Name: 미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 학습하세요 Caenorhabditis elegans에서 ZebraLab과 WormScan을 활용한 반자동화 운동 활동 정량화 방법을 통해 미토콘드리아 질환 모델의 약물 스크리닝을 효율적으로 수행하는 기술을.

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이 프로젝트의 초기 준비에 대한 조직적 지원과 프로토콜 분석에 기여한 에린 하우스(Erin Haus)에게 감사드립니다. 이 작품은 줄리엣의 치료 FBXL4 미토콘드리아 질병 연구 기금, Jaxson Flynt C12ORF65 연구 기금 및 국립 보건 원 (R01-GM120762, R01-GM120762-08S1, R35-GM134863, 및 T2303-NS1307)에 의해 투자되었다. 콘텐츠는 전적으로 저자의 책임이며 반드시 기금 모금자 또는 국립 보건 원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

1. ZebraLab 소프트웨어를 사용하여 유리 슬라이드에 액체 매체의 웜 운동 활동 분석
<ol><li>선충 성장 및 취급<ol>
<li>선충 성장 미디어 (NGM)를 포함하는 페트리 플레이트에 C. elegans를 성장하고 음식 소스로 Escherichia 대장균 OP50으로 확산. 이전에 설명된바와같이 20°C에서 웜 배양을 유지한다.</li>
		<li>시간 제달 을 수행하는 벌레를 동기화52 원하는 단계에서 벌레를 연구. 이 프로토콜에서 L4 단계 웜을 분석했습니다.</li>
		<li>테스트 또는 버퍼 컨트롤을 테스트할 약물 치료 유무에 관계없이 NGM 플레이트에서 제어 및 돌연변이 웜 균주를 증가시보냅니다. 약물 치료 효과를 평가하기 위해, S. 기저 용액에서 원하는 약물 재고 농도를 준비; 계산된 특정 부피를 NGM 플레이트에 분산시키고 건조시다. 특정 애벌레 또는 성인 단계에서 벌레를 옮기고 분석 전에 원하는 기간 동안 약물 치료 플레이트에 유지하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>운동 활동 비디오 녹화 및 ZebraLab 분석을 위한 웜의 실험 설정<ol>
<li>웜 픽을 사용하여 변형 및 조건당 동기화된 L4 웜 5개를 선택합니다. 카메라에 연결된 스테레오현미경 아래에 위치한 유리 슬라이드에 S. 기저용 액의 단일 20 μL 방울을 파이펫으로 전송하여 5개의 웜을 전달합니다(그림1A,B). NGM 및 대장균 OP50이 함유된 페트리 접시에서 레코딩 전 순간에만 액체 낙하로 5개의 웜을 전송합니다. 참고: 이전 비디오가 녹화될 때까지 페트리 접시의 다른 웜을 계속 유지합니다. 이것은 시술 도중 20 μl 방울의 건조로 인하여 그밖 벌레에 생기는 손상을 피할 것입니다 (건조 시간 ~15-20 분).</li>
		<li>파이펫은 여러 개의 기술 복제를 얻기 위해 한 슬라이드에 여러 방울을 떨어뜨립니다(그림1A). 다른 NGM 플레이트(생물학적 복제)에서 웜을 선택합니다. 커버 슬립을 사용하지 마십시오.</li>
		<li>현미경의 작업 거리를 조정하여 단일 낙하의 전체 영역을 시각화합니다. 소프트웨어에서 파일을 업로드하려면 낮은 비디오 해상도(<1024 x 768)를 설정하고 유지 관리합니다.</li>
		<li>기록하기 전에 웜이 실온에서 슬라이드에 1 분 동안 적응하도록 허용합니다.</li>
		<li>초당 15 프레임 (fps)에서 1 분 동안 1 방울로 웜 수영 활동을 기록합니다. 플레이트의 각 추가 드롭에 대한 이미징을 반복합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>ZebraLab 소프트웨어의 C. 예레간 운동 활동 기록 분석<ol>
<li>ZEBRALAB AVI 옵션을 사용하여 소프트웨어에 동영상을 업로드합니다. AVI파일(그림 1C)을 사용하던 옵션 정량화를 클릭합니다.</li>
		<li>새 프로토콜을 만들려면 파일 > 생성 프로토콜을선택한 다음 분석에 대해 선택한 영역 수를 추가합니다. 위치 수 선택: 1.</li>
		<li>프로토콜 매개 변수를 열고 실험 기간 창에서 1분 을 선택합니다. 다른 실험 기간에 대해 다른 실험 기간을 선택합니다. 원하는 데이터 출력에 따라 시간 없음 창을 선택하거나 선택 해제하고 통합 기간을선택합니다. 본 연구에서는 시간빈이 선택되지않았다(도 1D). 참고: 시간 저장소는 활동이 평균화되는 시간입니다.</li>
		<li>프로토콜이 이미 생성된 경우 열기 프로토콜을 선택하고 저장된 프로토콜(.vte 형식으로)을 선택합니다.</li>
		<li>파일을 선택하고 동영상을 열어 이전에 기록된 각 개별 비디오 파일을 업로드합니다.</li>
		<li>그림 1E(검정 화살표)에 표시된 영역 아이콘을 선택하여 단일 감지 영역을 구축하고 웜이 있는 전체 액체 낙하 주위에 영역을 만듭니다. 선택,>클리어 마크를 빌드 > 영역 아래 녹색 원 아이콘 (회색 화살표)을 클릭합니다. 참고: 정의된 낙하내의 모든 웜의 활성은 선택한영역(도 1E,F)에서검출됩니다.</li>
