Name: 바이러스와 같은 입자를 통해 불멸과 1 차 세포에서 Cas9/sgRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 전달 (나노 블레이드) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: 배우세요 나노블레이드를 이용한 Cas9/sgRNA 복합체 전달 방법으로 불멸 및 1차 세포에서 효율적인 유전자 편집을 수행하세요. 이 기술은 오프타겟 효과를 최소화하고 바이러스 벡터의 한계를 극복합니다.

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이 작품은 프랑스 국립 연구 기관 (ANR) 후원 FINOVI, 응용 프로그램 인베세멘트 다베니르 (ANR-11-IDEX-0007) 내에서, 대학 드 리옹의 라벡스 에코펙트 (ANR-11-LABX-0048)에 의해 투자되었다 기관 내셔널 데 Recherches sur le SIDA et les Hépatites Virales (ANRS-ECTZ3306) 및 유럽 연구 위원회 (ERC-StG-LS6-805500 to E.P.R.) 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램.

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필립 E. 만조와 에밀리아노 P. 리치는 나노 블레이드 기술에 관한 특허에 발명가로 선정된다 (특허 출원자: Institut 국립 드 라 산테 에 드 라 Recherche Médicale (INSERM), 센터 국립 드 라 레체체 시엔티피크 (CNRS), 에콜 사범 슈퍼 어르 드 리옹, 유니버시테 클로드 버나드 리옹 1, 빌반 Cexed 번호; 2 068077 0 특허 출원; 게시, 27 4 월 2017; 원고의 모든 측면은 특허 출원에 의해 적용됩니다. 나머지 저자는 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

