Name: 생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: 배우세요 생체 내 마우스 열등올리브 칼슘 이미징 방법을. GRIN 렌즈와 GCaMP6s 센서를 활용해 운동 조절에 중요한 신경 활동을 실시간으로 관찰하고 시공간적 패턴을 분석하는 기술입니다.

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우리는 비디오 녹화 및 편집에 대한 그의 도움에 대한 OIST의 미디어 센터에서 앤드류 스콧 감사합니다. 또한, 우리는 뇌간을 노출하는 수술을 개발하는 그의 도움휴고 Hoedemaker와 인물에 대한 도표를 그리는 그의 도움에 대한 케빈 다이스 박사에게 감사드립니다. 또한, 그의 음성 해설에 대한 살바토레 라카바뿐만 아니라 COVID-19의 힘든 시기에 웰빙에 대한 지속적인 지원을위한 모든 nRIM 회원과 애완 동물에 큰 감사를 드립니다.

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저자는 공개 할 것이 없습니다.

외과 적 절차는 수많은 매우 중요한 구조 (동맥, 신경)와 인후 지역에서 수행 수술을 포함하기 때문에, 그것은 높은 수준의 수술 능력을 가진 연구원에 의해 수행되는 것이 필수적이다. 다음에서 절차의 몇 가지 핵심 사항을 강조하고 주석을 달았습니다. 그러나, 그것은 서면 조언의 양이 경험, 기술, 연구원의 직관을 대체할 수 없다는 것을 상기시켜야합니다.
수술에서 가장 중요한 단계는 기관 절제술입니다. 그것은 기관절단을 절단하고, 코 콘에서 관관으로 이소플루란을 바꾸고, 기관체를 가슴 피부에 고정하고 기관체와 관관을 함께 묶는 것을 포함합니다. 이러한 모든 작업은 부적절한 마취, 기관체로의 유체 유입 또는 관관 미끄러짐과 같은 사고를 피하기 위해 원활하고 빠른 방식으로 완료되어야 합니다. 하나는 기관을 절단하기 전에 염두에 명확하게 프로토콜을 유지해야합니다.
출혈은이 수술에서 동물 사망의 주요 원인 중 하나입니다. 목 부위는 혈관으로 조밀하기 때문에 보이지 않는 정맥과 동맥을 자르지 않도록 시야가 명확할 때만 절단해야합니다. 따라서 시력을 가리는 근육과 결합 조직은 제거되어야하며, 부러진 모세 혈관에서 혈액은 발전하기 전에 청소해야합니다.
동물은 수술 시작부터 오랜 시간 (8 시간 이상) 살아 있을 수 있습니다. 그러나, 외과 적 절차를 신속 하 게 완료 하는 것이 중요 하다 그래서 동물 생리 조건이 좋은 때 뇌간 신경을 검사 하는 더 많은 시간이 있다. 숙련 된 연구원은 70 분 안에 전체 절차를 완료 할 수 있습니다.
이 방법은 복부 뇌 표면의 깨끗한 전망을 제공하지만, 기관 절제술을 수행하고 목 부위에서 상당한 양의 조직을 제거하지 않고는 불행히도 그렇게하는 것은 불가능합니다. 따라서 동물은 마취에서 깨어 날 수 없습니다. 더욱이, 마취 전달의 주의 깊게 조정하여 체온과 수분을 유지함으로써 동물을 몇 시간 동안 살릴 수 있지만, 장기간 실험하면 결국 동물 상태의 약화로 이어질 수밖에 없다. 그것은 안정적인 기록의 최대 기간을 고려하는 연구원의 전문 지식에 남아있다.
여기에 설명된 바와 같이 방법의 또 다른 잠재적 한계는 GRIN 렌즈가 뇌 빈혈종에 삽입되지 않기 때문에 상대적으로 피상적인 뉴런(~150-200 μm)만 검사할 수 있다는 것입니다. GRIN 렌즈의 외과 이식은 기술적으로 가능하지만, 급성 수술 방법은 이식 후 산화 스트레스와 혈액의 존재로부터 뉴런이 회복하기에 충분한 시간을 허용하지 않을 가능성이 허용 이상으로 이미지 품질을 저하시킬 가능성이 높습니다.
위의 우려에도 불구 하 고, 우리는 이것이 IO 뉴런의 생체 내 이미징에 대 한 방법이 제시 되는 처음 믿습니다. 지금까지 가능하지 않은 위업인 소뇌핵및 메소디온스접합22로부터의 신호뿐만 아니라 감각 시스템에서 온전한 포신입력이 있는 생체내 의 맥락에서 IO 뉴런내의 현소측활성을 검사할 수 있다. 이 방법을 사용하면 IO의 기능은 이제 감각 및 광유전학 자극의 조합으로 더 심층으로 조사 될 수 있습니다. 특히, 전압 이미징의 진화와 함께 (IO 23에서전압 이미징에 대한 우리의 최근 방법과 같은), 우리는 제시 된 수술 방법이 IO가 소뇌 복잡한 스파이크의 생성에 기여하는 방법을 조사하는 도전을 취할 많은 연구자 영감을 희망.