		<li>보정 > 그리기 척도(그림1E)로이동하여 비디오 영역의 왼쪽에서 오른쪽으로 가로선을 그립니다. 보정할 실제 거리를 나타냅니다. 그런 다음 그룹에 적용을 선택합니다.</li>
		<li>영역을 빌드하도록 선택한 아이콘을 선택 취소하고(그림 1E의화살표) 투명을선택하거나 선택 해제합니다. 참고: 이 연구에서투명을 선택하여 더 나은 결과를 얻었습니다.</li>
		<li>검출 감도 및 활동 임계값을 조정하여 분석된 모든 다른 C. elegans 웜 균주를 감지할 수 있습니다. 참고: 이 실험에서 검출 감도는 각각 15 및 2의 버스트 및 동결 값으로 8로 설정되었습니다(그림1F).</li>
		<li>활동 분석이 진행되는 동안 동물이 만든 트랙을 시각화하기 위해 디스플레이 스케일을 70으로 설정합니다. 그런 다음 그룹에 적용을 선택합니다(그림1F).</li>
		<li>실험 > 실행 > 저장한다음 시작시 를 클릭합니다. 창이 열립니다. 비디오를 빠르게 분석하기 위해 비디오 미디어를 최대 컴퓨터 속도로 처리하시겠습니까(예: ZebraLab 소프트웨어에서 5초 만에 1분 비디오 녹화를 분석).</li>
		<li>다른 창이 열립니다: 실험 실행; 실험을 진행하려면 시작 시작을 클릭합니다.</li>
		<li>비디오 녹화가 완료되면 분석이 중지됩니다. 실험을 클릭> 중지. 이렇게 하면 스프레드시트에서 한 방울만 떨어뜨리면 분석된 활동이 저장됩니다.</li>
		<li>개별 드롭의 각 비디오에 대한 분석을 반복합니다. 각 드롭은 하나의 기술적 복제입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>ZebraLab 데이터의 출력 및 분석 참고: 실험 후 각 비디오의 데이터는 선택한 폴더에 별도의 스프레드시트로 개별적으로 저장됩니다. 데이터 출력 파일에서 개별 드롭으로 이동하는 모든 웜의 통합 된 활동 수준은 actinteg에서 픽셀 변경으로 기록됩니다.<ol>
<li>각 비디오의 분석에서 얻은 각 스프레드시트를 엽니다. 수동으로 단일 파일로 컴파일합니다. 돌연변이 및 야생 형 데이터를 제어의 백분율로 정규화합니다. 여기서 통계 분석은 그룹 간의 평균 활동 수준을 비교하기 위해 수행되었습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 웜스캔 소프트웨어 분석에 의한 96웰 플레이트 형식의 액체 매체의 웜 운동 활성 분석
<ol><li>선충 성장 및 취급<ol>
<li>섹션 1.1.1에 설명된 대로 C. 예인단을 성장시보아.</li>
		<li>섹션 1.1.2에 설명된 대로 웜을 동기화합니다.</li>
		<li>L4 스테이지 또는 1일성인이 될 때까지 섹션 1.1.3에 설명된 대로 특정 미디어에서 웜을 증가시다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>WormScan 활동 분석을 위한 96웰 플레이트에 웜의 실험 설정<ol>
<li>이전에설명된바와 같이, 96-well, 맑고, 평평한 바닥, 마이크로 플레이트의 각 웰에 S. 기저 배지에 E. 대장균 OP50의 부피당 2%의중량의50μL을 추가한다.</li>
		<li>스테레오 현미경으로, 수동으로 선택 15 L4 단계 또는 일 1 성인에서 그들의 NGM 플레이트에서 액체 매체에 96 잘 마이크로 플레이트의 각 실험 우물 내에서. 벌레가 스캔하기 전에 20 분 동안 액체 미디어에 적응하도록 허용하십시오. 참고: 다른 동물 단계와 나이는 연구를 위해 쉽게 대체 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>96웰 플레이트의 WormScan 활동 분석 및 데이터 내보내기스프레드시트.<ol>
<li>표준 평판 스캐너를 사용하여 96웰, 투명하고 평평한 마이크로 플레이트를 각각 스캔하여 스캔 사이에 10초 미만이 됩니다. 참고: 여기서 1,200개의 점/인 및 16비트 그레이스케일의 해상도가 있는 사진 스캐너가 jpeg 이미지를 생성하는 데 사용되었습니다. 사진 스캐너를 사용하여 96웰 플레이트 4개를 스캔하는 데 필요한 시간은 10분 미만입니다.</li>
		<li>오픈 소스소프트웨어(49)를사용하여 두 개의 순차스캔(그림 2A)을정렬합니다. 참고: 이 소프트웨어는 관심영역(그림 2B)과상대 웜스캔 점수에대한 두 순차적 이미지 간의 픽셀 변화를 평가하기 위해 차이 이미지를 생성합니다. 이 웜스캔 점수는 스캐너가5(그림 2C)로설정할 때 스캐너에서 생성한 광 강도에 따라 운동 반응의 변화와 동일하다.</li>
		<li>WormScan에서 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다. 데이터가 포함된 스프레드시트를 로컬 컴퓨터에 저장합니다. 제어를 위한 백분율로 데이터를 정규화하고 다양한 돌연변이 또는 치료 조건에 대한 생물학적 복제 실험을 비교합니다. 통계 분석을 수행하여 학생 t-test를사용하여 돌연변이 및 제어 수단을 비교합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