나노 블레이드는 세포주 및 1 차 세포에서 Cas9/sgRNA RNP 복합체의 신속하고 복용량 의존적인 납품을 허용합니다. 고전적인 트랜스페션 및 기타 바이러스 성 전달 벡터와는 달리 단백질 전기화와 마찬가지로 나노 블레이드는 트랜스진이없는 방식으로 Cas9 /sgRNA RNP의 일시적인 전달의 이점이 있습니다. 나노 블레이드는 CRISPR 변종의 계속 확장 제품군에 쉽고 빠르게 적응 할 수있는 단백질 전달을위한 매우 다재다능하고 간단하며 저렴한 플랫폼을 제공합니다. 나노 블레이드는 HEK293T 세포주 또는 그 유도체에서 생성될 수 있다. 여기에 사용되는 HEK293T 세포주 레트로 바이러스 및 렌즈바이러스 입자 생산을 극대화하기 위해 개발되었습니다 ( 재료의 표 참조). 그러나 HEK293T 세포의 다른 공급원이 적합할 수 있지만, 사용자는 HEK293T 세포원에 따라 입자 생산의 주요 차이점이 관찰됨에 따라 다양한 소스에서 HEK293T 세포를 테스트하고 비교해야 한다. 세포는 또한 입자 생산에 부정적인 영향을 미치는 과응영향을 피하기 위해 Mycoplasma 오염을 자주 검사하고 3 일마다 통과 (고전적으로 1/8 희석) 통과.
세포는 20개 이상의 구절을 위해 유지관리해서는 안 됩니다. 포도당, 페니실린/연쇄절제술, 글루타민, 10% 보완된 태아 소 혈청으로 보충된 DMEM은 세포 배양에 사용되었다. 혈청 원점은 나노 블레이드 준비의 품질에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 혈청의 다른 배치는 대규모 생산 전에 테스트되어야한다. 나노 블레이드는 RPMI 또는 혈청없는 최소 필수 매체의 수정과 같은 다른 매체에서 효율적으로 생성 할 수 있으며, 이는 전환 후 당일 DMEM을 대체 할 수 있습니다. 아래에 표시된 바와 같이, 일부 DNA-transfection 시약과의 트랜스페션 후 중간 교체가 선택 사항이지만, 특히 입자 제제에서 혈청 흔적을 제한하는 것이 도움이 될 수 있다. 그러나, 감산의 최소 필수 배지에서 세포의 재배는 아직 시도되지 않았습니다.
언급했듯이, 나노 블레이드는 생산자 세포에서 플라스미드혼합물의 과발현시 생산된다. 최적의 생산에 과식이 필요한 것으로 보입니다. 실제로, 이 실험실은 개그폴 표현 구조가 항생제 선택에 의해 안정화된 생산자 세포줄을 개발했습니다. 그러나 이 시스템은 상당한 양의 나노 블레이드를 생성하지 못했습니다. 유사한 관찰은 sgRNA 코딩 구조가 생산자 세포의 게놈에 안정적으로 통합되었을 때 이루어졌다. 다른 입자 생산 시스템에 설명된 바와 같이, 나노블레이드 생산에 관여하는 적어도 일부 구조물을 발현하는 안정적인 세포주; 그러나, 이것은 확실히 입자를 정화하기 위하여 대량의 상체그리고 적당한 기술의 처리가 필요합니다. 위의 프로토콜은 특정 형질 전환 시약을 악용하는 나노 블레이드를 생성하는 기본 절차를 간략하게 설명 합니다(재료 표 참조).
다른 제조 업체에서 트랜스페션 시약도 성공으로 테스트되었지만, 나노 블레이드와이 그룹의 결과의 대부분은 여기에 설명 된 절차를 따릅니다. 저비용 트랜스페션은 칼슘 인산염 시약을 사용하여 달성되고 좋은 생산 효율을 얻을 수 있습니다. 그러나, 이 방법은 절대적으로 형질 전환 후 당일에 형질계의 교체가 필요하며 퇴적입자 제제에 칼슘 인산염 잔류물을 남길 수 있다. 생산자 세포 내의 나노 블레이드 성분에 대한 높은 발현 수준의 필요성과 일치하여 Cas9 단백질과 관련된 sgRNA의 양이 효율적인 게놈 편집을 위한 제한 인자가 될 수 있다는 관측이 있다. sgRNA 로딩을 개선하기 위해, 최근 나노 블레이드와 유사한 단백질 전달 벡터를 사용하여 독립적 인 그룹에 의해 두 가지 기술적 인 접근 이 개발되었습니다. 이들은 SgRNA6의 T7 폴리머라제 의존세포형 발현의 사용또는 개그 폴리프로틴6에 결합을 중재하기 위해 sgRNA 서열에 레트로바이러스 캡슐화 신호를 첨가함으로써 의존한다. 이러한 접근 방식은 아직 테스트되지 않았지만 나노 블레이드 내의 sgRNA 로딩을 실제로 향상시킬 수 있습니다.
표적 세포의 변환은 절차에서 중요한 단계입니다. 대부분의 불멸의 세포주에서 나노 블레이드와의 트랜스포션은 세포 병증 효과가 거의 또는 전혀 없습니다. 그러나, 1 차적인 세포에서, 독성은 문제가 될 수 있습니다. 따라서 트랜스유도는 각 셀 유형에 최적화되어야 합니다. 특히, 나노블레이드에 대한 노출 시간은 트랜스듀션 프로토콜을 최적화할 때 수정하는 중요한 요소입니다. 1차 뉴런 이나 골수 세포와 같은 민감한 세포의 경우, 매체를 교체하기 전에 나노 블레이드와 인큐베이션의 4-6 h는 세포 독성을 최소화하면서 Cas9 단백질의 효율적인 전달을 허용합니다. 더욱이, 양이온 폴리머와 같은 보조제는, 그 외의 사이에서, 몇몇 세포에 있는 전도의 효율성을 현저하게 향상할 수 있습니다 ( 재료의 표 참조). 나노 블레이드는 VLP이며 면역 원성 반응을 유도 할 수 있음을 주목하는 것이 중요합니다. 이것은 나노 블레이드와 함께 잠복이 유전자 발현및 세포의 표현형에 있는 중요한 변경을 유도할 수 있는 대식세포 또는 수지상 세포와 같은 1 차적인 세포의 특정 모형으로 일하는 경우에 제한일 수 있습니다. 대식세포와 수지상 세포가 조혈 줄기 세포 전구체(예: 마우스 골수 세포)로부터 유래되는 경우 나노블레이드에 대한 세포 반응을 유도하지 않도록 완전히 분화되기 전에 나노블레이드로 세포를 전도하는 것이 바람직하다. 그렇지 않으면, Cas9 단백질 전기 화는 분화 된 면역 세포와 함께 작업 할 때 실행 가능한 대안을 나타낼 수 있습니다.
나노 블레이드는 형질 전환 동물을 생성하기 위해 마우스 zygotes 또는 배아를 변환하는 생체 내에서 사용할 수 있습니다. 고전적인 레트로 바이러스 또는 렌즈 바이러스 벡터와 유사, 그들은 또한 성인 동물에서 조직에 직접 주입 될 수 있습니다. 그러나, 나노블레이드(레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터와 유사)는 숙주 동물의 면역 반응에 의해 비활성화될 수 있다. 따라서, 주입되는 복용량은 각 응용 프로그램에 대해 최적화되어야한다. 이러한 면역 반응은 또한 주사 부위에 가까운 조직에 기능적인 VLP의 분포를 제한할 수 있다. 마지막으로, 렌즈피바이러스 벡터와 달리 나노블레이드는 트랜스진이 없으며 제한된 기간 내에 Cas9를 제공합니다. 따라서, 그(것)들은 세포의 선택에 sgRNAs의 높은 처리량 순서를 요구하는 게놈 전체 기능 검열을 능력을 발휘하기 위하여 이용될 수 없습니다. 나노 블레이드는 급속한 경우 유용, 복용량 의존, 및 트랜스 유전자없는 게놈 편집이 필요한 20. 더욱이, 단백질 전기화와 유사하게, 나노블레이드는 DNA 트랜스페션 또는 고전적인 바이러스 벡터3를 통해 Cas9/sgRNA의 장기간 발현보다 더 적은 오프 타겟 효과로 이끌어 내는다3. 나노 블레이드의 미래 개발은 베이스 편집 및 RNA 타겟팅과 같은 다양한 기술 응용 분야에 대한 Cas9 변종을 통합하는 데 초점을 맞추고 있습니다.