시스템 신경 과학의 주요 목표는 신경 네트워크의 현면 활동 패턴이 동물 행동의 생성에 기여하는 방법을 이해하는 것입니다. 따라서, 칼슘에 민감한 프로브를 이용한 형광 화상 진찰 방법론은 지난 10년 동안 살아있는동물의신경망 활동을 검사하기 위한 주요 도구가 되었으며,이는단일 세포에서 메소스케일 회로에 이르는 공간 저울을 통해 이러한 역학의 시각화를 가능하게 한다. 최근 몇 년 동안, 표면적인 뇌 구조(예: 뇌 또는 소뇌 코르티체)의 신경 회로가 투명한 두개골 창3을 통해 이미지화되는 일반적인 접근법은 그라데이션 굴절률(GRIN) 렌즈4를 사용하여 깊은 뇌 구조에서 네트워크 역학을 검사할 수 있도록 보완되고 있다. 현재 사용 가능한 GRIN 렌즈는 마우스 편도체, 해마 및 기저 신경질5와같은 수밀리미터 깊이의 구조물에 도달할 수 있습니다. 그러나, 복부 수질에 있는 각종 핵과 같은 관심의 많은 지구는 GRIN 렌즈 도달의 극단에 그(것)들을 두는 현저하게 더 깊은 거짓말합니다.
여기에서, 우리는 두뇌의 복부 측면을 통해 medulla의 상대적으로 쉬운 접근성을 이용하여 이 어려움을 극복하는 방법을 설명합니다. 복부 수질계의 핵인 열등한 올리브(IO)가 칼슘 센서 GCaMP6s에 바이러스적으로 감염된 성인 마우스를 사용하여 수술 단계(원래 코스트로바니 에 설명된 방법에서 변형됨) (20076년6일코스로바니 에 설명된 방법에서 변형됨) 뇌의 복부 표면에 GRIN 렌즈를 배치한다. 소형 현미경을 사용하여, 우리는 극단적으로 복부 두뇌 지구에 있는 신경 활동을 기록의 타당성을 보여줍니다. 절차는 반드시 생존수술이 아니고 깨어있는 동물에서는 실험이 수행될 수 없지만, 감각 또는 기타 흡성 경로 자극의 맥락에서 온전한 네트워크 역학을 검사할 수 있게 하여 급성 슬라이스 제제를 사용하는 것과 같은 전 생체 접근법에 비해 명확한 이점을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>AAV. 전능신교. GCaMP6s.WPRE.SV40</td><td>Addgene, 미국</td><td>100844-AAV9</td><td></td></tr><tr><td>6mm 반원 바늘이 있는 흡수성 봉합</td>사 <td>Natume, 일본</td><td>L6-60N2</td><td>실이 있는 후크 바늘</td></tr><tr><td>흡수 삼각형</td><td>FST, 독일</td><td>18105-03</td><td>수술용 스폰지</td></tr><tr><td>스테레오 현미경</td><td>Leica, 독일</td><td>M50</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 잠금 장치가 있는 곡선 팁 바늘 홀더</td><td>FST, 독일</td><td>12061-01</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>면봉</td><td>산요, 일본</td><td>HUBY-340</td><td></td></tr><tr><td>섬세한 봉합사 묶는 겸</td>자 <td>FST, 독일</td><td>11063-07</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>섬세한 봉합 묶는 겸자</td><td>FST, 독일</td><td>11063-07</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>Dumont # 5 / 45 겸자</td><td>FST, 독일</td><td>11251-35</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>파인 아이리스 가위</td><td>FST, 독일</td><td>14060-09</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>Friedman-Pearson rongeur 곡선 팁</td><td>FST, 독일</td><td>16221-14</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>Gelfoam 흡수성 젤라틴 스폰지</td><td>Pfizer, 미국</td><td>0315-08</td><td>지혈 젤라틴 스폰지</td></tr><tr><td>유리 모세관 나노 주입</td><td>Neurostar, 독일</td><td>해당 없음</td><td>바이러스 벡터 주입</td></tr><tr><td>용 톱니 모양의 팁이있는 Graefe Forceps</td><td>FST, 독일</td><td>11052-10</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>이식 막대</td><td>Inscopix, 미국</td><td>nVoke2</td><td>시스템의 일부입니다. nVoke2 소형 microscpe 및 GRIN 렌즈를 장착할 수 있도록 설계되었습니다</td></tr><tr><td>IsoFlo</td><td>Zoetis, 영국</td><td>n/a</td><td>Isoflurane</td></tr><tr><td>KETALAR