Name: scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: 학습하세요 망막 세포의 전사체 및 크로마틴 접근성을 분석하는 scRNA-seq와 scATAC-seq 다중화 방법을. 이 프로토콜은 유전자 조절 네트워크 재구성과 발달 및 질병 연구에 활용됩니다.

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Johns Hopkins Transcriptomics와 Deep Sequencing Core의 Linda Orzolek에게 제작 된 라이브러리의 시퀀싱에 도움을 주신 것과 생체 외 망막 외 식편을 수행 한 Lizhi Jiang에게 감사드립니다.

<ol><li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. 370, (2020).</li>
<li>Nagalakshmi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Transcriptional+Landscape+of+the+Yeast+Genome+Defined+by+RNA+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The Transcriptional Landscape of the Yeast Genome Defined by RNA Sequencing.</a> Science. 320, 1344-1349 (2008).</li>
<li>Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+and+quantifying+mammalian+transcriptomes+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq.</a> Nature Methods. 5, 621-628 (2008).</li>
<li>Hwang, B., Lee, J. H., Bang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+technologies+and+bioinformatics+pipelines%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing technologies and bioinformatics pipelines.</a> Experimental & Molecular Medicine. 50, 96(2018).</li>
<li>Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+single-cell+transcriptomic+data+across+different+conditions%2C+technologies%2C+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species.</a> Nature Biotechnology. 36, 411-420 (2018).</li>
<li>McGinnis, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MULTI-seq%3A+sample+multiplexing+for+single-cell+RNA+sequencing+using+lipid-tagged+indices%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">MULTI-seq: sample multiplexing for single-cell RNA sequencing using lipid-tagged indices.</a> Nature Methods. 16, 619-626 (2019).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Hashing+with+barcoded+antibodies+enables+multiplexing+and+doublet+detection+for+single+cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics.</a> Genome Biology. 19, 224(2018).</li>
<li>Chen, X., Miragaia, R. J., Natarajan, K. N., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+robust+method+for+single+cell+chromatin+accessibility+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A rapid and robust method for single cell chromatin accessibility profiling.</a> Nature Communications. 9, 5345(2018).</li>
<li>Hoang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+regulatory+networks+controlling+vertebrate+retinal+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gene regulatory networks controlling vertebrate retinal regeneration.</a> Science. , 8598(2020).</li>
<li>Clark, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Cell+RNA-Seq+Analysis+of+Retinal+Development+Identifies+NFI+Factors+as+Regulating+Mitotic+Exit+and+Late-Born+Cell+Specification%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Single-Cell RNA-Seq Analysis of Retinal Development Identifies NFI Factors as Regulating Mitotic Exit and Late-Born Cell Specification.</a> Neuron. 102, 1111-1126 (2019).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+circulating+immune+cell+landscape+in+aging+and+COVID-19%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">A human circulating immune cell landscape in aging and COVID-19.</a> Protein Cell. 11, 740-770 (2020).</li>
<li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+single-cell+chromatin+landscapes+of+human+immune+cell+development+and+intratumoral+T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel single-cell chromatin landscapes of human immune cell development and intratumoral T cell exhaustion.</a> Nature Biotechnology. 37, 925-936 (2019).</li>
<li>Worthington Biochemical Corporation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Worthington+Biochemical+Corporation.+Papain+Dissociation+System%22">Worthington Biochemical Corporation. Papain Dissociation System</a>. , (2020).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chromium+Single+Cell+3%27+Reagent+Kits+v3+User+Guide%22">Chromium Single Cell 3' Reagent Kits v3 User Guide</a>. , (2020).</li>
<li>Agilent. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22DNF-468+HS+Genomic+DNA+50+kb+Kit+Quick+Guide+for+Fragment+Analyzer+Systems%22">DNF-468 HS Genomic DNA 50 kb Kit Quick Guide for Fragment Analyzer Systems</a>. , (2015).</li>
<li>ThermoFisher Scientific. Qubit dsDNA HS Assay Kits. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ThermoFisher+Scientific%22">ThermoFisher Scientific</a>. , (2015).</li>
<li>10x Genomics. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Chromium+Single+Cell+ATAC+Reagent+Kits+User+Guide+%28v1.1+Chemistry%29%22">Chromium Single Cell ATAC Reagent Kits User Guide (v1.1 Chemistry)</a>. , (2020).</li>
<li>Weir, K., Kim, D. W., Blackshaw, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+neurogenesis+by+somatostatin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal neurogenesis by somatostatin signaling.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Stoeckius, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+epitope+and+transcriptome+measurement+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells.</a> Nature Methods. 14, 865-868 (2017).</li>
<li>Gaublomme, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclei+multiplexing+with+barcoded+antibodies+for+single-nucleus+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics.</a> Nature Communications. 10, 2907(2019).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Potential+Identified+by+Shared+Single-Cell+Profiling+of+RNA+and+Chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Potential Identified by Shared Single-Cell Profiling of RNA and Chromatin.</a> Cell. , (2020).</li>
<li>Buenrostro, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+Single-Cell+Analysis+Maps+the+Continuous+Regulatory+Landscape+of+Human+Hematopoietic+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation.</a> Cell. 173, 1535-1548 (2018).</li>
<li>Pliner, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cicero+Predicts+cis-Regulatory+DNA+Interactions+from+Single-Cell+Chromatin+Accessibility+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Cicero Predicts cis-Regulatory DNA Interactions from Single-Cell Chromatin Accessibility Data.</a> Molecular Cell. 71, 858-871 (2018).</li>
<li>Granja, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ArchR%3A+An+integrative+and+scalable+software+package+for+single-cell+chromatin+accessibility+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">ArchR: An integrative and scalable software package for single-cell chromatin accessibility analysis.</a> BioRxiv. , (2020).</li>
<li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177, 1888-1902 (2019).</li>
<li>METABRIC Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomic+and+transcriptomic+architecture+of+2%2C000+breast+tumours+reveals+novel+subgroups%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genomic and transcriptomic architecture of 2,000 breast tumours reveals novel subgroups.</a> Nature. 486, 346-352 (2012).</li>
<li>Izadi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Connectivity+in+Colorectal+Cancer+Gene+Expression+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Iranian+Biomedical+Journal%22%5BJournal%5D)">Differential Connectivity in Colorectal Cancer Gene Expression Network.</a> Iranian Biomedical Journal. 23, 34-46 (2019).</li>
</ol>