M.L., N.D.M. 관련 재무 공시가 없습니다. M.J.F.는 미토쿠레아, Inc.의 공동 창립자이며, 리보노바, Inc.에 대한 지분 지분을 가진 과학 자문 위원회 위원, 콘드리온과 라리마르 테라피의 유료 컨설턴트로 과학 이사회 위원입니다. M.J.F.는 이전에 또는 현재 유료 컨설턴트로 미토콘드리아 질환 치료 전임상 및 / 또는 임상 단계 개발에 관련된 여러 회사와 종사하고있다 (아스텔라스 [이전 미토 브리지] 제약 Inc., 사이클리온 치료제, 에피리움 바이오, 이멜 치료제, 미노비아 치료제, NeuroVive, Reneo 치료제, 스텔스 바이오테라피, 조게닉스, Inc.) 및/또는 후원하는 연구 협력자(AADI 치료제, 카르데로 치료제, 사이클리온 치료제, 이멜 치료제, 미노비아 치료제, 미션 테라피, NeuroVive, 랩터 치료제, REATA Inc., 리보노바, 스탠디그알 치료제 및 스텔스 바이오테라피(BioTherapeutics).

여기에서, 연구 결과는 벌레 분쇄, 운동, 인두 펌핑 및 화학 요법을 포함하여 다양한 결과의 수준에서 C. elegans 신경 근육 활동을 공부하기 위한 상세한 정보 및 근거를 요약했습니다. 16개의 상이한 활동 분석 방법론의 비교는 다른 연령 및 실험 기간에 단일 웜 또는 웜 집단에서 정량화선충 활동의 상대적 처리량, 장점 및 한계의 관점에서 수행되었다. 이 중, 반자동 분석의 두 가지 새로운 적응 및 응용 프로그램은 L4 애벌레 발달 단계에서 애벌레 단계 와 1 일째에 잘 확립 된 미토콘드리아 복합 I 질환 C. elegans 균주, 가스-1(fc21)WT 대조군에서 유의한 감소를 보여주기 위해 강조되었다.
특히, C. 신경근육 기능 및 운동 활동은 WT 웜 운동이 부비동파 패턴에서 매우 규칙적이기 때문에 고체 매체에서 광범위하게 연구되고 있다. 그들의 정규 이동 경로 및 속도의 이상은 종종 낮은...