FOR MUSCULAR 주사</td><td>Daiichi Sankyo, 일본</td><td>n/a</td><td>Ketamine</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark, USA</td><td></td><td>청소 조직</td></tr><tr><td>레이저 기반 마이크로피펫 풀러</td><td>Sutter Instrument, 미국</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette Beveler</td><td>Sutter Instrument, USA</td><td>BV-10</td><td></td></tr><tr><td>Kopf, Model 900</td><td>Neurostar, Germany</td><td>n/a</td><td>Stereotaxic frame</td></tr><tr><td>mouseOxPlus with rectal temperature sensor and thigh clamp pulse oximeter Starr</td><td>Life Sciences, PA, USA</td><td>MouseOxPlus</td><td>동물 심박수, 동맥 산소 포화도(SpO2), 호흡수 및 온도 측정</td></tr><tr><td>nVoke2 통합 칼슘 이미징 마이크로 카메라 시스템</td><td>Inscopix, USA</td><td>1000-003026</td><td>소형 현미경</td></tr><tr><td>Ohaus Compact Scales</td><td>Ohaus, USA</td><td>CS 200</td><td>동물의 체중을 측정하는 데 사용되는 스케일</td></tr><tr><td>오츠카 생리식염수</td><td>오츠카 제약 공장, 일본</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>생리생물학 온도 조절기 시스템</td><td>SuperTech Instruments, 헝가리</td><td>TMP-5b</td><td>마우스</td></tr><tr><td>ProView 렌즈 프로브용 열 패드 직경 1.0mm, 길이 9.0mm</td><td>Inscopix, 미국</td><td>1050-002214</td><td>그라디언트-굴절률(GRIN) 렌즈</td></tr><tr><td>Q114-53-10NP 유리 모세관</td><td>Sutter Instrument, 미국</td><td>112017</td><td>맞춤형&nbsp; 석영 유리 모세관</td></tr><tr><td>Safety IV 카테터 20G</td><td>B. Braun, Germany</td><td>4251652-03</td><td>삽관 튜브를 준비하는 데 사용되는 20개의 가우지 카테터</td></tr><tr><td>모래 종이</td><td>ESCO, 일본</td><td>EA366MC</td><td>곡선과 뭉툭한 바늘을 준비하기 위해 25G 바늘의 끝을 연마하는 데 사용</td></tr><tr><td>메스 블레이드</td><td>Muromachi Kikai, Japan</td><td>10010-00</td><td>석영 유리 피펫의 끝을 절단하는 데 사용</td></tr><tr><td>SomnoSuite 저유량 흡입 마취 시스템</td><td>Kent Scientific, 미국</td><td>SOMNO</td><td>이소 플루란 흐름의 정확한 제어 제공</td></tr><tr><td>Surgic XT Plus 드릴</td><td>NSK</td><td>Y1002774</td><td>바이러스 벡터 주입</td></tr><tr><td>주사기 1 ml</td><td>Terumo, 일본</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>주사기 바늘 25G</td><td>Top, 일본</td><td>00819</td><td>무딘 및 구부러진 바늘</td></tr><tr><td>주사기 바늘 26G</td><td>Terumo, 일본</td><td>NN-2613S</td><td></td></tr><tr><td>Thrive 2100 Professional Trimmer</td><td>Thrive, 일본</td><td>n/a</td><td>면도기</td></tr><tr><td>Vannas-T&uuml; bingen 스프링 가위</td><td>FST, 독일</td><td>15004-08</td><td>수술 도구</td></tr><tr><td>Vaseline</td><td>Hayashi Pure Chemical, 일본</td><td>22000255</td><td></td></tr><tr><td>Veet 민감성 피부</td><td>Veet, 캐나다</td><td>n/a</td><td>제모 크림</td></tr><tr><td>Xylocaine Jelly 2 % 30ml</td><td>Aspen Japan,&nbsp; 일본</td><td>871214</td><td></td></tr></tbody></table>

