁은)을 작은 잔재 서식지패치(11,12)로제한한다.
열 성능의 주요 구성 요소를 평가하는 것은 시간과 자원 면에서 비용이 많이 들 수 있으며 전통적으로 실험실 장비와 표준화된 조건이 필요합니다. 더욱이, 종래의 소심은 종종 주어진 동물에 의해 자연에서 경험되는 주변 조건의 폭을 반영하지 않습니다13 유사한 생리 실험의 온도는 신중하게 제어되고 종종 동물이 경험하는 주변 조건과 관련이 없습니다. 이러한 온도 조절은 개별 응답2,14의변화에 대한 이해를 감소시킬 수 있다. 생리학자들은 실험실 기반의 난방 및 냉방 실험에 의존하여 프로그래밍 가능한 수조를 사용하여 동물의 환경을 꾸준히 가열하거나 냉각하여 열 성능 곡선15를알려줍니다.
일반적으로 동물은 열전대와 바이알에 배치되며 주변 수조의 온도를 조절하여 주변 온도가 꾸준히 변경됩니다. 연구원은 변경된 생리 상태를 달성하는 데 걸리는 시간을 측정 (예를 들어, 차가운 혼수 상태, 녹다운) 상태 변화가 발생한 온도16,17. 최소 미화 500달러부터 이러한 도구는 크고 무겁며 추가 기술 장비(예: 컴퓨터, 열전대)가 필요합니다. 따라서 열 성능을 평가하는 고전적인 방법을 수행하는 기본 도구는 1) 모든 사람에게 경제적으로 접근 할 수 없으며, 2) 작은 딥테리언에 사용되는 관습 용 유리병에 포함될 너무 큰 동물을 속이는 데 적합하지 않으며, 3) 원격 필드 설정에서 사용하기 위해 휴대용이 아닙니다. 일반적인 관행에 대한 준수는 분류 및 실험 조건18,19,20에걸쳐 제한된 표현을 초래했다.
완전한 열 성능 곡선은 종 분포, 생명 기록 특성 및 동작을 다른 특성 중에서도 알릴 수 있지만, 더 적고 간단한 열 메트릭의 정량화는 더 효율적이고 여전히 매우 유익할 수 있습니다. 생리학적 assays, 측정 냉각 혼수 상태 및 후속 감기 충격 복구, 냉경화 및 올바른 행동, 유기체8의임계 열 최소에 대한 효과적이고 실행 가능한 프록시입니다. 여기에 설명된 감기 충격 분석은 대형 육상 곤충으로부터 생리학적 데이터를 유도하는 데 유용하다. 분석은 현장 조건이나 교실에서 저렴하고 접근 가능하며 실행이 쉽습니다. 이 프로토콜에 의해 생성 된 감기 충격 복구에 대한 데이터는 생태 생리학 및 / 또는 생리 원리에 대해 학생들을 가르치는 데 사용되는 종 또는 개별 수준의 특성 데이터와 결합 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>24 x 24 x 36" 팝업 사육 및 관찰 케이지</td><td>Bioquip</td><td>1466PB</td><td>실험 중에 케이지 바닥을 두드릴 수 있도록 케이지가 지면에서 약간 올라와 있는지 확인하십시오.</td></tr><tr><td>냉각기</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>글라신지 봉투</td><td>Bioquip</td><td>1130B</td><td></td></tr><tr><td>HOBO 펜던트 온도/조명 8K 데이터 로거</td><td>시작</td><td>UA-002-08</td><td>데이터 로거에 액세스할 수 없는 경우 연구원은 디지털 온도계를 사용하여 일정한 간격으로 주변 온도를 기록하도록 선택할 수 있습니다. 자세한 내용은 프로토콜 단계 4.5를 참조하십시오.</td></tr><tr><td>HOBO 광학 USB 기지국</td><td>Onset</td><td>Base-U-1</td><td></td></tr><tr><td>얼음물</td><td>NA</td><td>NA 곤충</td><td></td></tr><tr><td>(초점 분류군)</td><td>NA</td><td>Any</td><td>테스트를 위한 충분한 샘플 수집, 실험 그룹의 복제 보장(예: 종, 샘플링 위치)</td></tr><tr><td>PVC T-조인트</td><td>모든</td><td>밀봉</td><td></td></tr><tr><td>가능한 비닐 봉지</td><td>Any</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>스톱워치/타이머</td><td>모든</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>무게</td><td>모든</td><td>NA</td><td>비닐 봉지의 무게를 줄이기 위한 큰 동전이나 작은 돌은 표본이 얼음물에 잠길 수 있도록 합니다. 표준화된 중량이 이상적입니다.</td></tr></tbody></table>