Caenorhabiditis elegans는 결합, 먹이 주기, 계란 누워, 배변, 수영 및 고체 매체1에서운동을 포함한 모든 웜 행동을 조정하는 302 개의 뉴런을 가진 신경 과학에서 뛰어난 모델로 널리 인정받고 있습니다. 이러한 헤마필로디컬 선충은 또한 C. elegans와 인간 사이의 ~80% 유전자의 잘 특징적인 게놈 및 높은 homology에 의해 가능하게 된 다양한 인간 질병 메커니즘을 이해하는 데 널리 사용된다2,3,4. C. elegans는 오랫동안 인간 미토콘드리아 질환5,6,7,8,9,10을심문하는 데 사용되어 왔으며, 이는 세포 에너지를 생성하기 위해 손상된 용량을 공유하는 유전적 및 변종성 대사 장애의 유전적 및 현상전형 이질적인 그룹이며, 종종 실질적으로 손상된 신경 근육 기능, 운동 편협 및 피로 111로 임상적으로 존재하는 것으로 나타났습니다. ,12,13,14. 이를 위해 C. elegans 모델을 사용하면 미토콘드리아 질환의 다른 유전 적 특수형에서 동물 활동 및 신경 근육 기능의 양적 측면과 신경 근육 기능의 전임상 모델링뿐만 아니라 신경 근육 기능 및 전반적인 활동을 향상시킬 수있는 후보 치료에 대한 반응을 가능하게합니다.
C. elegans의 신경 근육 활동은 고체 또는 액체 매체에서 기능 분석을 허용하는 수동 및 반자동 접근법을 모두 포함하는 다양한 실험 방법론에 의해 객관적으로 측정할 수있습니다(표 1)1,15. C. elegans 활동의 정확한 양은 근육 및 신경계 의 기능 및 발달과 관련된 발견을 가능하게 하는 것이 중요하다는 것을 입증하였다16,17,18. 이 연구는 C. elegans 질병 모델의 4가지 주요 결과에 대한 신경 근육 기능 및 활동을 평가하기 위해 연구 실험실에서 수행 될 수있는 17 가지 분석술의 실험 요구 사항, 장점 및 한계뿐만 아니라 후보 치료에 대한 응답으로 요약하고 비교합니다(표 1 ). 실제로, 이 연구는 C. elegans 스래싱(분당 몸 굽힘), 운동 활동, 인두 펌핑 및 화학 요법의 비율을 특성화하기 위해 사용 가능한 실험 적 접근법의 범위에 대한 상세한 개요를 제공하여 각 방법의 장점과 한계, 각 방법의 장점과 한계, 각 방법의 장점과 한계, 장비 및 소프트웨어를 수행하고 분석하는 데 필요한 각 사례에 제공합니다. 및 각 방법의 처리량 용량은 고처리량 유전 또는 약물 스크리닝 목적으로의 사용을 지원합니다. 각 분석법의 처리량 용량은 웜 유지 관리, 처리 시간, 단일 또는 다중 웰 플레이트의 사용 및/또는 실험자 시간을 포함하여 실험 프로토콜 복잡성에 기초하여 저, 중간 또는 높은 것으로 설명되며, 실험 설정 및 데이터 분석을 완료하는 데 필요한 실험시간.
스래싱19,운동활성(20,인두 펌핑17,21,및 화학요법22,23)의 수동 분석은 스테레오현미경(24)이필요한 웜 활성을 평가하기 위한 잘 확립된 방법론이다. 벌레의 스래싱 활성을 측정하는 동안 분당 신체 굴곡의 주파수를 결정하기 위해 액체 매체에서 분석이 필요하지만, 웜 운동 활동은 고체 매체 또는 액체 매체에서 측정될 수 있습니다. 그러나 개별 웜 활동에 대한 수동 분석은 본질적으로 시간이 많이 소요되며 피할 수 없는 사용자 생성 편향이 수반됩니다. 웜 활동 분석의 자동화는 사용자 생성 편향을 최소화하고 실험처리량(25)을크게 증가시킬 수 있다. 액체 미디어에서 웜 스래싱 활동의 비디오 녹화는 wrMTrck, ImageJ 플러그인(26)을사용하여 분석 할 수 있습니다. 그러나 wrMTrck을 위해 개발된 원래 실험 설정은 단일 액체 낙하에 너무 많은 웜이 웜이 겹쳐정확한 추적을 어렵게 만들었기 때문에 유틸리티를 제한했습니다. 이러한 실험적 한계가27로해결되었지만 wrMTrck 방법은 고처리량 스크리닝을 지원할 수 없습니다.
C. elegans 미토콘드리아 질병 모델의 후보 치료에 대한 반응으로 기준선에서 웜 운동 활성을 정량화하는 다양한 방법이 존재한다. 여기에는 ZebraLab(뷰포인트 생명 과학), 티어셉시 트래커28,넓은 시야 선충 추적 플랫폼(WF-NTP)29,웜모텔, 웜워워서30,웜랩31,인피니티 칩32,WMicrotracker One33(표 1)이포함됩니다. 이러한 방법은 다중 웜 균주 또는 조건에서 운동을 동시 분석할 수 있게 해주며, 일반적으로 다중 웰 플레이트에서 더 높은 처리량 약물 스크리닝 응용 프로그램을 지원합니다. 이러한 방법 중 일부는 고가의 장비와 오픈 액세스 소프트웨어의 필요성, 실험 프로토콜 수행의 다양한 용이성 등 일반 유틸리티를 제한하거나 향상시킬 수 있는 고유한 고려 사항이 있습니다. 전반적으로 단일 실험 시스템이나 프로토콜이 모든 C. 예르간 운동 활동 실험에 이상적으로 적합하지 않습니다. 오히려 특정 조사자의 실험 목표와 요구 사항에 가장 적합한 방법을 신중하게 선택하는 것이 중요합니다.
인두 펌핑은 C. elegans에서신경 근육 활동을 평가하는 또 다른 중요한 결과를 나타냅니다. C. 엘레간인인은 20개의 근육 세포, 20개의 뉴런 및 20개의 다른 세포로 구성되어 있어 벌레의 성우34,35,36의전방 끝에 에슈리치아 대장균(E. coli)을섭취할 수 있다. 인두 펌핑 비율 17,21,37,38을결정하기 위한 몇 가지 수동 방법이 수립되었다. 대부분의 방법은 실험관찰자(21)에의해 직접 계수하여 인두 펌핑 주파수를 시각화하고 기록하는 스테레오현미경 및 카메라를 사용하는 것을 기반으로 한다. 자동화된 인두 펌핑 속도 분석은 각펌프(39)의지속 기간에 대한 추가 정보를 제공하는 세포외 기록인 전기파린지오그램(EPG)을 수행함으로써 가능하다. 개별 웜이 챔버40,41에국한되는 미세유체 시스템인 WormSpa에서도 인두 펌핑 속도 분석이 가능하다. 인두 펌프 속도의 분석을 용이하게 하는 상용 방법은 맞춤형 칩에 고정된 단일 웜에서 공급 동작의 신경 근육 측면을 측정, 시각화 및 분석하는 ScreenChip System(InVivo Biosystems)입니다. 이러한 인두 펌핑 수량 접근법은약물, 노화 및 기타요인42,43,44,45에대한 뉴런 및 생리적 반응을 평가하는 데 사용될 수 있다.
화학요법은 선충 성장 매체(NGM) 플레이트의 정의된 영역에서 벌레로부터 떨어진 악취에 대응하여 C. 엘레건의 움직임을 설명합니다. 화학요법 반응을 평가하는 것은 정의된기간(46)에서벌레가 악취를 향해 이동하는 물리적 거리를 관찰하고 측정함으로써 정량화가능한 벌레 뉴런 및 신경근육 활성의 통합측정을 제공한다. 멀티 웜 트래커는 웜이 유인제 또는격퇴제(47)를향해 이동하는 거리를 정량화하는 실험 효율을 향상시키는 데 사용할 수 있는 자동 방법입니다.