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

열등한 올리브 (IO), 복부 수질의 핵은 소뇌에 들어가는 두 개의 입력 경로 중 하나를 형성하는 등반 섬유의 유일한 소스입니다. IO는 오랫동안 모터 제어에 매우 중요하도록 제안되었으며 그 활동은 현재 소뇌의 모터 및 인지 기능 모두의 많은 가설의 중심에 있는 것으로 간주됩니다. 그것의 생리학 및 기능은 시험관내에 있는단 세포 수준에 상대적으로 잘 공부된 동안, 현재 살아있는 동물에 있는 IO 네트워크 활동의 조직에 아무 보고도 없습니다. 이것은 IO의 극단적인 도전적인 해부학 적 위치 때문에, 관심의 지역에 등대적으로 위치한 전체 두뇌를 통해 광학 경로를 만들어야 하는 전통적인 형광 화상 진찰 방법의 적용을 어렵게 만듭니다.
여기에서 는 IO 네트워크에서 최첨단 -level 칼슘 이미징 데이터를 얻기위한 대체 방법을 설명합니다. 이 방법은 IO의 극단적인 복부 위치를 활용하고 마취 마우스에서 칼슘 센서 GCaMP6s-expressing IO의 복부 표면과 접촉하기 위해 목 내장을 통해 그라데이션 굴절 지수(GRIN) 렌즈를 삽입하는 수술 절차를 포함한다. 대표적인 칼슘 이미징 기록은 수술 후 IO 뉴런 활성을 기록할 수 있는 타당성을 입증하는 것으로 나타났다. 이것은 비 생존 수술이고 기록은 마취의 밑에 수행되어야 하는 동안, 생명을 중요한 뇌간 핵에 손상을 피하고 IO에 있는 현면 활동 패턴 및 입력 통합을 조사하는 실험의 큰 다양성을 수행할 수 있습니다. 수정이 절차는 복부 뇌간의 다른 인접 한 영역에서 녹음에 사용할 수 있습니다.

여기서 는 설명된 바와 같이 방법으로 얻은 대표 기록을 제시한다. 도 6a는 실험 중에 시각화된 밝은 표지된 IO 셀의 위치를 나타낸다. 어두운 대각선 줄무늬는 혈관입니다. 가변 형질 변환 효능으로 인해 개별 셀의 가변 밝기를 유의하십시오. 패널 도 6b에서 우리는 패널a의 색상과 숫자로 표시된 소마타로부터 얻은 평균 정규화된 형광 강도(deltaF/F) 흔적을 보여줍니다. 상향 편향은 세포 내 칼슘의 일시적인 증가를 나타냅니다. GCaMP6s 발현의 다른 수준(패널 a의 셀 밝기에 반영)이 가변 신호 대 잡음 비율(SNR)으로 이어지는 방법에 유의하십시오.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62222/62222fig06.jpg"> 도 6: 마취 마우스에서 IO 뉴런의 활성을 예로 들 수 있습니다.(a)공간 필터링 후 기록으로부터 대표적인 예 프레임. 밝은 반점은 IO 신경 소마타이며, 그 중 일부는 관심 영역 (ROI, 유색 숫자)으로 표시되었습니다. 어두운 줄무늬는 혈관입니다. (b)패널에 표시된 ROI로부터 얻어진 예 델타F/F 흔적. 위쪽 편향은 칼슘 신호의 증가를 반영합니다. 10 μm의 배율 막대를 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62222/62222fig06large.jpg" target="_blank">클릭하십시오.</a>

우리는 복부 측에서 성인 마우스의 뇌간을 노출하는 프로토콜을 제시합니다. 소형 현미경을 가진 그라데이션 굴절 지수 렌즈를 사용하여, 칼슘 화상 진찰은 생체 내의 열등한 올리브 신경 소마타의 활동을 검사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the ...