공개 할 것이 없습니다.

MULTI-seq 의 힘은 여러 실험 조건 또는 모델의 데이터를 원활하게 통합하고 비용 및 배치 효과 제한 측면에서 엄청난 이점을 제공합니다. MULTI-seq 활용은 실험실에서 전례 없는 표현형 깊이를 제공합니다. 세포 해싱 또는 핵 해싱과 같은 비유전자 다중화 방법은 바코드된 항체 7,19,20의 사용을 통해 다중화된 샘플에 대한 문을 열었다. 그러나, 이것은 세포 또는 그들의 핵에서 발현된 표면 단백질을 인식하는 높은 친화성 항체의 가용성에 의존하며, 이는 이들 항체가 이용가능하지 않거나 세포가 적절한 세포 표면 또는 핵 항원(7)을 발현하지 않는 경우에는 가능하지 않을 것이다. MULTI-seq 는 지질 변형 된 올리고 바코드를 사용하여 세포 또는 핵에 안정적으로 통합하기 때문에 연구자는 최대 96 개의 신선하거나...

유전자가 세포 운명에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지 이해하는 것은 질병 및 배아 진행과 같은 과정을 심문하는 데 중요한 역할을합니다. 전사 인자와 그들의 표적 유전자 사이의 복잡한 관계는 유전자 조절 네트워크로 그룹화될 수 있다. 이러한 유전자 조절 네트워크를 진화 계통에 걸쳐 질병과 발달의 중심에 두는 증거가 늘어나고있다1. qRT-PCR과 같은 이전 기술은 단일 유전자 또는 유전자 세트에 초점을 맞추었지만 고처리량 시퀀싱 기술을 적용하면 완전한 세포 전사체의 프로파일 링이 가능합니다.
RNA-seq 는 대규모 전사체 2,3을 엿볼 수 있습니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱 (scRNA-seq)은 조사관에게 전사체를 프로파일 링할뿐만 아니라 특정 세포 유형을 유전자 발현 프로필과 연결하는 능력을 제공합니다4. 이것은 개별 세포 프로파일을 공지된 유전자 마커5를 사용하여 분류 알고리즘으로 공급함으로써 생물 정보학적으로 달성된다. 지질-태그된 인덱스 시퀀싱(MULTI-seq)을 이용한 멀티플렉싱은 수집될 수 있는 scRNA-Seq 프로파일의 수6에서 전례 없는 다양성을 제공한다. 이러한 지질 기반 기술은 원형질막 통합(7) 대신에 표면 항원 및 높은 친화성 항체의 존재에 의존하는 세포-해싱과 같은 다른 샘플 인덱싱 기술과는 다르다. 유전자 발현 프로필을 세포 유형으로 프로파일링할 수 있을 뿐만 아니라 다른 실험을 단일 시퀀싱 라이브러리로 결합할 수 있어 개별 scRNA-seq 실험6의 비용을 획기적으로 낮출 수 있습니다. scRNA-seq 의 비용은 많은 상이한 유전자형, 상태 또는 환자 샘플이 분석되는 표현형 실험에 사용하기에 금지된 것처럼 보일 수 있지만, 멀티플렉싱은 단일 라이브러리6에서 최대 96개의 샘플의 조합을 허용한다.
scRNA-seq 를 통한 유전자 발현 프로파일링은 분자 메커니즘이 세포 운명을 어떻게 지시하는지에 대한 현재의 이해에 혁명을 일으키는 유일한 고처리량 시퀀싱 기반 기술은 아니었다. 세포에 어떤 유전자 전사체가 존재하는지 이해하면 세포 유형을 확인할 수 있지만, 게놈 조직이 발달과 질병 진행을 어떻게 조절하는지 이해하는 것도 똑같이 중요합니다. 초기 연구는 히스톤에 결합하지 않은 서열의 DNase 매개 절단을 검출 한 다음 결과 DNA 단편의 시퀀싱을 수행하여 열린 크로마틴의 영역을 확인하는 데 의존했습니다. 대조적으로, 트랜스포존 접근 가능한 크로마틴 시퀀싱 (scATAC-seq)에 대한 단일 세포 분석은 연구자가 단일 뉴클레오티드 수준8에서 개방 크로마틴을 쉽게 프로파일 링하기 위해 길들여진 트랜스포존으로 DNA를 프로브 할 수있게합니다. 이것은 scRNA-seq 와 유사한 스케일링을 거쳤으며 이제 조사관은 수천 개의 개별 게놈8에 걸쳐 개별 세포 유형 및 프로파일 표현형을 식별 할 수 있습니다.
scRNA-seq 및 scATAC-seq 의 페어링을 통해 연구원은 질병 모델 및 발달 과정 9,10,11,12에서 세포 집단, 게놈 조직 및 유전자 조절 네트워크를 결정하기 위해 수천 개의 세포를 프로파일 링 할 수있었습니다. 여기서 저자는 먼저 MULTI-seq 를 활용하여 무수한 동물 모델의 표현형을 응축하고 쌍을 이루는 scRNA-seq 및 scATAC-seq 를 사용하여 이러한 동물 모델의 크로마틴 풍경 및 규제 네트워크를 더 잘 이해하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>10 & 마이크로; L, 200 &마이크로; L, 1000 &마이크로; L 피펫 필터 팁</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; </td><td>가트너 연구소의</td> M 바코드 솔루션 요청 <td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested =true</td><td></td></tr><tr><td>100% 에탄올</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>100% 메탄올</td><td>Millipore Sigma</td><td>322415-100ML</td><td></td></tr><tr><td>10x 칩 홀더</td><td>10x 유전체학</td><td>1000195</td><td></td></tr><tr><td>10x 크롬 컨트롤러 & 액세서리 키트</td><td>10x Genomics</td><td>PN-120263</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원심분리기 튜브</td><td>품질 생물학</td><td>P886-229411</td><td></td></tr><tr><td>40 &마이크로; m FlowMi 셀 스트레이너</td><td>Bel-Art</td><td>H13680-0040</td><td></td></tr><tr><td>50 &마이크로; M 앵커 솔루션</td><td>시그마 또는 Gartner 연구소의 요청</td><td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested =true</td><td></td></tr><tr><td>50 &마이크로; M Co-Anchor Solution</td><td>Sigma 또는 Gartner lab의 요청</td><td>https://docs.google.com/forms/d/1bAzXFEvDEJse_cMvSUe_yDaP rJpAau4IPx8m5pauj3w/viewform?ts=5c47a897& edit_requested =true</td><td></td></tr><tr><td>5200 단편 분석기 시스템</td><td>Agilent</td><td>M5310AA</td><td></td></tr><tr><td>70 um FlowMi 세포 여과기</td><td>Bel-Art</td><td>H13680-0070</td><td></td></tr><tr><td>Allegra X-12R 원심분리기</td><td>VWR</td><td>BK392302</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>크롬 다음 GEM 칩 G</td><td>10x 