다른 프로그래밍 가능한 뉴클레아제와 비교하여 CRISPR-Cas 시스템은 진핵 세포에서 서열 특이적 게놈 표적화 및 분열 의 절차를 극적으로 단순화하고 민주화시켰습니다. sgRNA의 간단한 발현을 통해 사용자는 거의 모든 세포 궤적1에 대해 Cas9 단백질(또는 최적화된 변형)을 프로그래밍할 수 있습니다. 이 시나리오에서, Cas9 단백질과 sgRNA의 전달은 사이트 지향 돌연변이 발생을 수행할 때 주요 한계가 됩니다. 불멸의 세포에서, sgRNA와 Cas 단백질은 대부분의 세포에서 효율적인 게놈 표적을 달성하기 위하여 전과된 플라스미드에서 쉽게 발현될 수 있습니다. 그러나, Cas9/sgRNA 복합체의 구성발현은 Cas9 단백질의 오프타겟 활성을 증가시키고 비특이적 loci2에서 원치 않는 변화를 도입할 수 있다. 1 차 적인 세포에서, DNA 형질은 달성하고 가난한 발현 또는 전형된 세포의 작은 백분율로 이끌어 내는 기술적으로 어려울 수 있습니다. 고전적인 DNA 형질전환에 대한 대안은 합성 sgRNA에 결합된 재조합 Cas9 단백질의 Cas9 및 sgRNA 또는 전기포기용 트랜스진 코딩을 전달하는 바이러스 벡터의 사용을 포함한다. 그러나, 이들 접근법은 세포 숙주 게놈 내의 유전자 통합(고전적인 레트로바이러스 및 렌티바이러스 발현 벡터의 경우와 같이), 세포 요인에 의한 제한, Cas9 단백질 및 sgRNA의 구성발현으로 이어질 수 있다.
Cas9/sgRNA RNP 복합체의 전기포공은 이러한 문제의 대부분을 극복하고 1차 세포및 생체 내에서 효율적이고 일시적인 전달로 이어질 뿐만 아니라 용량 의존적 반응을 허용할 수 있다. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 일반적으로 비싼 장비 및 시약에 의존 하 고 또한 많은 수의 세포를 치료 해야 하는 경우 고급 화 하기 어렵다. 전술한 기술에 대한 대안으로, 이들 저자는 다른 바이러스 유래 캡시드 단백질 전달 시스템과 개념적으로 유사한 Cas9 단백질 및 sgRNA3를 위한 레트로바이러스 전달 벡터인 "Nanoblades"를 개발하였다4,5,6,7,8. 나노 블레이드는 소세포 배지9에서 방출되는 배양 세포, VLP에서 단독으로 발현될 때 레트로 바이러스로부터 개그 폴리 프로틴의 자연적인 용량을 이도합니다. Murine 백혈병 바이러스(MLV)의 C-말단 끝에 Cas9 단백질을 융합하고 sgRNA 및 바이러스 봉투 당단백질을 공동 발현함으로써, Cas9 단백질은 방출된 VLP 또는 나노블레이드 내에서 캡슐화될 수 있다. 정화 시, 나노블레이드는 표적 세포로 배양되거나 생체 내에서 주입되어 Cas9/sgRNA RNP 콤플렉스3의 신속하고 일시적이며 용량 의존적 전달을 중재할 수 있다.
나노 블레이드는 다른 loci또는 Cas9 변형으로 동시에 편집하기 위해 여러 sgRNA로 프로그래밍하여 대상별 전사 활성화 또는 억압3과 같은 다른 응용 프로그램을 수행할 수 있습니다. 재조합 발현에 의존하는 단백질 전기포레이션과는 달리, 문헌에서 새로 설명된 Cas 변종은 개그 융합 발현 벡터로 쉽게 복제되어 다재다능한 플랫폼이 될 수 있다. 나노 블레이드는 더 복잡하거나 편성 지향 수리를 수행하기 위해 단일 좌초 및 이중 좌초 올리고열뉴클레오티드 (ssODNs)로로드 될 수 있습니다3. 나노 블레이드 생산은 상대적으로 간단하고 저렴합니다. 또한 나노 블레이드는 며칠 동안 4 °C 또는 장기 저장을 위해 -80 °C에서 저장할 수 있습니다. 전형적으로, 나노 블레이드는 대부분의 불멸과 1 차 배양 세포에서 효율적이고 유전자없는 게놈 편집을 중재합니다. 그러나, 몇몇 1 차적인 세포는 증가한 사망의 결과로 바이러스성 입자의 존재에 민감할 지도 모릅니다. 타고난 면역 계통의 세포는 또한 나노 블레이드의 존재에 반응할 수 있습니다 (그들의 바이러스 기원 때문에) 활성화 될 수 있습니다. 이러한 경우 트랜스듀션 프로토콜은 나노블레이드에 대한 노출 시간을 제한하고 비특이적 효과를 최소화하도록 최적화되어야 합니다. 나노 블레이드는 다른 사용 가능한 CRISPR 전달 방법에 대한 실행 가능하고 구현하기 쉬운 대안을 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>13.2mL, Thinwall 폴리프로필렌 튜브, 14 x 89mm - 50Pk</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>331372</td><td>나노블레이드 정제를 위한 초원심분리 튜브</td></tr><tr><td>Amersham Protran 프리미엄 웨스턴 블로팅 멤브레인, 니트로셀룰로오스</td><td>Merck</td><td>GE10600004</td><td>정제된 나노블레이드 내 Cas9 수준 정량화를 위한 니트로셀룰로오스 멤브레인</td></tr><tr><td>BIC-Gag-CAS9</td><td>Addgene</td><td>119942</td><td>GAG(F-MLV)-CAS9(SP) 융합을 인코딩합니다. 과발현된 gRNA 및 적절한 외피와 관련하여 생산자 세포의 입자와 같은 GAG-CAS9 바이러스를 생산할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>BICstim-Gag-dCAS9-VPR</td><td>Addgene</td><td>120922</td><td>표적 전사 활성화를 위한 GAG-dCAS9-VPR 융합을 인코딩</td></tr>합니다. BLADE Addgene 134912 Nanoblades 시스템 BsmBI-v2 New England <tr><td></td><td></td><td></td> Biolabs<td>에서 사용할 sgRNA 염기서열 클로닝을 위한 빈 백본</td></tr><tr><td></td><td></td><td>sgRNA 클로닝을 위한 BLADE 및 SUPERBLADES 벡터를 분해하기 위한</td> <td>R0739S</td> 제한</tr><tr><td>효소 Cas9 (7A9-3A3) Mouse mAb (HRP Conjugate) #97982</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>97982S</td><td>dot-blot Cas9</td></tr><tr><td>Nuclease, S. pyogenes</td><td>New England Biolabs</td><td>M0386T</td><td>나노블레이드 내에 적재된 Cas9 양의 절대 정량화를 위한 기준으로 사용되는 재조합 Cas9 단백질</td></tr><tr><td>에티듐 브로마이드 용액 (H2O에서 10 mg/mL</td>) <td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>아가로스 겔 염색 및 DNA 시각화</td></tr><tr><td>Fisherbrand Wave Motion Shakers</td><td>Fisher Scientific</td><td>88-861-028</td><td>원심분리 겔 시 나노블레이드를 재현탁시키기 위한 교반 테이블</td></tr><tr><td>분석기</td><td></td><td></td><td>http://www.gelanalyzer.com; 분해 후 밴드 강도 정량화</td></tr><tr><td>Gesicle Producer 293T</td><td>Takara</td><td>632617</td><td>Nanoblades 생산자 세포주</td></tr><tr><td>Gibco DMEM, 고포도당, 피루브산</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td>41966052 Gesicle Producer용 세포 