열등한 올리브는 수질의 가장 복부 부분이므로 살아있는 동물에게 도달하기가 매우 어렵습니다. 여기서는 복부 측에서 성인용 마우스 뇌줄기를 노출시키고 GRIN 렌즈를 사용하여 칼슘 센서를 표현하는 열등한 올리브 뉴런에서 뉴런 활성을 기록하는 프로토콜을 소개합니다. 이 방법은 생명에 중요한 뇌 줄기의 손상을 방지하고, 열등한 올리브의 공간 측두활동 패턴 및 입력 통합에 대한 조사를 가능하게 한다.수술은 많은 중요한 구조와 복잡한 인후 영역에서 수행되기 때문에, 높은 수준의 수술 능력을 가진 연구원에 의해 수행되는 것이 필수적이다. 20 게이지 카테터 끝에서 길이 5~6mm, 너비 0.8mm를 절단하여 관착 튜브를 준비합니다. 팁을 잘라 무딘 곡선 바늘을 준비하고 골절 표면을 모래로 구부리고 펜치로 구부립니다.이것은 기관 절제술 도중 기관체를 지원하기 위하여 이용될 것입니다. 희석 15 밀리 리터 케타민 당 식염수 15%에 수술 도구와 소모품을 조립. 가열 패드를 섭씨 38도까지 설정합니다.입체 프레임에서 노세콘 180도 수평으로 돌립니다. 열등한 올리브가 이전에 바이러스 운반 GCaMP6s에 의해 감염된 마우스를 계량하고 주입을 위해 희석 케타민의 양을 계산합니다. 5%의 이소플루란으로 유도 상자를 미리 채우고 마우스를 마취시합니다.마우스를 스테레오테틱 프레임에 장착하고 복부 쪽을 위로 올려다보실 수 있습니다. 마우스 목과 허벅지 부위를 면도합니다. 제모 크림으로 잔류 모발을 제거합니다.목 피부에 실로카인 젤리를 토폴로서 발라주세요. 직장 열 센서로 마우스 온도를 모니터링합니다. 1 밀리 리터 미리 데워진 식염수 에 주사하십시오.뒷다리 발가락에 강한 핀치에 의해 마취의 깊이를 평가합니다. 탐지 가능한 응답을 불러서는 안 됩니다. 중간선을 따라 목 구멍 피부에 수직 절개를합니다.무딘 해부 방법을 사용하여 그 아래에 내장에서 목 피부를 분리하고 피부를 잘라. 결합 조직에서 무료 타액 땀샘, 그리고 스테르노 갑상선 근육 으로 덮인 기관을 노출 하기 위해 측면으로 그들을 플립. 내분비질은 동물 무게의 킬로그램 당 5 밀리리터에서 희석 케타민의 첫 번째 복용량을 주입.조심스럽게 기관을 노출 미세 집게의 끝으로 미드 라인을 따라 스테인장 근육을 분할. 무딘 해부 방법을 사용하여 포셉으로 혈관과 식도에서 기관체를 분리합니다. 동물 무게의 킬로그램 당 2.5 밀리리터에서 희석 케타민의 두 번째 복용량을 주입.기관 아래에 무딘 바늘을 교차 삽입합니다. 무딘 바늘로 기관치를 들어 올립니다. 봉합사실이 세 번째 기관고리를 돌아다니게 하고, 갑상선으로 반원 바늘을 채우게 한다.이 링에 4 개의 악기 넥타이를 만듭니다. 같은 반원 바늘로 가슴 피부를 관통하고 피부를 통해 스레드를 리드. 기관차를 실로 부드럽게 들어 올리고 기관장 코떼를 갑상선으로 자릅니다.기관지를 가슴 피부쪽으로 당깁니다. 