유전체학</td><td>PN-1000120</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next GEM Chip H</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000161</td><td></td></tr><tr><td>Chromium Next Gem 단일 세포 ATAC 시약 키트 v1.1</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000175</td><td></td></tr><tr><td>크롬 단일 세포 3' GEM, 라이브러리 및 겔 비드 키트 v3.1</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000121</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind 튜브, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>드라이 아이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVA 폼 아이스</td> 팬 <td>장비</td><td>04393-54</td><td></td></tr><tr><td>FA 12-모세관 Array Short, 33 cm</td><td>Agilent</td><td>A2300-1250-3355</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp 수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-460-20Q</td><td></td></tr><tr><td>Forma CO2 수복 인큐베이터</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤 50% 수용액</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3290-32</td><td></td></tr><tr><td>Hausser Scientific 명시선 계수 챔버</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-671-51B</td><td></td></tr><tr><td>Illumina NextSeq 또는 NovaSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kapa HiFi Hotstart ReadyMix</td><td>HiFi</td><td>7958927001</td><td></td></tr><tr><td>Low TE Buffer</td><td>Quality Biological</td><td>351-324-721</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 용액 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 튜브용 자기 분리기 랙</td><td>Millipore Sigma</td><td>20-400</td><td></td></tr><tr><td>자기 분리기 랙 200 &micro; L 튜브</td><td>10x Genomics</td><td>NC1469069</td><td></td></tr><tr><td>MULTI-seq Primer</td><td>Sigma 또는 IDT</td><td>서열 목록</td><td></td>보기</tr><tr><td>MyFuge Mini Centrifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>C1008</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40 Substitute</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free water</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>P2, P10, P20, P200, P1000 마이크로피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papain 해리 시스템</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>PBS pH 7.4 (1X)</td><td>Fisher Scientific</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Buffer EB</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Refridgerated Centrifuge 5424 R</td><td>Eppendorf</td><td>2231000655</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free 일회용 펠렛 유봉</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus RNase 억제제</td><td>Promega</td><td>N2615</td><td></td></tr><tr><td>RPI 프라이머</td><td>Sigma 또는 IDT</td><td>시퀀스 목록</td><td></td>참조</tr><tr><td>단일 인덱스 키트 N, 세트 A</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000212</td><td></td></tr><tr><td>단일 인덱스 키트 T 세트 A</td><td>10x Genomics</td><td>PN-1000213</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 용액 5 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59222C</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect 시약 키트</td><td>Beckman Coulter</td><td>B23318</td><td></td></tr><tr><td>표준 일회용 이송 피펫</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure PCR 8-튜브 스트립</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>트리즈마 하이드로클로라이드 용액, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2194</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 솔루션, 0.4%(w/v)</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Universal I5 프라이머</td><td>시그마 또는 IDT</td><td>서열 목록</td><td></td>보기</tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>VWR</td><td>10153-838</td><td></td></tr></tbody></table>