배양 배지 293T 세포</td></tr><tr><td>GoTaq G2 DNA 중합효소</td><td>Promega</td><td>M7848</td><td>Taq 중합효소 T7 endonuclease assays</td></tr><tr><td>jetPRIME DNA 및 DNA용 Transfection 시약 키트/ </td><td>Gesicle Producer 293T 세포에서 나노블레이드 생산을 위한</td>siRNA <td>Polyplus</td><td>POL114-15</td> 형질주입 시약</tr><tr><td>Millex-AA, 0.80 &micro; m, 주사기 필터</td><td>Millipore</td><td>SLAA033SS</td><td>주사기 필터는 나노 블레이드</td></tr><tr><td>Millex-GS, 0.22 &micro의 농도 전에 세포 파편을 제거합니다. m, 주사기 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td>자당 쿠션 용액을 살균하는 주사기 필터</td></tr><tr><td>Millex-HP, 0.45 &micro; m, 폴리에테르설폰, 주사기 필터</td><td>Millipore</td><td>SLHP033RS</td><td>나노블레이드 농축 전 세포 파편을 제거하는 주사기 필터</td></tr><tr><td>Monarch DNA 겔 추출 키트</td><td>New England Biolabs</td><td>T1020L</td> BsmBI NEB Stable Competent E. coli(고효율)<td>로 분해 시 pBLADES 또는 pSUPERBLADES 플라스미드 단편 정제를 위한 DNA 겔 추출 키트</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>C3040I</td><td>플라스미드 형질전환 및 증폭을 위한 유능한 박테리아</td></tr><tr><td>트랜스펙션 등급 플라스미드 DNA를 위한 NucleoBond Xtra Midi 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740410.50</td><td>배양된 박테리아에서 플라스미드 DNA를 정제하기 위한 Maxipreparation 키트</td></tr><tr><td>Nucleospin gDNA 추출 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.50</td><td>형질주입된 세포에서 게놈 DNA 추출</td></tr><tr><td>NucleoSpin Plasmid, 플라스미드 DNA</td><td>용 미니 키트Macherey-Nagel</td><td>740588.50</td><td>배양된 박테리아에서 플라스미드 DNA 정제를 위한 Minipreparation kit</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue, 세포 및 조직에서 DNA를 위한 미니 키트</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952.5</td><td>게놈 DNA 추출 키트</td></tr><tr><td>Optima XE-90</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>A94471</td><td>초원심분리기</td></tr><tr><td>pBaEVRless</td><td>Els Verhoeyen (Inserm U1111)</td><td>Personnal 요청은 다음 주소로 보내야 합니다: els.verhoyen@ens-lyon.fr</td><td>Baboon Endogenous retrovirus Rless glycoprotein described in Girard-Gagnepain, A. et al. Baboon envelope pseudotyped LVs는 early-cytokine-stimulated and resting HSCs로 유전자 전달을 위해 VSV-G-LVs를 능가합니다. Blood 124, 1221&ndash; 1231 (2014)</td></tr><tr><td>pBS-CMV-gagpol</td><td>Addgene</td><td>35614</td><td>Enocdes the Murine Leukemia Virus gag and pol genes</td></tr><tr><td>pCMV-VSV-G</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Envelope protein for producing lentiviral and MuLV retroviral particles</td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14200091</td><td>10X PBS를 사용하여 millipore water</td></tr><tr><td>Polybrene Transfection 시약</td><td>Millipore Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td>양이온 폴리머는 특정 포유류 세포에서 레트로바이러스 형질주입 효율을 향상시킵니다. 또한 상동성 지향 복구를 위한 올리고데옥시뉴클레오티드(ODN)의 바이러스 의존성 진입을 허용할 수 있습니다</td></tr>.<tr><td> 99.5% (GC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389-5KG</td><td>초원심분리를 통한 나노블레이드 정제를 위한 쿠션 준비</td></tr><tr><td>SUPERBLADE5</td><td>Addgene</td><td>134913</td><td>나노블레이드 시스템에서 사용할 sgRNA 염기서열 복제를 위한 빈 백본(Chen B et al., 2013을 통해 게놈 편집 효율성 향상에 최적화됨)</td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34076</td><td>Cas9 도트 블롯을 위한 향상된 화학발광(ECL) HRP 기판</td></tr><tr><td>SW 41 Ti 스윙 버킷 로터</td><td>Beckman Coulter Life Sciences</td><td>331362</td><td>초원심분리용 로터</td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td>아가로스 젤 염색 및 DNA 시각화를 위한 브롬화 에티듐의 대안</td></tr><tr><td>T4 DNA 리가아제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td>sgRNA</td></tr><tr><td>T7 Endonuclease I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0302S</td> T7 Endonuclease I의 가변 영역에 해당하는 이중 DNA 올리고로 BLADE 또는 SUPERBLADES 벡터를 접합하는 DNA 리가제는 <td>완벽하게 일치하지 않는 DNA를 인식하고 절단합니다. 특정 유전자 자리에서 게놈 편집 정도를 모니터링 할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Triton 함유 용해 완충액</td><td>Promega</td><td>E291A</td><td>용해 완충액으로 나노블레이드를 파괴하고 Cas9 정량화를 허용합니다</td></tr>. <tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td>TBST 제조용</td></tr></tbody></table>