현장 기반 열 생리학 분석: 주변 조건에서 감기 충격 회복

Field-Based Thermal Physiology Assay: Cold Shock Recovery under Ambient Conditions

생태 생리학, 특히 동종요법의 생태 생리학은 생물과 주변 환경 간의 상호 작용을 탐구하여 생존과 적합성을 더 잘 이해하기 위해 종과 환경 적 특성의 척도를 사용하므로 변화하는 세계에서 점점 더 중요합니다. 전통적인 열 해석은 시간, 비용 및 장비 측면에서 비용이 많이 들기 때문에 종종 작은 샘플 크기와 몇 종으로 제한됩니다. 여기에 소개된 나비의 예를 사용하여 크고, 휘발성, 육상 곤충의 개별 적인 행동 및 생리학에 대한 상세한 데이터를 생성하는 새로운 프로토콜이 있습니다. 이 논문은 주변 환경 조건하에서 현장에서 수행 할 수 있고 비용이 많이 드는 실험실 장비를 필요로하지 않는 냉충격 복구 분석 의 방법을 설명합니다. 이 방법은 열대 나비의 차가운 충격에 대한 응답 및 복구 전략을 이해하는 데 사용되어 전체 나비 커뮤니티에 걸쳐 개별 수준의 데이터를 생성합니다. 이러한 방법은 원격 필드 설정과 교실 모두에서 사용할 수 있으며 생태학적으로 관련된 생리 데이터를 생성하고 교육 도구로 사용할 수 있습니다.