scrna-seq 및 scatac-seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석

Multiplexed Analysis of Retinal Gene Expression and Chromatin Accessibility Using scRNA-Seq and scATAC-Seq

강력한 차세대 시퀀싱 기술은 개발 중 및 질병 상태에서 망막 유전자 조절 네트워크가 어떻게 기능하는지 조사하기 위해 강력하고 포괄적 인 분석을 제공합니다. 단일 세포 RNA 시퀀싱을 통해 망막 발달 및 질병에서 관찰 된 유전자 발현 변화를 세포 수준에서 포괄적으로 프로파일 링 할 수 있으며 단일 세포 ATAC-Seq 는 크로마틴 접근성 및 전사 인자 결합의 분석을 유사한 해상도로 프로파일 링 할 수 있습니다. 여기에서 망막 발달에서 이러한 기술의 사용이 설명되고, 개별 샘플이 변형된 올리고뉴클레오티드-지질 복합체로 표지되는 MULTI-Seq 가 입증되며, 연구자가 개별 실험의 범위를 늘리고 비용을 실질적으로 절감할 수 있게 한다.

이 워크플로우는 단일 세포 시퀀싱을 사용하여 발달 표현형 및 규제 프로세스를 조사하기 위한 전략을 제시합니다. MULTI-seq 샘플 멀티플렉싱은 초기 저비용 표현형 분석을 가능하게 하며, scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 샘플의 쌍을 이루어 고정하면 보다 심층적인 조사가 가능합니다(그림 1).
MULTI-seq 바코딩은 여러 샘플의 결합 된 시퀀싱과 후속 계산 디컨볼루션을 가능하게합니다. 기원의 샘플은 그들의 바코드 발현에 기초하여 각 세포에 대해 결정될 수 있다(도 2A). 이러한 결합된 샘플은 셀 클러스터링 및 셀 유형 식별을 위해 단일 데이터 세트로 분석될 수 있습니다(그림 2B). 각 세포는 GEM 생성 전에 바코드되기 때문에, 세포 이중항은 다수의 MULTI-seq 바코드에 대한 발현을 나타낼 ...

여기에서, 저자들은 망막에서 전사체 및 크로마틴 접근성 프로파일을 특성화하는데 있어서 표현형 및 후속 쌍을 이룬 scRNA-seq 및 scATAC-seq 에 대한 MULTI-seq 의 유용성을 보여준다.

scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석

Powerful next generation sequencing techniques offer robust and comprehensive analysis to investigate how retinal gene regulatory networks function during ...