바이러스와 같은 입자를 통해 불멸과 1 차 세포에서 cas9/sgrna 리보뉴클레오단백질 복합체의 전달 ("나노 블레이드")

Delivery of the Cas9/sgRNA Ribonucleoprotein Complex in Immortalized and Primary Cells via Virus-like Particles ("Nanoblades")

클러스터된 짧은 palindromic 반복(CRISPR)-Cas 시스템은 진핵 세포에서 게놈 편집을 민주화하고 수많은 혁신적인 응용 분야의 개발로 이어졌습니다. 그러나, 표적 세포로 Cas9 단백질 및 단하나 가이드 RNA(sgRNA)를 전달하는 것은 기술적으로 도전이 될 수 있다. 렌티바이러스(LV) 또는 아데노 관련 바이러스(AAV)에서 유래된 것과 같은 고전적인 바이러스 벡터는 Cas9 단백질및 그 관련 sgRNA를 위한 코딩된 트랜스게놈의 효율적인 전달을 허용하며, 많은 1차 세포및 생체내에서. 그럼에도 불구하고, 이들 벡터는 표적 세포 게놈내의 트랜스진의 통합, 제한된 화물 용량, 표적 세포에서 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 장기 발현 과 같은 단점을 겪을 수 있다.
이러한 문제 중 일부를 극복하기 위해, 뮤린 백혈병 바이러스(MLV)를 기반으로 한 전달 벡터는 임의의 코딩 트랜스진이 없는 경우 Cas9 단백질 및 그 관련 가이드 RNA를 포장하기 위해 개발되었다. Cas9 단백질을 MLV로부터 구조 단백질 개그의 C-종자에 융합시킴으로써, Cas9 단백질과 sgRNA("나노블레이드"라는 이름으로 명명된)로 적재된 바이러스와 같은 입자(VLP)가 형성되었다. 나노 블레이드는 생산자 세포의 배양 배지로부터 수집될 수 있고, 정제, 정량화, 표적 세포를 변환하고 활성 Cas9/sgRNA 복합체를 전달하는 데 사용될 수 있다. 나노 블레이드는 광범위한 원차 및 불멸의 세포에서 리보뉴클레오단백질(RNP) 화물을 일시적이고 빠르게 전달하며 수정된 Cas9 단백질을 사용하여 표적 유전자의 일시적인 전사 활성화와 같은 다른 응용 분야에 프로그래밍될 수 있습니다. 나노 블레이드는 주입 된 성인 마우스의 간및 우발 동물에서 생체 내 게놈 편집을 통해 형질 전환 동물을 생성 할 수 있습니다. 마지막으로, 그들은 "트랜스트랜스프리" 동성애 지향 수리를 위한 기증자 DNA로 복잡해질 수 있습니다. 나노 블레이드 제제는 간단하고 상대적으로 저렴한 비용으로 모든 세포 생물학 실험실에서 쉽게 수행 할 수 있습니다.