이 프로토콜에서 수집된 데이터는 유기체 생리학에 중요한 변수의 검사 및 분할을 허용합니다. 예를 들어, 온도와 조명 조건 모두 차가운 충격으로부터 나비의 회복에 기여한다(도1). 플롯은 주변 조건과 콜드 쇼크 복구 사이의 상호 작용을 탐색하기위한 것입니다. 트랩과 그물망 모두에서 야생 잡은 나비를 사용하여 181종의 나비는 차가운 충격에 의해 유도된 차가운 혼수상태에 의해 뚜렷한 회복을 보여주었습니다(그림2). 그림 2에 제시된 데이터는 콜롬비아 안데스에서 약 5개월(2020년 1월, 2월, 5월-7월) 세 명의 관찰자에 의해 수집되었습니다. 실험은 항상 나비 수집 후 아침에 실시되었다. 최대 효율로, 두 명의 관찰자가 각각 4개의 나비를 동시에 관찰할 수 있었고, 7회(최소 7.37시간)를 반복하여 한 날 아침에 56명의 개인을 시험할 수 있었습니다. 이를 통해 개별 변동에 대한 데이터를 포함하고 고려하는 동시에 전체 나비 커뮤니티에서 많은 데이터 수집이 허용되었습니다. 아사필은 주변 환경 조건에서 발생할 수 있기 때문에, 회복 조건은 서식지를 대표하고 자연에서 유기체에 의해 경험되는 자연적인 변화를 반영합니다. 도 3은 일부 테스트 된 나비가 수집된 목초지에서 차가운 충격 복구 실험 및 조건의 온도와 빛 조건 사이의 중첩을 보여줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62218/62218fig01.jpg"> 그림 1: 차가운 충격 후 나비의 회복 시간 (초)의 산란플롯. (A)평균 온도 및(B)평균 LUX (빛 강도)를 회복하는 동안. 종은 가족에 의해 조직되고 착색됩니다. 전반적으로, 빛과 온도가 증가함에 따라, 차가운 충격 복구 시간이 감소하여 택시 전반에 걸쳐 변동성을 나타내고 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62218/62218fig02.jpg"> 그림 2: 콜롬비아 안데스산에서 나비의 181 종에 감기 충격 복구 분석에서 결과의 예. 데이터는 추위로부터 나비를 제거하고 비행할 수 있었던 시점의 경과초를 나타냅니다. 종은 가족에 의해 조직되고 착색됩니다. 이 수치는 이 실험이 성공적으로 적용될 수 있는 분류학 폭과 종 전체에 걸친 다양한 냉쇼크 복구 반응을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62218/62218fig03.jpg"> 그림 3: 차가운 충격 복구 시험 중 주변 온도 및 LUX. 나비 수집이 일어난 목초지 (밝은 색상, 조건 은 하루 종일) 및 차가운 충격 복구 시험 (어두운 색상, 아침 시간 만)동안 조건목초지에 배치 된 데이터 로거에 의해 기록 된 주변 온도 (파란색) 및 LUX (밝은 강도, 빨간색)의 플롯. 주변 현장 조건과 실험 조건이 플롯된 것은 1주일 동안 나비가 경험하는 범위와 평균 조건의 범위를 보여주며, 1주일 동안의 현장 샘플링 및 실험. 실험은 이른 시간(07:00-13:00h)에만 수행되었으며, 데이터 로거는 일주일 동안 현장에 배포되었습니다(일광 시간, 06:00-18:00 h 표시). 여기에 나비가 경험한 실험 조건과 주변 조건 사이의 중첩이 있으며, 주변 조건에서 생리학 검사를 수행하는 생태학적 관련성을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 1: 초점 곤충을 수집하는 절차-이 경우, 나비-미끼 반- 서머렌 트랩과 활성 그물을 사용하여. 함정은 썩어가는 물고기와 썩어가는 과일 미끼로 미끼를 받았다. 포획(미끼 없이)을 배경으로 전경에는 파란색 플라스틱 컬렉션 박스에 대한 독특한 봉투에 표본이 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/Jove%20supplement%20fig%201.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 2: 최대 4 개의 개별 나비가 차가운 얼음 물에 잠긴 가방. 비닐 봉지는 얼음 물에 놓인 시간으로 표시되어 있었고, 그래서 차가운 충격 실험은 아침내내 비틀거리게 될 수 있었습니다. 비닐 봉지는 표본이 젖지 않도록 밀봉해야합니다. 그러나 이 경우 가방과 봉투의 홍수는 나비의 회복에 측정 가능한 영향을 미치지 않았습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/jove%20supp%20fig%202.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 도 3: 두 명의 관찰자가 현장에서 데이터를 수집합니다. 각 메쉬 케이지에는 차가운 충격에서 회복하는 4개의 독특한 나비가 포함되어 있습니다. 케이지의 폴리염화염화 T-조인트에는 직접 태양이나 비 노출을 방지하기 위해 데이터 로거가 있습니다. 각 관찰자는 나비가 케이지로 방출되는 즉시 시작된 스톱워치를 가지고 있습니다. 케이지는 벤치에 의해 상승되어 관찰자가 케이지의 베이스를 교반하여 나비가 생리적으로 가능한 한 빨리 행동적으로 반응할 수 있도록 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/jove%20sup%20fig%203.jpg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 예제 데이터 시트. 시트는 필드에 할당된 각 나비고유ID와 노트에 구별되는 문자(종이름, 키 색상)를 표시합니다. 또한 기록된 나비의 지배적 위치(즉, 날개의 측면이 태양에 노출됨)는 회복 기간 동안 D(등쪽) 또는 V(복부)로 지적된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/62218_R1_Supp-table%201.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 비디오 1 : 차가운 충격 회복을위해 케이지를 두드리는. 나비가 회복되면 관찰자는 케이지의 베이스를 부드럽게 탭하여 나비가 가능한 즉시 행동을 유도합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62218/IMG_1712.MOV" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기서, 저렴한 비용의 접근 가능한 프로토콜은 주변 환경 조건에서 나비의 차가운 충격 복구를 평가하기 위해 설명된다.

Ecological physiology, particularly of ectotherms, is increasingly important in this changing world as it uses measures of species and environmental ...