여기서, 웜 활성을 정량화하기 위해 확립된 두 개의 새로운 반자동 방법에 대한 상세한 프로토콜이 설명된다. 첫 번째 접근법은 원래 다리오 리리오 (제브라피쉬)의 수영 활동을 연구하기 위해 개발 된 상용 소프트웨어를 활용하며, 움직임 중 픽셀 변화에 따라 C. elegans의 액체 매체에서 전체 운동 활동을 정량화하는 새로운 중간 처리량 응용 프로그램을 사용합니다(표 1, 그림 1). 이 방법은 다중 웰 플레이트 형식에 적합하지 않지만 데이터 출력은 유리 슬라이드에서 분석된 많은 수의 동시 조건 및 샘플에서 빠르게 가져옵니다. 두 번째 접근법은 Flatbed 스캐너를 사용하여 오픈 소스 소프트웨어와 함께 다양하게 사용할 수 있는 두 가지 순차 적 스캔의 차분이미지를 생성하여 fecundity 및 생존과 같은 통합 생리적 결과의 반자동 정량분석을 가능하게 하는 WormScan 방법론48,49 (그림 2)의새로운 적응입니다. 여기서, 96-well의 우물 당 15 개의 애벌레 단계 4 (L4) 벌레의 인구에서 액체 미디어에서 웜 운동 활성을 정량화하는 WormScan 방법론의 새로운 높은 처리량 적응이 개발되었다. 이 반자동 및 저비용 WormScan 방법론은 고처리량 약물 스크린뿐만 아니라 다양한 동물 단계와48세,49세의 분석에 쉽게 적응 할 수 있습니다.
여기서, ZebraLab과 WormScan 반자동 방법을 모두 사용하여 C. elegans locomotor 활성을 분석하는 프로토콜 및 효능은 미토콘드리아 복합 I 질환, 가스-1(fc21)에 대한 잘 확립된 C. elegans 모델에서 입증된다. 가스-1(K09A9.5 유전자)은 인간 NDUFS2(NADH: 유비퀴논 옥시도레덕타제 코어(철황 단백질) 서브유닛 2)의 직통술이다(도3). C. elegans gas-1(fc21)돌연변이 균주는 NDUFS250의인간 정형소로에서 균질 p.R290K 잘못된 감지 돌연변이를 운반하고, 현저히 감소된 대변과 수명, 손상된 호흡기 사슬 산화 인산화(OXPHOS) 용량51,및 소균성 및 8의 증가미토콘증및 수막을 통해 증가된 미토콘드(8) 증액 . 미토콘드리아 질환을 연구하기 위해 지난 2년간 잘 확립된 사용에도 불구하고 가스-1(fc21)돌연변이의 운동 활성은 이전에 보고되지 않았다. 여기서 ZebraLab 및 WormScan 방법은 야생형(WT, N2 Bristol) 웜과 비교하여가스-1(fc21)의운동 활성을 독립적으로 정량화하기 위해 적용되었으며, 둘 다 방법을 검증하고 실험 프로토콜 및 정보학 분석의 비교 유틸리티 및 효율성을 입증하는 방법으로서. ZebraLab 소프트웨어는 표적 약물 선별 또는 유효성 검사 연구를 위한 잠재적인 응용 프로그램과 함께 C. elegans 미토콘드리아 질병 모델에서 여러 동시 질환의 여러 동시 상태를 신속하게 허용했습니다. 특히 WormScan 분석은 화합물 라이브러리의 고처리량 약물 스크린을 쉽게 활성화하고 1차 미토콘드리아 질환의 전임상 C. elegans 모델에서 동물 신경 근육 기능 및 운동 활동을 향상시키는 리드의 우선 순위를 정하는 데 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>C. elegans 야생 분리&</td><td>nbsp; Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>N2 Bristol</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>gas-1(fc-21)</td><td>CGC</td><td>CW152</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>ThermoFisher</td><td>4951PLUS</td><td></td></tr><tr><td>선충 성장 배지 (NGM)</td><td>Research Products International Corp.</td><td>N81800-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>OP50 대장균</td><td>CGC</td><td></td><td>Uracil auxotroph E. coli 스트레인</td></tr><tr><td>페트리 접시 (60 mm)</td><td>&nbsp; VWR 국제</td><td>25373-085</td><td></td></tr><tr><td>S. 기초</td><td>VWR 5.85 g NaCl, 1 g K2 HPO4, 6 g KH2PO4, 그리고 5 mg 콜레스테롤, 1 l H2O VWR</td><td>101175-162, 103467-156, EM1.09828.1000, 97061-660</td><td></td></tr><tr><td>스캐너</td><td>EPSON</td><td>V800</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경</td><td>Olympus</td><td>MVX10 현미경</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플랫 바텀</td><td>&nbsp; VWR international</td><td>29442-056</td><td></td></tr><tr><td>WormScan 소프트웨어</td><td>Mathew et al. 45</td><td>S1 스캔</td>된 <td>플레이트의 차이 이미지 자동화를 위한</td>독립형 Java 플랫폼 소프트웨어</tr><tr><td>ZebraLab 소프트웨어</td><td>ViewPoint ViewPoint</td><td></td><td>(http://www.viewpoint.fr/en/p/software/zebralab-zebrafish-behavior-screening)에서 설계한 제브라피시 동작의 자동 양자화 및 추적을 위한 소프트웨어 및 여기서는 C. elegans에 적용됩니다. 이 시스템은 고처리량 동작 분석에 적용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