Nanoblade 준비를 위한 프로토콜은 매우 간단하며 조직 배양 후드, CO2 인큐베이터 및 스윙 버킷 원심분리기 또는 초원심분리기에 대한 액세스 외에 간단한 실험실 장비가 필요합니다. 그러나, 일부 단계는 생산자 세포의 소스 및 처리뿐만 아니라 변환 조건과 같은 특별한주의를 필요로한다. 도 1A에 도시된 바와 같이, 종자 세포는 플레이트에 균질하게 분포되어 경질 당일 ~70-80%의 합류에 도달할 수 있도록 종자 세포를 종자세포에 도달하는 것이 중요하다(세포의 덩어리가 없는 것을 피함). 24시간 후(도 1B,C), 생산자 세포는 여러 핵을 가진 더 큰 크기의 세포로 이어지는 싱크로시아를 형성할 것이다. 성형 후 40시간(도 1D) 플레이트의 대부분의 세포가 싱크성을 형성하고 플레이트에서 분리하기 시작합니다.
이것은 완벽하게 정상이며 이웃 세포 간의 융합을 유도하는 봉투 당단백질의 발현에 의해 발생합니다. 원심분리에 의한 농도(또는 생산자 세포의 상부로부터도 똑바로) 나노블레이드 내에 적재된 Cas9의 양은 재조합 Cas9를 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인에 도트 블롯에 의해 절대적인 방식으로 정량화될 수 있다(도 2). 이 단계는 표적 세포의 변환에 사용할 나노 블레이드의 정확한 양을 결정하는 것이 중요합니다. 도트 블롯 분석기를 수행할 때는 표준 곡선의 선형 범위에 속하는 판독값만 고려하는 것이 중요합니다. 그러나, 나노블레이드 내에 존재하는 Cas9의 양과는 별개로, T7 엔도누셀 분석(그림 3) 또는 Sanger 시퀀싱을 사용하여 표적 세포에 직접 게놈 편집의 효율을 테스트하는 것이 필수적이다.
그림 3에 도시된 바와 같이 나노블레이드의 효율성은 일반적으로 Cas9의 양과 상관관계가 있지만 배치마다 다를 수 있습니다. 그림 3에 도시된 예에서 레인 1의 배치는 전체 편집 효율이 20%로 이어지는 반면 레인 3의 배치는 60%의 효율로 이어집니다. 이 경우 배치 1에서 사용되는 나노 블레이드의 부피를 증가시키고 배치 3과 유사한 편집 효율을 달성할 수 있다. 도 4는 다른 유형의 기본 셀에서 Nanoblades를 사용하여 얻은 최대 편집 효율을 나타낸다. 사용되는 sgRNA의 서열과 대상 접근성에 따라 효율성이 달라질 수 있다는 점에 유의해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig01.jpg"> 도 1: 나노블레이드 생산 중 생산자 세포의 형태학. (A) HEK293T 세포에서 70-80% 인플루엔자 24 h. (B 및 C) HEK293T 세포 형태학 24 h 의 형질 후. (D) HEK293T 세포 형태학 40 시간 후 형질. 스케일 바 = 400 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig01large.jpg" target="_blank">여기를 클릭하여 이 그림의 더 큰 버전을 확인하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig02.jpg"> 그림 2: 점 블롯에 의해 나노 블레이드 내의 Cas9 로딩을 정량화. (A) 재조합 Cas9 또는 100x 농축 (초원심 분리에 의해) 나노 블레이드 샘플 (#1, #2, 및 #3) 희석 및 항 Cas9P 커플로 인큐베이팅하기 전에 니트로 셀룰로오스 막에서 발견. 신호는 향상된 화학 발광에 의해 드러난다. (B) 화학발광 신호는 니트로셀룰로오스 멤브레인에서 발견된 Cas9의 공지된 양에 대하여 플롯된 재조합 Cas9 희석및 신호 강도에 대해 획득 및 정량화된다. 회귀 곡선은 선형 범위(파란색 십자가 참조)에 있는 희석제에 대해 계산되며 선형 범위 외부의 모든 농도를 제외합니다(적십자가 참조). (C) 각 나노블레이드 제제에서 Cas9 농도(nM)는 (B)에서 얻은 선형 회귀로부터의 방정식을 사용하여 추정하였다. 이를 위해 회귀 곡선의 선형 범위 내에 속하는 나노 블레이드 희석으로부터 정량화된 신호만 사용하는 것이 중요합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig03.jpg"> 그림 3: 트랜스듀션 시 편집 효율 모니터링. (A) T7 엔도누셀 분석 분석이 나노블레이드 처리 된 세포의 절단 효율을 측정합니다. EMX1 유전자를 표적으로 하는 나노블레이드로 유도된 세포는 T7 엔도노클레스 분석에 의해 분석되었다. 레인 1: 나노 블레이드 준비 배치 #1 (20% 분열 효율); 레인 2: 제어 셀; 레인 3: 나노 블레이드 준비 배치 #2 (60% 분열 효율). (B) DDX3 오픈 판독 프레임 내에서 플래그 태그 시퀀스의 노크인. DDX3 궤적을 대상으로 하는 sgRNA로 프로그래밍된 농축 나노블레이드는 다른 HEK293T 클론(#1, #2)에서 생산되었으며, 플래그-DDX3 ssODN 템플릿과 HEK293T 표적 세포의 트랜스듀션에 사용되는 획득된 복합체의 용량증가로 복잡하게 생성되었다. 트랜스듀션 시, 세포는 게놈 DNA와 총 단백질을 추출하기 위해 수집하기 전에 3일 동안 재배되었다. 플래그-DDX3 단백질은 항플래그 아가로즈 구슬을 사용하여 면역침전이되었고, 이어서 항플래그 항체(top panel)를 사용하여 회수된 단백질의 웨스턴 블롯 분석이 뒤따랐다. Ddx3 메구에서 플래그 태그의 사이트 지향 삽입은 삽입 부위(가운데 패널)를 측면으로 하는 프라이머를 사용하거나 플래그 삽입 사이트(아래쪽 패널)의 Ddx3 로큐 하류에 특정한 플래그 태그 시퀀스와 역프라이머를 사용하는 프리머를 사용하여 PCR에 의해 분석되었다. 약어: EMX1 = 빈 스파이클 호모박스 1; DDX3 = 데드 박스 RNA 헬리케이스 3; PCR = 중합효소 연쇄 반응; ODN = 올리고디옥시뉴클레오티드; ssODN = 노래 좌초 ODN; sgRNA = 단일 가이드 RNA; IP = 면역 침전. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62245/62245fig04.jpg"> 그림 4: 나노블레이드를 사용하여 다른 1차 세포 유형에서 달성된 편집 효율. 약어: PBL = 말초 혈액 림프구; IL = 인터류빈; CD = 차별화 클러스터; iPSC = 유도 만능 줄기 세포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62245/62245fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 바이러스와 같은 입자 내에서 Cas9/단일 가이드 RNA(sgRNA) 리보뉴클레오단백질 복합체를 로드하기 위한 간단하고 저렴한 프로토콜을 개발했습니다. "나노 블레이드"라고 불리는 이러한 입자는 생체 내에서뿐만 아니라 불멸의 및 1 차 세포에서 Cas9 / sgRNA 복합체를 효율적으로 전달 할 수 있습니다.

바이러스와 같은 입자를 통해 불멸과 1 차 세포에서 Cas9/sgRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 전달 ("나노 블레이드")

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas system has democratized genome-editing in eukaryotic cells and led to the ...