이 프로토콜은 유기체 생리학에 대한 데이터를 접근 가능하고 표준화된 방식으로 수집하는 매우 저렴한 방법입니다. 이 도구는 여러 수준에서 생리학을 탐구하는 데 사용할 수 있습니다. 그것은 용감한 필드 생물학자뿐만 아니라 어린 학교 아이들에 의해 고용 될 수있다.이 기술의 주요 장점은 쉽게 사용할 수있는 재료에 의존하고 매우 저렴한 비용이라는 것입니다. 그것은 거의 모든 곳에서 그리고 전문 지식과 목표의 범위를 가진 연구원에 의해 수행 될 수 있습니다. 이 방법은 생리학, 행동 및 생태 학적 과정에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.생리적 반응을 유도하기 위한 주요 지표가 표준화됨에 따라 이 방법은 개인, 종 및 생태 공동체 그룹 전반에 걸친 주요 특성을 이해하고 비교할 수 있는 능력을 증가시킬 수 있습니다. 곤충을 손상시키지 않고 처리하는 것은 연습이 필요하지만 연습은 완벽합니다. 실험의 매개 변수를 정의, 얼음 물에 곤충을 유지하는 데 걸리는 시간과 마찬가지로, 시간이 걸릴 수 있으며, 그것은 당신의 초점 택시의 실험과 이해가 필요합니다.저와 함께 절차를 시연하는 것은 다니엘의 실험실에서 온 두 명의 기술자인 헤더 로어와 맷 스탠드리지입니다. 관심있는 종을 식별하는 것으로 시작, 각 그룹은 차가운 혼수 상태를 유도하는 데 걸리는 시간에 다를 것이라는 점을 명심. 유기체 및 데이터의 사용에 기초하여, 초점 개인이 비행하지 않는 경우 실험에 대한 다른 차단 점을 선택합니다.작은 샘플에서 예심을 수행하여 얼음에 필요한 시간과 같은 주요 매개 변수를 결정하여 차가운 혼수 상태를 유도합니다. 종의 생태에 따라 컷오프 시간을 선택합니다. 비행이 불가능한 지 몇 분 후에 일부 곤충은 포식자에 의해 촬영된다는 것을 명심하십시오.미끼 트랩과 곤충 그물과 같은 적절한 방법을 사용하여 곤충을 수집합니다. 각 개인을 고유한 ID가 있는 별도의 유리 봉투에 넣고 직접 태양, 바람 및 육식 동물로부터 보호되는 그늘진 시원한 장소에 동물을 보관하십시오. 항상 실험 전반에 걸쳐 가능한 한이 시간을 표준화하기 위해 캡처 된 24 시간 이내에 실험 치료에 동물을 노출.물과 충분한 얼음으로 쿨러를 채우고 0°C의 물 속에서 환경을 유지합니다. 각 개인이 식별 할 수 있는지 확인하기 위해 실험의 라운드를 위해 1 ~ 4 개의 초점 개인 사이에서 선택합니다. 여러 종을 사용하는 경우 혼동을 피하기 위해 각각 하나만 사용하십시오.실험이 날개 색채와 관련이 없는 경우, 개인을 구별하기 위해 미세펠트 팁 마커로 날개를 독특한 색상으로 표시합니다. 실험이 위의 기준을 충족하지 않으면 한 번에 한 개인에 대한 실험을 수행합니다. 노트에 고유한 ID와 유용한 식별자를 포함하여 분석된 각 곤충에 대한 정보와 데이터 시트행을 채웁니다.모든 초점 대상인을 밀폐된 비닐 봉지에 넣고 가방을 얼음물에 60분 간 넣어 차가운 혼수 상태를 유도합니다. 간단한 온도계를 사용하여 짧은 간격으로 주변 온도를 간단히 기록합니다. 사용 가능한 경우 데이터 로거를 사용하여 주변 조건을 기록할 수 있습니다.먼저 데이터 로거를 연결하고 장치로 이동하여 Okay를 클릭하여 연결된 장치를 실행및 선택합니다. 평가판 이름을 입력하고 온도 및 광 강도를 선택하고 단위를 입력합니다. 로깅 간격을 10초로 설정합니다.실험 날짜와 시간을 입력하고 지연 된 시작을 선택하여 선택한 시간에 데이터 로거를 시작합니다. 하루 중 시간을 포함한 데이터 로거 정보가 실험과 동기화되어 주변 조건에 대한 데이터가 나중에 각 개별 초점 곤충과 일치할 수 있도록 합니다. 