Comparative Analysis of Experimental Methods to Quantify Animal Activity in Caenorhabditis elegans Models of Mitochondrial Disease

Caenorhabditis elegans는 다양한 인간 질병의 메커니즘과 치료를 효율적으로 심문하는 번역 동물 모델로서 중앙 유틸리티로 널리 인정받고 있습니다. 벌레는 빠른 개발 주기, 큰 무리 크기, 짧은 수명, 현미경 투명성, 낮은 유지 보수 비용, 게놈 도구의 강력한 제품군, 돌연변이 리포지토리 및 생체 내 생물학모두에서 중재하는 실험 방법론을 활용하여 치료 목표와 치료에 대한 더 깊은 통찰력을 얻기 위해 높은 처리량 유전 및 약물 화면에 특히 적합합니다. 웜 운동 활동은 미토콘드리아 질환에서 자주 손상되는 특히 관련 표현형을 나타내며, 이는 원인과 증상에서 매우 이질적이지만 세포 에너지를 생산하는 장애인 용량을 집단적으로 공유합니다. 다른 방법론의 제품군은 웜 동작을 심문하는 데 사용될 수 있지만, 이들은 게놈 또는 약물 고처리량 스크린을 위한 실험 비용, 복잡성 및 유용성에 크게 변화합니다. 여기서, 16개의 상이한 활동 분석 방법론의 상대적인 처리량, 장점 및 한계는 다른 단계, 나이 및 실험 기간에 있는 C. elegans의 단 하나 벌레 또는 벌레 집단에서 선충제 운동, 분쇄, 인두 펌핑 및/또는 화학요법을 정량화하는 비교되었습니다. 상세한 프로토콜은 사용 가능한 소프트웨어 도구, 즉 ZebraLab (중간 처리량 접근 법)과 WormScan (높은 처리량 접근 법)의 새로운 응용 프로그램을 나타내는 선충제 운동 활동을 정량화하는 두 가지 반자동 방법을 입증했습니다. 이러한 방법을 적용한 데이터는 L4 애벌레 단계에서 유사한 정도의 감소된 동물 활성을 입증하고, 1일째 성인에서 진행되었으며, 미토콘드리아 복합 I질환(gas-1(fc21)) 돌연변이 벌레는 야생형(N2 Bristol) C. elegans에비해 있었다. 이 데이터는 ZebraLab 또는 WormScan 소프트웨어 도구를 사용하여 미토콘드리아 질환의 전임상 동물 모델에서 웜 거동에 대한 고처리량 약물 스크리닝을 지원하는 가변 용량으로 웜 운동 활동을 효율적이고 객관적으로 정량화하는 이러한 새로운 응용 분야에 대한 유용성을 검증합니다.

액체 매체에서 C. elegans locomotor 활성의 분석은 고체 매체에서 쉽게 정량화되지 않을 수 있는 미토콘드리아 질병 웜 모델의 통합 표현형을 쉽게 포착할 수 있었다. ZebraLab은 L4 애벌레 단계에서 액체 매체에서 WTworms에 비해 잘 확립된 미토콘드리아 복합체 I 질환가스-1(fc21)의운동 활성을 정량화하는 데 사용되었습니다. 단일 액체 낙하에 5개의 벌레의 활성은 1분 이상 기록되었으며, 각 변형에 대해 총 19개의 비디오(기술 복제)가 기록되어 스트레인당 95개의 웜을 분석한 결과. 4개의 생물학적 복제 실험은 균주당 수득하였다. 웜 활동은 N2 Bristol WT제어(그림 3B)로정규화될 때 픽셀 변경(그림3A)및 제어(POC)의 백분율로 표시됩니다. 가스-1(fc21)웜(62% ± 16% 픽셀 변화, 평균 ± SD, n=19)...

이 연구는 C. elegans 복합 I 질병 가스-1(fc21)웜, 즉 ZebraLab (중간 처리량 분석) 및 WormScan (고처리량 분석)에서 두 개의 반 자동 운동 활동 분석 접근 에 대한 프로토콜을 제시하고 nematode 행동과 통합 신경 근육 기능을 정량화하는 광범위한 연구 방법 중 비교 분석을 제공합니다.

Caenorhabditis elegans is widely recognized for its central utility as a translational animal model to efficiently interrogate mechanisms and therapies of ...