나노 블레이드는 Cas9및 가이드 RNA 복합체의 신속하고 효율적이며 용량 의존적 전달을 허용했으며, 불멸과 1 차 세포에서, 그리고 항 트랜스유전자가 없는 경우. 이 방법의 주요 장점은 나노 블레이드가 쉽게 비교적 저렴하여 준비하는 것이 중요하다는 것입니다. 그(것)들은 Cas9를 전달하고 복용량 의존적이고 일시적인 방식으로 RNA 복합체를 안내할 수 있습니다, 따라서 효율적인 게놈 편집을 허용하면서, 오프 표적 효력을 제한합니다.나노 블레이드에 대한 준비 프로토콜은 매우 간단합니다. 그러나, 바이러스와 같은 입자의 높은 수율을 얻기 위하여 생산자 세포의 질, 뿐만 아니라 그들의 기원 및 그들의 종자, 필수적이다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 엔지니어 인 로라 기게타즈 (Laura Guiguettaz)가 될 것입니다.첫날, 10센티미터 세포 배양 접시에서 변형된 DMEM 및 페니실린 연쇄절제술기의 10밀리리터에서 3.5~400만 HEK 293T 세포를 종자 3.5~400만 개의 HEK 293T 세포. 24시간 후, 세포가 70%에 도달하면 배지를 신선한 DMEM으로 대체하고 P-1000 파이펫을 사용하여 낙하 방향으로 트랜스펙트 시약 용액을 추가합니다. 10 밀리리터 파이펫으로 배양 배지 상수체를 수집하여 4일째에 나노블레이드를 수확하기 시작합니다.이 단계에서 배양 매체의 색상이 노란색으로 변하는 것은 정상입니다. 수집된 상체를 500G에서 5분간 원심분리하여 셀룰러 이물질을 제거하고, 셀 펠릿을 방해하지 않고 슈퍼나탄의 9밀리리터를 회수한다. 209에서 초원심분리기의 나노 블레이드를 펠릿, 섭씨 4도에서 75 분 동안 490 G.원심 분리 후, 천천히 매체를 흡인하고 차가운 PBS의 100 마이크로 리터와 흰색 펠릿을 다시 중단. 파라필름으로 튜브를 덮고 섭씨 4도에서 1시간 동안 부드러운 교반으로 배양합니다. 그런 다음, 위아래로 피펫을 하여 펠릿을 다시 다시 놓습니다.PBS에서 10% 자당 용액을 준비하고 0.2 마이크로미터 주사기 필터를 통해 필터링합니다. 10%의 2.5 밀리리터를 초원심분리기 튜브에 넣습니다. 튜브를 기울이고 천천히 수직 위치로 튜브를 올리는 동안 저속 파이펫으로 VLP 함유 샘플의 9 밀리리터를 추가합니다.로터 버킷에 튜브를 놓고 샘플을 209, 섭씨 4도에서 90분 동안 490G에서 원심분리합니다. 원심 분리 후, 상체를 조심스럽게 제거하고 튜브를 티슈 페이퍼에 거꾸로 올려 놓고 남은 액체를 제거했습니다. 교훈적 목적과 바이러스 성 펠릿의 더 나은 시각화를 위해 형광 단백질 mCherry로로드 된 나노 블레이드를 제조 할 수 있습니다.1분 후 PBS 의 마이크로리터 100개를 추가합니다. 튜브홀더에 1시간 동안 섭씨 4도의 튜브 홀더를 놓고 위아래로 파이프를 통해 펠릿을 재놓습니다. PBS의 4부권에 비이온 계면활성제를 포함하는 용해 버퍼 의 한 부피를 추가하여 희석 버퍼를 준비한다.희석 완충제와 소용돌이의 50 마이크로 리터에 농축 나노 블레이드의 두 마이크로 리터를 간단히 희석. 25 마이크로리터의 희석 완충제를 포함하는 새로운 튜브로 혼합물25 마이크로리터를 옮기고 6개의 나노블레이드 희석튜브를 갖는 절차를 반복한다. 재조합 Cas9 뉴클레아제 의 2개의 마이크로리터를 희석 완충제 50 마이크로리터에 추가하여 표준 제어를 하고, 잠시 소용돌이를 만들고, 8개의 시리얼 희석제를 만듭니다.각 VLP 희석제의 2.5 마이크로리터와 각 표준의 2.5 마이크로리터를 멀티채널 파이펫으로 니트로셀룰로오스 멤브레인에 조심스럽게 배치합니다. 입자가 흡수되면 실온에서 45 분 동안 5 % 무지방 건조 우유로 보충 된 TBST로 멤브레인을 차단하십시오. TBST를 버리고 Cas9 고추냉이 과록시다제 항체로 밤새 4도에서 멤브레인을 배양하십시오.TBST로 멤브레인을 세 번 세척하고 향상된 화학 발광 기판 키트를 사용하여 신호를 시각화합니다. 표적 세포를 나노블레이드로 변환하기 위해 세포 배양 배지를 정제 된 나노 블레이드를 포함하는 배지의 500 마이크로 리터로 대체하십시오. 4~6시간의 세포 배양을 한 후, 배지를 상시 양의 신선한 배지로 바꿉다.프로토콜에서, 세포는 24 시간 후에 다중 핵을 가진 더 큰 세포로 이끌어 내는 동기화를 형성하는 transfection의 날에 70 80%의 합류와 동질성 분포를 위해 종자되었습니다. 40 회광 후, 대부분의 세포는 싱크를 형성하고 플레이트에서 분리하기 시작했다. 나노 블레이드 내에적재된 Cas9의 양은 니트로셀룰로오스 멤브레인에 도트 블롯을 사용하여 정량화되었으며, 이는 참조 재조합 Cas9에 비해 향상된 케미발광을 나타냈다.Ca9의 알려진 양에 대해 재조합 Cas9 희석에 대한 정량화된 화학 발광 신호에 대한 보정 곡선이 플롯되었습니다. 이어서, 각 나노블레이드 제제에서 Cas9 단백질 농도를 매핑하여 배치에서 배치까지 Cas9의 다양한 농도를 드러냈습니다. T7 엔도누칼 분석은 나노 블레이드의 효율성이 배치마다 다를 수 있음을 입증했습니다.예를 들어, 한 배치는 전체 편집 효율이 20%인 반면 다른 배치는 60%의 효율을 표시하는 것으로 관찰되었습니다. 플래그-DDX3 단백질은 항플래그 아가로즈 구슬을 사용하여 면역침전을 했고, 이어서 항플래그 항체를 사용하여 회수된 단백질의 서양 얼룩 분석이 뒤따랐다. DDX3 궤적에서 플래그 태그의 사이트 지향 삽입은 삽입 부위 측면의 프라이머 또는 플래그 삽입 부위의 DDX3 로커스 하류에 특정한 전방 및 역 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 분석되었다.세포를 올바른 합류에 배치하고 세포의 균등한 분포를 얻는 것이 중요합니다. 나노 블레이드 원심 분리시, 펠릿을 다시 중단하고 농축 된 바이러스 입자의 균일 한 샘플을 얻는 것도 중요합니다. 나노 블레이드는 과학자들이 Cas9를 제공함으로써 이중 좌초 된 DNA 브레이크 수리 메커니즘을 연구하고 RNA 복합체를 신속하고 조정 된 방식으로 특정 게놈 궤적로 안내 할 수있게했습니다.그(것)들은 또한 그들의 역할을 공부하기 위하여 선천적인 면역 계통의 1 차적인 세포에 있는 긴 비코딩 RNA를 비활성화하는 가능하게 했습니다.