그 아래에 수술 스폰지의 작은 조각을 추가하여 기관의 개구부를 올립니다. 얇은 청소 조직 스트립으로 기관의 개구부 끝 내부에 남아있는 액체를 제거하십시오.스테레오탁스 누콘에서 관관으로 이소플루란 의 흐름을 전환합니다. 관착튜브를 기관체에 삽입합니다. 튜브의 슬릿 부분이 호흡을 허용하기 위해 기관 외부에 남아 있는지 확인하십시오.3~4개의 악기 넥타이를 만들어 마우스 가슴 피부에 기관진을 고정합니다. 기관지를 봉합실과 묶어 관관을 고정합니다. 미세 한 집게와 근육 섬유를 따라 스테르노 갑 상선 근육을 슬릿.스프링 가위로 고립된 부분을 잘라냅니다. 근육의 혈관 손상을 최소화하기 위해 근육에서 조심스럽게 남은 기관및 후두를 무료로 사용합니다. 남은 기관지와 후두를 제거합니다.집게가 부착 된 조직에서 식도를 무료로 하고 스프링 가위로 잘라냅니다. 뇌간과 아틀라스의 복부 아치를 덮고 있는 세로 근육을 제거하십시오. 아틀라스 복부 아치와 전방 결핵을 덮는 근육을 제거합니다.아틀라스의 복부 아치를 롱거로 자른다. 아틀라스의 전방 결핵을 제거합니다. 포라멘 매그넘과 뇌줄기를 보기 위해 혈액과 액체를 제거합니다.강수기와 목두골을 제거하여 포멘 매그넘을 확장합니다. 연골을 제거하고, 조심스럽게 복부 뇌종의 명확한 보기를 가지고 미세 집게와 듀라 마터의 periosteal 층을 껍질. 마우스 허벅지에 SpO2 센서를 고정하여 심박수, 산소 포화도 및 호흡속도와 같은 활력 징후를 모니터링합니다.이식 봉에 GRIN 렌즈를 장착합니다. 70%에탄올에 담근 세정 조직으로 렌즈를 정성스럽게 청소하십시오. 입체 프레임에 이식 막대를 고정하고 이식 막대에 소형 현미경을 장착합니다.GRIN 렌즈를 침지 위해 뇌간 부위에 여러 방울의 식염수를 추가합니다. GRIN 렌즈로 뇌간에 접근하십시오. 피상 적 영역에서 열등한 올리브 뉴런을 발현하는 GCaMP6s는 직사각형 모양의 영역에서, 나머지 아틀라스에 약 0.5 ~ 1.7 밀리미터 의 로스트랄, 그리고 중간선까지 약 2.6 ~1.1 밀리미터의 측량에서 찾을 수 있다.GCaMP6s 를 찾기 위해 소형 현미경에서 여기 블루 LED를 켭니다 열등한 올리브 뉴런을 찾습니다. 뉴런은 다양한 GCaMP6s 발현 수준으로 인해 다른 기준선 형광 강도를 보여줍니다. 왼쪽 에 비디오에서 동그라미 올리브 뉴런 소마타의 칼슘 수준의 변화는 우리에게 오른쪽에 F 흔적으로 분할 델타 F를 보여줍니다.마우스는 따뜻하고 수분을 유지하지만, 그것은 필연적으로 장기간 마취와 수술에 의해 약화될 것입니다. 그것은 짧은 수술의 기간을 유지 하는 것이 필수적 이다 그래서 마우스 신체 조건 기록에 대 한 좋은 것입니다. 숙련 된 연구원은 70 분 안에 수술을 완료 할 수 있습니다.이 방법은 수정과 함께 복부 뇌의 다른 인접 영역을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