이 프로토콜은 액체 매체에서 C.elegans 운동 활동을 신속하게 정량화하기 위해 두 개의 서로 다른 반자동 분석약을 사용하며 C.elegans 질병 모델에서 약물 스크리닝에 적용 될 가능성이 있습니다. 이 두 기술의 주요 장점은 사용의 용이성과 재현성의 용이성입니다. 두 기술 모두 가변 처리량으로 웜 동작에 대한 약물 효과를 평가할 수 있습니다.이러한 운동성 작용은 동물의 신경근육 시스템이 손상된 C.elegans 미토콘드리아 질환 모델의 운동 활성을 평가하는 데 유용합니다. L4 단계에 대한 약물 치료 없이 NGM 플레이트의 돌연변이 벌레 균주에서 제어를 동기화한 후 유리 슬라이드에서 액체 배지에서 C.elegans 운동 활성을 분석하려면 웜 픽과 스테레오 현미경을 사용하여 스트레인당 5개의 웜과 상태를 유리 슬라이드에 S.basal 솔루션의 개별 20 마이크로리터 방울로 선택합니다. 여러 기술 복제를 얻기 위해 동일한 슬라이드의 여러 방울에 다른 NGM 플레이트에서 동일한 실험 조건에서 웜을 추가합니다.모든 벌레가 수집되면, 동물이 낙하당 당 초당 15 프레임에서 1 분 동안 각 드롭에서 수영 활동을 기록하기 전에 실온에서 1 분 동안 슬라이드에 적응할 수 있습니다. ZebraLab 소프트웨어를 사용하여 기록된 C.elegans 운동 활동을 분석하려면 ZEBRALAB AVI 옵션을 사용하여 소프트웨어를 업로드합니다. AVI 파일 옵션을 통해 양자화를 클릭합니다.새 프로토콜을 만들려면 매개 변수, 프로토콜 매개 변수 및 시간을 선택하고 실험 기간을 1분으로 설정합니다. 원하는 데이터 출력에 따라 시간 없음 빈을 선택하고 통합 기간을 선택 취소하고 이전에 녹화된 각 개인을 업로드하기 위해 파일 및 동영상을 엽니다. 단일 감지 영역을 구축하려면 원 도구를 사용하여 웜이 있는 전체 액체 낙하 주위에 영역을 만듭니다.선택한 영역 내의 모든 웜의 활동이 감지됩니다. 보정거리를 나타내려면 비디오 영역의 왼쪽에서 오른쪽으로 가로선을 그리고 교정, 그리기 및 그룹에 적용합니다. 모든 다른 C.elegans 웜 균주를 분석할 수 있도록 영역 아이콘을 선택 해제하고 활동 임계값에서 검출 감도를 조정합니다.활동 분석이 진행되는 동안 동물이 만든 트랙을 시각화하려면 디스플레이 축척을 70으로 설정하고 그룹에 적용을 선택합니다. 동영상을 분석하려면 재생을 클릭하고 실험을 선택하고 실행에 따라 동영상의 파일 이름을 입력합니다. 저장 후 최대 컴퓨터 속도로 비디오를 분석할지 여부를 묻는 창이 나타납니다.예를 클릭합니다. 실행 중인 실험 창이 열립니다. 시작을 클릭합니다.기록 분석이 완료되면 실험을 클릭하고 중지하여 스프레드시트의 액적에서 분석된 활동을 저장합니다. 96웰 플레이트 형식으로 액체 배지에서 C.elegans 운동 활성을 분석하려면 웜이 L4 단계에 도달하면 E.coli OP50 및 S.basal 배지의 부피당 2%의 마이크로리터 50마이크로리터를 명확한 96웰 의 평평한 바닥 마이크로플레이트에 추가합니다. 스테레오현미경을 사용하여 96웰 플레이트의 웰당 15개의 동기화된 웜을 수동으로 선택하고 웜이 20분 동안 적응할 수 있도록 합니다.적응 기간이 끝나면 표준 평판 스캐너를 사용하여 스캔 사이에 10초 미만으로 각 마이크로플레이트를 두 번 스캔하여 스캔을 분석하고, 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 두 개의 순차 스캔을 정렬하고, 두 개의 이미지와 상대 웜 스캔 점수 사이의 픽셀 변경 데이터를 획득하여 스캐너가 픽셀로 설정할 때 생성된 광 강도에 따라 운동 반응의 변화를 결정합니다. 임계값은 5입니다. 이러한 분석에서 액체 배지의 한 방울에서 C.elegans 운동 활성을 분석하여, 미토콘드리아 복합 I 질환 웜은 야생형 웜에 비해 L4 단계에서 의 운동 활동이 현저한 38% 감소를 보였다. 유사하게, 동일한 집단의 웜 스캔 분석은 N2 Bristol 야생 형 웜에 비해 L4 단계 질병 모델 웜에 대한 운동 활성이 현저한 감소를 보였다.이러한 기관차 활동 손실은 또한 웜 스캔 분석에 의해 평가된 바와 같이 성인 1단계 미토콘드리아 복합I 질환 웜에서 관찰되었다. 각 분석기를 설정할 때 올바른 수의 웜을 사용하는 것이 중요합니다. 이 절차에 따라, 우리의 실험실은 자주 약물 검사를 수행.이 두 가지 기술은 미토콘드리아 질환의 전임상 동물 모델에서 웜 활동에 대한 관심있는 약물의 효과를 평가하기 위해 실험실에서 사용됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Behavior

행동

이 비디오는 야생형 또는 ALS 돌연변이 인간 TDP-43 단백질을 발현하는 예쁜꼬마선충의 운동 기능 장애를 평가하기 위해 방사형 운동 분석을 사용하는 방법을 보여줍니다. 다양한 수준의 야생형 또는 돌연변이 TDP-43 발현을 가진 웜은 크롤링할 수 있으며, 이들의 움직임은 분석 플레이트의 중심점에서 이동한 반경 거리로 측정됩니다. 이 분석은 다양한 예쁜꼬마선충 균주가 이동한 거리에 따라 경증, 중등도 및 중증 운동 장애를 구별합니다.