복구가 그늘이나 태양에서 이루어질지 여부와 같은 실험 매개 변수를 결정하고 데이터 시트에 이러한 처리를 기록하십시오.온도와 조명 환경이 케이지 내에서 균일할 수 있도록 적절한 위치에 곤충을 위한 메쉬 케이지를 배치합니다. 케이지의 베이스를 높이 유지하여 관찰자가 탭하고 데이터 로거를 케이지 바깥이나 케이지 내부에 배치하여 방해받지 않고 보관할 수 있습니다. 60분 후에 얼음 수조에서 동물을 제거하고 즉시 비닐 봉지에서 곤충을 제거한 다음, 최소한의 취급으로 봉투에서 각 개인을 신속하게 제거하고 동물이 메쉬 케이지에 있는 즉시 스톱워치를 시작합니다.연필로 케이지의 베이스를 자주 누르고 충분히 강하게 반응하지 않고 복구 곤충을 교반할 수 있습니다. 개인이 비행한 후 재판을 완료한 것으로 표시합니다. 시험을 끝내고 30 분 후에 움직이지 않으면 곤충이 회복되지 않은 것으로 간주하십시오.메쉬 케이지에서 곤충을 제거하고 개인을 라벨이 붙은 유리 봉투에 다시 넣습니다. 동물을 해방하거나 추가 데이터 수집을 위해 동물을 유지하고 텍스트 원고에 설명된 대로 데이터를 처리합니다. 기록된 환경 데이터에 액세스하려면 HOBO 데이터 로거를 다시 컴퓨터에 연결합니다.장치 판독값으로 이동하여 로깅 중지를 선택하고 원하는 폴더에 HOBO 파일로 파일을 저장합니다. 팝업이 표시된 후 매개 변수의 단위를 확인하고 플롯을 선택하여 실험 조건에 대한 그래프를 얻습니다. 데이터 테이블을 내보내려면 파일 내보내기 테이블 데이터를 선택하고 CSV 파일로 내보내 적절한 폴더에 저장합니다.이 프로토콜에서, 유기체 생리학및 감기 충격 복구에 중요한 주변 조건 사이 상호 작용은 나비의 가변 종을 위해 탐구되었습니다. 시험의 평균 온도가 증가함에 따라, 감기 충격 회복 시간이 감소하면 택시 전반에 걸쳐 변동성이 나타나는 것으로 관찰되었습니다. 마찬가지로, 시험의 평균 광강도와 냉충격 회복시간 사이의 역관계가 관찰되었으며, 이는 온도와 빛 조건이 모두 나비의 회복에 기여한다는 것을 나타낸다.5개월 동안 3명의 관찰자가 수집한 181종의 야생종은 차가운 충격에 의해 유도된 차가운 혼수상태에 의해 뚜렷한 회복을 보였으며, 이 실험이 성공적으로 적용될 수 있는 분류학폭을 강조했습니다. 주변 현장 조건과 실험 조건은 주변 조건에서 생리학 조사를 수행하는 생태학적 관련성을 입증하여 플롯되었습니다. 이 프로토콜을 수행할 때는 동작의 변화가 미묘하고 신속하게 발생할 수 있기 때문에 메시 케이지의 모든 개인에게 주의를 기울여야 합니다.이 프로토콜에 의해 생성된 데이터는 시험된 유기체의 생태 생리적 특성에 빛을 비추습니다. 다른 많은 특성은 크기, 색상 및 물리 학과 같은 유기 생리학에 기여합니다. 추가 특성에 대한 데이터는 이 정보의 생태학적 및 생명 역사 맥락을 더해 차가운 충격 회복의 측정을 더 설명하고 맥락화할 것입니다.나는 콜롬비아 안데스에서 나비의 전체 지역 사회의 생태 생리학을 특성화하기 위해이 방법을 사용했습니다. 프로토콜은 시골 환경에서 구현할 수 있을 만큼 접근 가능하고 저렴하며 간단하기 때문에 단기간에 수백 명의 개인에 대한 데이터가 수집되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 부상 발병하기 전에 두뇌를 보호하는 치료제 개발을위한 새로운 목표를 식별하는 수단으로 추위 preconditioning에 대한 책임 신경 면역 신호를 정의하기 위해 추구합니다. 우리는 생물 학적 시스템, 실험 조작 플러스 높은 재현성 및 민감 기술 용량을 필요로 이러한 작업을위한 전략을 제시한다.