delivery-cas9sgrna-ribonucleoprotein-complex-immortalized-primary

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

Source: Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the procedure for generating recombinant viral particles by transfecting embryonic kidney cells with plasmids encoding viral proteins and a gene of interest.

Generation of Recombinant Viral Particles Using Embryonic Kidney Cells

이 비디오는 게놈 편집을 위해 표적 세포 내에서 Cas9-sgRNA 리보핵단백질 복합체를 나노블레이드 기반으로 전달하는 기술을 보여줍니다. 나노블레이드는 바이러스와 유사한 입자로 증식하여 주변 세포를 감염시킬 수 있는 능력이 없기 때문에 바이오 및 나노 물질의 신속한 용량 의존적 수송에 매우 유용합니다.

핵산 화물의 나노블레이드 기반 전달: 바이러스 유사 입자를 통해 Cas9-sgRNA 복합체를 표적 세포에 전달하는 기술

CRISPR / Cas9 시스템은 과학계를 대상으로 게놈 편집에 액세스하고 저렴한 만들 수있는 가능성을 제공합니다. 이 프로토콜은 CRISPR / Cas9 시스템을 사용하여 관심의 유전자를 녹아웃 한 다음 성인 마우스 뇌에 stereotaxically을 주입합니다 바이러스를 만드는 방법을 설명하기위한 것입니다.

디자인, 포장, 높은 역가 CRISPR 레트로와 렌티 배달 정위 주입을 통해

우리는 셀에 CRISPR/Cas9를 제공 하기 위한 차량으로 integrase 불충분 한 lentiviral 벡터 (IDLVs)의 생산 전략을 설명 합니다. 셀에서 편집 하는 신속 하 고 강력한 유전자를 중재 하는 능력, IDLVs 안전 제시와 유전자 배달에 대 한 동등 하 게 효과적인 벡터 플랫폼 integrase 유능한 벡터에 비해.

CRISPR/Cas9-중재 유전자 녹아웃 셀 분할에 대 한 Integrase 불충분 한 Lentiviral 벡터의 생산을 위한 프로토콜

소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.

향상 된 게놈 세포와 유기 체에서 다양 한 Cas9 Ribonucleoprotein 편집

여기, 선물이 유전자 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs)를 사용 하 여 기본 또는 확장 된 인간의 자연 킬러 (NK) 세포를 수정 하는 프로토콜. 이 프로토콜을 사용 하 여 인간 NK 세포 성장 인자-b 수용 체 2를 변형 (TGFBR2) 및 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)에 대 한 결핍을 생성 했습니다.

Cas9 Ribonucleoproteins를 사용 하 여 노크 아웃 기본 및 확장 된 인간 NK 세포의 생성

전통적인 cDNA 기반 overexpression 기법 때문에 잠재적인 기능을 가진 그들의 여러 결합 형태 긴 noncoding RNAs의 overexpression에 대 한 제한 적용을 했습니다. 이 리뷰 긴 noncoding RNA의 여러 스플라이스 변종 overexpress CRISPR 기술을 사용 하 여 프로토콜을 보고 합니다.

Overexpressing 긴 Noncoding RNAs 유전자 활성화 CRISPR를 사용 하 여

타겟 DNA epigenome 나타냅니다 편집 강력한 치료 접근. 이 프로토콜에 설명 합니다 생산, 정화, 그리고 모든-에-하나의 lentiviral 벡터 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)에서 epigenome 편집 응용 프로그램에 대 한 CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene 은닉의 농도-신경 파생.

인간으로 Epigenome 편집 도구의 효율적인 배달 lentiviral 벡터 플랫폼 유도 만능 줄기 세포 유래 질병 모델

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

인플루엔자 바이러스의 게놈은 RNA와 단백질 여덟 별도 단지, 칭했다 바이러스성 ribonucleoprotein 컴플렉스 (vRNPs)로 구성되어 있습니다. 본 논문은 글리세롤 기울기 정화 및 독감 vRNPs의 전송 전자 현미경의 시각화에 대해 설명합니다.

인플루엔자 바이러스성 Ribonucleoprotein의 단지의 정화 및 시각화

배우세요 나노블레이드를 이용한 Cas9/sgRNA 복합체 전달 방법으로 불멸 및 1차 세포에서 효율적인 유전자 편집을 수행하세요. 이 기술은 오프타겟 효과를 최소화하고 바이러스 벡터의 한계를 극복합니다.

바이러스와 같은 입자를 통해 불멸과 1 차 세포에서 Cas9/sgRNA 리보뉴클레오단백질 복합체의 전달 ("나노 블레이드")

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