방사형 운동 분석법을 사용한 예쁜꼬마선충 모델의 운동 손상 평가

단백질 항상성, 스트레스 및 노화 사이의 관계를 연구하기 위해 유전적으로 다루기 쉬운 후생동물인 Caenorhabditis elegans를 모델 시스템으로 사용하여 단백질 기능 장애, 세포 내 단백질 국소화 및 유기체, 세포 및 단백질 수준에서의 단백질 안정성을 추적하여 단백질 접힘의 변화를 모니터링했습니다.

사용 예쁜 꼬마 선충 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

골격 근육은 운동을 위해 필수적이며, 몸의 주요 단백질 저장소입니다. C. elegans의 내 근육 건강 측정이 설명되어 있습니다. 근육의 구조와 기능에 대한 전향 적 변화는 지역화 된 GFP 및 양이온 성 염료를 사용하여 평가됩니다.

방법은 근육의 세포 내 구획을 평가하기 위해 C. 엘레

모델 유기체인 Caenorhabditis elegans에서 미토콘드리아 억제제의 효과를 생체 내에서 검출하고 잠재적인 강화 화합물을 식별하기 위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 프로토콜은 미토콘드리아 기능을 조절하는 화합물에 대한 약물 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용할 수 있습니다.

Screenable<em&gt; 생체</em&gt; 형질 전환 발광 생물을 사용 미토콘드리아 변조기에 대한 분석<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

이 프로토콜 열 필드 활동 분석 결과에 마우스 ambulation를 측정 하기 위한 유연 하 고, 저렴 한 비용 시스템을 설명 합니다. 우리는이 시스템에 따라 6 분 ambulation 분석 결과 mdx 마우스에서 자발적인 운동 감소를 감지 하 고 정확 하 게 구별이 동물의 근육 특정 구조에 개선 보여.

근이 영양 증의 마우스 모델에서 Ambulation를 측정 하기 위한 간단 하 고 저렴 한 비용 분석 결과

우리는 넓은 필드의 보기 선 충 추적 플랫폼 (WF-NTP), 꼬마 선 충의 큰 인구의 높은 처리량 phenotypic 특성을 가능 하 게를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 미묘한 행동 변화 돌연변이 체 긴장 또는 확장성 패션에서 약물 치료에 대 한 응답에서 특성을 사용할 수 있습니다.

자동화 된 행동 분석의 큰 C. 선 충 인구 넓은 시야의 사용 하 여 추적 플랫폼

미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

이 연구는 자유롭게 사용할 수있는 이미지 처리 도구를 사용하여 C. elegans에서 시냅스 크기와 현지화, 근육 형태 및 미토콘드리아 모양의 정량적 측정을 설명합니다. 이 접근은 C. elegans에 있는 미래 연구 결과가 유전 돌연변이 결과로 조직과 세포기관 구조 변경의 넓이를 정량적으로 비교하는 것을 허용합니다.

예쁜꼬마선충의 세포구조와 세포세포형태를 연구하기 위한 정량적 접근법

이 프로토콜은 근위축성 측삭 경화증의 C. elegans 모형에 있는 온화한, 온건한, 및 가혹한 운동 손상 사이에서 차별에 대한 2개의 민감한 분석, C. elegans 긴장에 대한 일반적인 유틸리티, 변경된 운동성.

근위축성 측삭 경화증의 C. 엘레간 모델의 모터 손상 평가

여기서는 PINK1B9-null 돌연변이 초파리의 생체 에너지를 분석하기 위한 고분해능 호흡 측정 프로토콜을 제시합니다. 이 분석법은 SUIT(Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration) 프로토콜을 사용합니다.

고분해능 호흡 측정법을 사용한 초파리 멜라노가스터 PINK1B9-Null 돌연변이의 미토콘드리아 기능 분석

이 프로토콜은 노화 중 예쁜꼬마선충 의 여러 조직에서 미토콘드리아 형태를 이미징하기 위한 표준화된 접근 방식을 제공합니다.

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans during aging (노화 중 예쁜꼬마선충의 미토콘드리아 형태학의 이미징 및 정량화)

학습하세요 Caenorhabditis elegans에서 ZebraLab과 WormScan을 활용한 반자동화 운동 활동 정량화 방법을 통해 미토콘드리아 질환 모델의 약물 스크리닝을 효율적으로 수행하는 기술을.

미토콘드리아 질환의 카노르하비티스 예르간 모델에서 동물 활동을 정량화하는 실험 방법의 비교 분석

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