이 프로토콜은 초기 표현형을 위해 단일 세포 RNA-seq의 사용을 가능하게 합니다. 그리고 단일 세포 ATAC-seq와 쌍을 이루면 유전자 조절 네트워크가 재구성됩니다. MULTI-seq를 사용하면 초기 조사 비용이 낮게 유지되고 단일 세포 RNA-seq 및 단일 세포 ATAC-seq에 대해 쌍을 이루는 샘플을 고정하면 유전자 조절 네트워크의 시간 경과 분석이 가능합니다.조사관은 이 프로토콜을 활용하여 발달 및 질병 진행을 제어하는 유전 네트워크를 이해할 수 있습니다. 시작하려면 각 샘플에 20마이크로리터의 앵커 바코드 용액을 추가하고 피펫으로 혼합하여 혼합합니다. 얼음 위에서 5 분 동안 배양하십시오.그런 다음 각 샘플에 20 마이크로 리터의 공동 앵커 용액을 추가하고 얼음에서 5 분 더 배양합니다. 각 샘플에 얼음처럼 차가운 1%BSA 및 PBS 1밀리리터를 추가하고 섭씨 4도에서 5분 동안 300 x g에서 세포를 원심분리합니다. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거한다.그런 다음 400 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 1 % BSA와 PBS를 첨가하십시오. 섭씨 4도에서 5분 동안 300 x g로 원심분리합니다. 혈구계를 사용하여 각 샘플의 세포 농도를 결정하고 겔 비드 인 에멀젼 또는 GEM에 필요한 총 세포 수와 부피를 계산합니다.각 샘플에서 계산된 부피를 새로운 멸균 1.5 밀리리터 튜브에 결합하고 결합된 샘플의 최종 세포 농도를 결정합니다. GEM 생성 및 바코딩 후, 크기 선택을 사용하여 유전자 발현 cDNA 클린업을 수행하고, 샘플 바코드가 포함된 첫 번째 선택 라운드에서 상청액을 버리지 않도록 합니다. 상청액을 새로운 멸균 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮기고 얼음에 보관하십시오.상자성 비드 기반 크기 선택 시약을 와동시키고, 260 마이크로리터의 시약 및 180 마이크로리터의 100% 이소프로판올을 상청액에 첨가한다. 혼합물을 10 번 피펫팅하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오. 튜브를 마그네틱 랙에 놓고 용액이 깨끗해질 때까지 기다립니다.용액이 깨끗해지면 상청액을 제거하고 폐기하십시오. 500 마이크로 리터의 80 % 에탄올을 비드에 30 초 동안 첨가 한 다음 상청액을 버립니다. 총 두 번 세척 할 때이 작업을 반복하십시오.비드를 간단히 원심 분리하고 마그네틱 랙으로 되돌립니다. 타이머를 2분으로 설정합니다. 그런 다음 P10 피펫으로 잔류 에탄올을 제거하고 나머지 2분 동안 마그네틱 랙에서 비드를 자연 건조시킵니다.마그네틱 랙에서 비드를 제거하고 100마이크로리터의 용리 버퍼에 재현탁합니다. 피펫을 완전히 재현탁하고 실온에서 2분 동안 배양한 다음 비드를 마그네틱 랙으로 되돌리고 용액이 투명해질 때까지 기다립니다. 상청액을 새로운 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브로 옮깁니다.