콜드 preconditioning에서 Neuroprotection 연구를위한 전략

이 프로토콜의 열충격 후 세포내 단백질 refolding을 측정하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 자신의 활동에 영향을 미칠 수있는 분자 보호자 및 공동 요소 또는 혼합물과 같은 foldases을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 반딧불 루시페라제 활동은 보호자 역할 refolding 활동을 측정하는 기자로 사용됩니다.

세포 Refolding 분석

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

Cold Plantar Assay(CPA)는 30°C에서 5°C 사이의 추위 반응성을 측정하고 추위 적응도 측정할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CPA를 사용하여 마우스의 추위 과민증, 진통 및 적응을 측정하는 방법을 설명합니다.

마우스에 콜드 민감도 및 적응을 결정하기위한 간단하고 저렴한 방법

마약 대상 포용의 측정은 효과적인 약물 개발 및 화학 프로브 유효성 검사를 중앙. 여기, 우리 선발 마약 대상 포용 셀룰러 열 교대 분석 실험 (CETSA)의 미 판 호환 adaption에 높은 콘텐츠 이미징 사용 하 여 측정 하기 위한 프로토콜.

척도 부착 셀에 대상 참여를 이미징 높은 콘텐츠를 사용 하 여

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

여기서, 표준화된 프로토콜은 분자 수준에서 RT-qPCR을 이용하여, 세포 수준에서 형광 기자, 유기체 수준에서의 열회수를 사용하여 Caenorhabditis elegans에서 열 충격 반응(HSR)의 유도를 평가하기 위해 제시된다.

Caenorhabditis elegans의 열 충격 반응 유도를 측정하는 표준화된 방법

열 제한은 급속한 기후 변화에 직면하여 중요한 정보인 유기체가 견딜 수 있는 환경을 예측할 수 있습니다. 여기에 설명된 곤충의 중요한 열 미니마 및 열 녹다운 시간을 평가하는 고처리량 프로토콜이 있습니다. 두 프로토콜 모두 처리량을 최대화하고 분석 비용을 최소화합니다.

곤충의 중요한 열 한계에 대한 높은 처리량 해석

심근 보호에 저체온증의 다른 정도의 뚜렷한 영향은 철저하게 평가되지 않았습니다. 본 연구의 목표는 인간 심근세포 기반 모델에서 다른 저체온증 치료에 따른 세포 사멸 의 수준을 정량화하여 미래의 심층 분자 연구의 토대를 마련하는 것이었습니다.

인간 심장 근세포 모델에서 저체온증-사전 조절 에 따른 심근 보호의 체외 평가

이 프로토콜은 감전과 같은 불리한 외부 자극으로부터 자유로운 마우스에서 표준화되고 반복 가능한 전임상 모델인 편성 열사병(EHS)의 개발을 설명합니다. 이 모델은 기계론, 예방 및 치료 연구를 위한 플랫폼을 제공합니다.

마우스에서 운동 열사병의 전임상 모델

이 연구는 완보동물 Hypsibius exemplaris  에서 유전자 발현을 분석하기 위한 신속한 RNA 추출 및 전사체 수준 비교 방법을 제시합니다.물리적 용해를 사용하는 이 고처리량 방법은 출발 물질로 단일 완보동물을 필요로 하며 그 결과 정량적 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)을 위한 cDNA를 강력하게 생산할 수 있습니다.

완보동물 Hypsibius exemplaris에서 qRT-PCR을 통한 상대 전사체 수준 비교를 위한 단일 동물, 단일 튜브 RNA 추출

학습하세요 나비의 냉충격 회복을 평가하는 저비용 현장 생리학 프로토콜을. 얼음물 노출 후 회복 시간을 측정하여 환경 요인이 생리적 반응에 미치는 영향을 밝히고, 다양한 종 간 특성 비교가 가능합니다.

현장 기반 열 생리학 분석: 주변 조건에서 감기 충격 회복

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