in-vivo-calcium-imaging-in-mouse-inferior-olive

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

네크로 텍스의 microcircuits의 네트워크 역학을 이해하기 위해서는 동시에 뉴런의 다수의 활동을 기록하는 것이 필수적입니다. - 생체내에서 두 광자 칼슘 이미징 하나는 단일 셀 해상도 고밀도의 연결 인구의 활동을 기록하는 수있는 유일한 방법입니다.

레이어의 VIVO에서 2 광자 칼슘 이미징 마우스의 2 / 3

출처: Shannonhouse, J., et al. 생체 내 온전한 배근 신경절의 1차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징. J. Vis. 특급 (2023). 이 비디오는 형질전환 마우스의 배측근신경절(DRG)에서 신경 세포 활동을 모니터링하기 위한 생체 내 칼슘 이미징 기술을 보여줍니다. DRG 뉴런은 칼슘에 결합할 때 형광 강도를 증가시키는 칼슘 지표를 발현합니다. 뒷발에 가해지는 기계적 또는 열적 자극은 DRG로 전파되는 활동 전위를 생성하여 뉴런에 칼슘 유입을 유도하고 형광 방출을 증가시킵니다.

In vivo: Calcium Imaging of the Intact Dorsal Root Ganglia of a Mouse(마우스의 온전한 등뿌리 신경절에 있는 신경 앙상블의 생체 내 칼슘 이미징)

출처: Lee, H. et. al., Successful In vivo Calcium Imaging with a Head-Mount Miniaturized Microscope in the Amygdala of Freely Vihaving Mouse(자유롭게 행동하는 마우스의 편도체에서 헤드 마운트 소형 현미경을 사용한 성공적인 생체 내 칼슘 이미징). J. Vis. Exp. (2020)이 비디오는 구배 굴절률 또는 GRIN 렌즈와 소형 현미경을 사용하여 마우스의 생체 내 칼슘 이미징을 보여줍니다. 이 설정은 마찰이 없는 이동식 케이지 시스템 내에서 머리를 고정하여 뉴런을 자극하고 칼슘 이온 유입을 유발합니다. GRIN 렌즈는 뇌의 칼슘 신호를 포착하여 신경 활동을 실시간으로 시각화할 수 있습니다.

자유롭게 움직이는 마우스의 실시간 미세내시경 칼슘 이미징

이 프로토콜은 마취마우스에 있는 가까운 혈관에서 백혈구 및 혈류 데이터를 심신하는 두뇌에서 형광 칼슘 심상을 취득하고 분석하는 단계를 제시합니다. 이러한 기술은 벽화 세포 생리학의 연구에 유용하며 모든 세포 유형의 칼슘 과도를 조사하기 위해 적응 할 수 있습니다.

생체 내 트랜스제닉 마우스의 뇌 성 구체 칼슘 및 혈역학 이미징

본 프로토콜은 식품 랩, 투명 실리콘 및 커버 유리를 사용하여 큰(6 x 3 mm2) 두개골 창을 만드는 방법을 설명합니다. 이 두개골 창은 동일한 마우스에서 생체 내 광시야 및 2광자 칼슘 이미징 실험을 허용합니다.

생체 내 큰 두개골 창을 사용한 마우스의 광시야 및 2광자 칼슘 이미징

이 프로토콜은 후근 신경절(DRG)에 이어 GCaMP3(유전적으로 인코딩된Ca2+ 지표; 녹색 형광 단백질-칼모듈린-M13 단백질 3) 동측 뒷발에 다양한 자극을 가하면서 Pirt-GCaMP3 마우스를 사용하여 신경 앙상블의Ca2+ 이미징.

생체 내 온전한 등근 신경절에 있는 일차 감각 뉴런 네트워크에서 뉴런 앙상블의 칼슘 이미징

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

이 프로토콜은 야생형 마우스에서 피질을 그대로 유지하면서 이광자 현미경으로 단일 뉴런 활동을 이미징하고 부분 피질 돌연변이 마우스에서 광시야 현미경으로 전체 SC를 이미징하는 것을 포함하여 깨어 있는 마우스의 상구(SC)에서 칼슘 반응을 이미징하는 절차를 자세히 설명합니다.

Mouse Superior Colliculus의 칼슘 이미징

해마의 치상이랑(dentate gyrus)은 학습과 기억에서 필수적이고 뚜렷한 기능을 수행합니다. 이 프로토콜은 자유롭게 움직이는 마우스의 치상이랑에 있는 과립 세포의 생체 내 칼슘 이미징을 위한 일련의 강력하고 효율적인 절차를 설명합니다.

In Vivo: Calcium Imaging of Granule cells in the dentate gyrus of hippocampus in mice(생쥐의 해마 치열계에 있는 과립 세포의 In vivo 칼슘 이미징) 

이 프로토콜은 사회적 상태 조작(사회적 고립 및 사회적 재결합) 중 마우스의 소형화된 현미경(미니스코프)을 이용한 시상하부 신경세포의 생체 내 칼슘 이미징을 상세히 다룹니다. 이 방법은 사회적 욕구와 사회적 포만을 나타내는 시상하부 활동을 단일 뉴런 해상도로 영상화할 수 있게 하여 사회적 항상성의 기전적 연구를 가능하게 합니다.

생체 내 쥐의 사회적 행동 이해를 위한 시상하부 내 소형 현미경으로 칼슘 영상 촬영

배우세요 생체 내 마우스 열등올리브 칼슘 이미징 방법을. GRIN 렌즈와 GCaMP6s 센서를 활용해 운동 조절에 중요한 신경 활동을 실시간으로 관찰하고 시공간적 패턴을 분석하는 기술입니다.

생체 내 마우스 열등올리브의 칼슘 이미징

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