용리 버퍼 부피의 절반을 사용하여 설명된 대로 정리를 반복합니다. scATAC 시퀀스로 향하는 샘플의 경우 P200 피펫을 사용하여 마이크로 원심분리 튜브에서 액체를 제거하고 에탄올 드라이 아이스에서 샘플을 급속 동결합니다. scRNA 시퀀싱으로 향하는 샘플에서 세포를 해리하려면 텍스트 원고에 설명된 대로 파파인을 사용하여 해리 단계를 수행합니다.세포를 실온에서 3분 동안 300 x g으로 원심분리하고, 세포 펠릿을 방해하지 않고 상청액을 제거한다. 식힌 PBS 1 밀리리터를 넣고 10 회 또는 세포가 완전히 현탁 될 때까지 혼합합니다. 다시, 섭씨 4도에서 5분 동안 300 x g에서 원심분리하고, PBS로 세척을 2회 반복한다.최저 속도 설정에서 튜브를 소용돌이 치고 900 마이크로 리터의 냉각 메탄올을 한 방울 씩 첨가하면서 튜브를 부드럽게 와류하여 세포가 뭉치는 것을 방지합니다. 세포를 얼음 위에서 15 분 동안 배양하십시오. 혈구계를 이용하여 고정된 세포의 농도를 결정하고, 트리판 블루를 이용하여 고정 단계의 효능을 평가하였다.냉동 된 조직과 고정 된 세포를 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. MULTI 시퀀스 바코드는 여러 샘플의 결합된 시퀀싱과 후속 계산 디콘볼루션을 가능하게 합니다. 원산지 샘플은 바코드 표현식을 기반으로 각 셀에 대해 결정될 수 있습니다.이러한 결합된 샘플은 세포 클러스터링 및 세포 유형 식별을 위해 단일 데이터 세트로 분석할 수 있습니다. 각 세포는 GEM 생성 전에 바코드되기 때문에 세포 이중선은 여러 MULTI 서열 바코드에 대한 발현을 나타낼 가능성이 높으므로 클러스터링 및 세포 유형 식별 전에 대부분의 이중선을 식별하고 제거할 수 있습니다. 단일 세포 ATAC 시퀀싱을 사용하여 단일 세포 RNA 시퀀싱에서 찾은 것과 일치하는 세포 유형의 데이터 세트를 생성할 수 있습니다.단일 세포 RNA 시퀀싱 유전자 발현과 단일 세포 ATAC 시퀀싱 DNA 접근성 정보의 쌍은 유전자 조절 네트워크의 재구성을 가능하게 합니다. 프로토콜을 시도할 때 에놀 증발의 2분 타이밍이 후속 용리 단계에서 서열 검색에 중요하다는 점을 명심하십시오. 쌍을 이루는 단일 세포 RNA-seq 및 단일 세포 ATAC-seq를 사용하여 유전자 조절 네트워크를 재구성하면 유전자 과발현 및 녹아웃 연구를 위한 표적이 생성됩니다.이 단계에서 MULTI-seq를 사용하여 세포 유형 특이적 효과를 확인할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

효모에서이 프로토콜에서 유전자 발현...

Microarray 분석을위한 Saccharomyces cerevisiae</em

단일 망막 세포와 그 cDNAs의 후속 증폭의 절연을위한 방법을 설명합니다. 단일 세포 transcriptomics는 조직의 세포 이질 선물의 정도를 보여 희귀 세포 집단에 대한 새로운 마커 유전자를 알게되어. 동반 프로토콜은 다양한 세포 유형에 맞게 조정할 수 있습니다.

