초음파 트리거 약물 방출을 위한 형광 표지 마이크로 버블의 특성화를 위한 다중 시간 척도 현미경 검사법

이 프로토콜은 활성화 메커니즘 및 생체 효과를 포함하는 초음파 트리거 약물 전달 응용 프로그램을 위해 설계된 형광 표지 마이크로 버블의 반응을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다. 핵심은 우리가 다른 공간 규모와 다른 시간 규모에서 거품을 가진 초음파 트리거한 약 납품의 다단계 문제점을 해명할 수 있는 화상 진찰 기술의 조합에 있습니다. 브라이트필드 현미경검사법에 의한 단일 버블 이미징의 경우, 19 게이지 환기 바늘을 배치하고 19 게이지 바늘이 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 유리 바이알에서 소량의 마이크로버블 서스펜션을 제거하여 다음 단계에서 파이프팅을 더 쉽게 할 수 있도록 작은 튜브에 넣습니다.

파이펫을 사용하여 여과된 인산염 완충식식에서 마이크로버블 용액을 희석시 희석합니다. 10 밀리리터 주사기를 사용하여 홀더가 기포를 만들지 않고 가득 차때까지 샘플 홀더의 한 콘센트에 샘플을 주입하고 필요한 경우 더 많은 샘플을 주입하십시오. 샘플 홀더의 두 밸브를 닫고 현미경의 광학 축에 수직으로 샘플 홀더를 배치합니다.

시료 분석 전에, 임의파형 발생기에 원하는 초음파 구동 주파수 및 음향 압력을 설정하고 샘플 홀더의 한 구석에서 시야로 시작하여 XYZ 단계를 사용하여 현미경의 시야에서 단일 마이크로 버블을 찾아 홀더를 이동한 다음 수조에 연결된 광섬유를 스트로브 광에 부착하고 기록을 시작합니다. 초음파 설정당 원하는 만큼 이미징을 반복하여 샘플 홀더를 각 분석에 대해 음속없는 마이크로 버블을 포함하는 시야로 적어도 2 밀리미터 를 이동합니다. 마이크로 버블의 형광 현미경 이미징의 경우, 인산염 완충식식염으로 마이크로버블 용액을 희석한 후, 임의파형 발생기에 원하는 초음파 구동 주파수및 음향 압력을 설정하고 마이크로버블에서 나노입자의 형광 발생을 위한 펄스 지연 발생기에 레이저의 트리거 지연을 설정한 다음 XYZ 스테이지를 사용하여 샘플 홀더를 이동시켜 단일 마이크로버블을 찾아서 초점을 맞춥니다. 그런 다음 기록을 트리거합니다.

초음파 설정을 변경하고 샘플 홀더를 새로운 시야로 이동하여 원하는 대로 이미징을 반복합니다. 인트라바이탈 현미경 검사법에 의한 이미징의 경우, 먼저 웨이브 가이드와 목표 사이의 XY 포지셔닝 스테이지에 가열된 동물 홀더를 배치하고 웨이브 가이드에 커플링 젤을 추가합니다. 마취종양 베어링 마우스의 꼬리 정맥 카테터를 꼬리 정맥에 삽입하고 창문 챔버가 장착된 마우스를 가열 홀더에 놓습니다.

커버슬립에 물방울을 넣습니다. 종양 조직 혈관을 시각화하기 위해, 정맥 내 30 밀리리터 당 4 밀리그램의 마이크로리터를 형광으로 표시2 메가달톤은 테일 정맥 카테터에 덱을 표시하고 적절한 혈관을 가진 시야가 위치 할 때까지 마우스를 이동XY 번역 단계를 사용합니다. 실험의 매개 변수에 따라 기록의 프레임 속도, 시야 및 길이를 조정하고 용기의 기준선을 기록합니다.

기준선 영상을 획득하면 임의파형 발생기에서 초음파 구동 주파수, 펄스 길이 및 음향 압력 진폭을 설정하고 50 마이크로버블 샘플을 꼬리 정맥에 정맥으로 주입한다. 그런 다음 입증된 바와 같이 혈관을 이미지화합니다. 공초점 형광 현미경검사법에 의한 마이크로버블의 분석은 마이크로버블 쉘의 비균일입자 분포를 나타낸다.

마이크로 버블의 전체 구조는 전자 현미경 검사를 스캔하여 더 시각화 할 수 있습니다. 브라이트필드 현미경검사법에 의한 음골화된 마이크로버블의 방사형 역학 및 현상학적 거동을 분석하면 시간이 지남에 따라 마이크로버블 반경의 상대적 변화를 평가할 수 있다. 여기서, 형광표지 나노입자의 전형적인 성공적인 전달의 이미지 시퀀스가 도시된다.

마이크로 버블 쉘에 내장된 나노 입자는 레이저 빛이 거품에 도달하면 형광을 관찰할 수 있다. 그러나 이러한 실패한 전달에서 관찰된 바와 같이, 형광 나노입자는 초음파 노출 중에 그대로 유지되는 마이크로버블의 껍질에 빛납니다. 인트라바이탈 다광광화상은 초음파 노출 시 나노입자의 공간적 및 측두화 를 결정하는 데 사용될 수 있으며, 이는 초음파 매개 나노입자 전달의 기전을 이해하고 최적화하는 데 도움이 될 수 있다.

모든 길이와 시간 척도에서 광학 및 음향 경로의 완벽한 정렬로 초음파 트리거 약물 전달에 대한 포괄적 인 통찰력이 제공됩니다. 우리의 다중 규모의 실험에 의해 전달된 대답은 이제 임상 사례로 번역될 것입니다. 결과는 암 치료를 포함하여 치료 응용 프로그램의 범위에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 것입니다.