개발하고 성숙한 망막 신경 세포의 단일 세포 프로 파일링

Synthetic Yeast Genome 프로젝트인 Sc2.0의 디자이너 염색체는 존재/부재 종말점이 있는 PCRTagging이라는 PCR 기반 유전형 분석 분석을 사용하여 네이티브 염색체와 구별할 수 있습니다. 여기에서는 PCRTag 유전형 분석을 위한 고처리량 Real-Time PCR 검출 방법에 대해 설명합니다.

qPCRTag 분석 - 높은 처리량, Sc2.0 유전형에 대한 실시간 PCR 분석

유전자 발현, 돌연변이 및 유전자 융합에 대해 선택된 전사체를 조사하기 위한 데이터 분석을 사용한 색인화된 cDNA 라이브러리 준비, 혼성화 및 캡처를 포함하는 표적 RNA 염기서열분석 기반 방법을 설명합니다. Targeted RNAseq를 사용하면 데스크톱 염기서열분석기에서 선택된 전사체를 비용 효율적이고 신속하게 평가할 수 있습니다.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다.

망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq

높은 처리량 시퀀싱 (ATAC-seq)와 결합 하 여 염색 하는 Transposase 액세스할 수 질에 대 한 분석 결과 액세스할 수 chromatin를 폭로 하는 게놈 넓은 방법입니다. 이 인간의 세포 (Th1/Th2)에 최적화 된 최종 계산 분석, 분자에서 단계별 ATAC seq 프로토콜입니다. 이 프로토콜 차세대 시퀀싱 방법 사전 경험 없이 연구자에 의해 채택 될 수 있다.

ATAC Seq에 의해 기본 인간 T 림프 톨에 게놈 넓은 접근 Chromatin 매핑

여기에서 우리는 마우스 배아 조직에서 유전자 발현을 프로파일링하는 다중단일 세포 mRNA 염기서열 분석방법을 제시했다. 멀티플렉싱 전략과 결합된 액적 기반 단일 세포 mRNA 염기서열 분석(scRNA-Seq) 방법은 여러 샘플에서 단일 세포를 동시에 프로파일링할 수 있어 시약 비용을 크게 줄이고 실험 배치 효과를 최소화합니다.

마우스 배아 세포의 다중화 단세포 mRNA 염기서열 분석

ATAC-seq는 과민성 돌연변이 트랜스포자제 Tn5를 사용하여 전사 인자에 의해 매개되는 염색질 접근성의 변화를 매핑하는 DNA 시퀀싱 방법입니다. ATAC-seq는 암세포의 표현형 변화의 기초가되는 분자 메커니즘의 발견을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 암세포를 포함한 상피 세포 유형에서 ATAC-seq에 대한 최적화 절차를 간략하게 설명합니다.

암 후성유전학 연구를 위한 ATAC-Seq 최적화

여기서는 30 μL 벌레 펠릿만을 사용하여 L4 단계 Caenorhabditis elegans 전체충에 구현할 수 있는 빠르고 간단한 ATAC-seq 프로토콜을 제시합니다.

Caenorhabditis Elegans L4 유충 전체에서의 염색질 접근성 프로파일링

본 연구는 조직 절편의 직접 공간 바코딩과 단일 세포 다중옴 분석을 결합한 공간적 Trekker–CUT&amp;Tag 멀티옴 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 유전자 발현과 히스톤 H3K27ac 변형의 공간적으로 분리된 단일 세포 프로파일링을 동시에 가능하게 하여, 조직 미세해부학 맥락에서 유전자 조절에 대한 기전적 통찰을 제공합니다.

냉동 조직 절편에서 전사체 및 후생유전체 표적의 공간적으로 분리된 단일 세포 통합 다중체체 프로파일링

학습하세요 망막 세포의 전사체 및 크로마틴 접근성을 분석하는 scRNA-seq와 scATAC-seq 다중화 방법을. 이 프로토콜은 유전자 조절 네트워크 재구성과 발달 및 질병 연구에 활용됩니다.

scRNA-Seq 및 scATAC-Seq 를 이용한 망막 유전자 발현 및 크로마틴 접근성의 다중화 분석

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