Name: 점성-관성 포스 제팅을 번갈아 가며 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어의 3D 프린팅 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 32 s
Description: 학습하세요 점성-관성 포스를 번갈아 사용하는 온화한 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어 3D 프린팅 기법을 통해 세포 포집 및 기능성 미세조직 구축을 위한 생물학적 적합성과 제어 가능성을 확보하는 방법을.

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이 작품은 베이징 자연과학 재단(3212007), 칭화대학교 이니셔티브 과학 연구 프로그램(20197050024), 칭화대학교 봄바람기금(20201080760), 중국 국립자연과학재단(51805294), 중국 국립지질과학재단(2018YFA0703004), 111개 프로젝트(B17026)가 후원했다.

1. 세포 배양
<ol><li>고혈당 덜벡코의 수정된 최소 필수 매체(H-DMEM)를 10% 태아소 혈청(FBS), 1% 비필수 아미노산 용액(NEAA), 1% 페니실린 G 및 연쇄절제술증, 1% 글루타민 보충제를 A549 세포배양매체로 보충한다.</li>
	<li>37°C에서 CO2 인큐베이터에 있는 배양 A549 세포와 5% CO2
</li>
	<li>약 80%의 합류에서 트립신을 사용하여 하위 배양을 위한 세포를 해리합니다.<ol>
<li>3mL의 트립신을 사용하여 T75 배양물에서 37°C에서 3분 동안 플라스크를 치료한 다음 배양 배지 6mL을 추가하여 트립시화를 중지합니다.</li>
		<li>느슨하게 부착 된 세포를 수확하는 배양 배지를 피펫.</li>
		<li>원심 분리기 는 72.5 x g 에서 3 분 동안. 상체를 제거하고 신선한 매체의 3mL로 다시 중단합니다.</li>
		<li>1mL의 새로운 T75 배양 플라스크에 1mL의 세포 현탁액을 신선한 배지의 10mL를 함유한다. 2일마다 배양 매체를 변경합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 노즐 준비
<ol><li>제조업체의 지시에 따라 유리 마이크로 파이프를 풀러에 로드합니다. 마이크로 제트 파이프의 외부 직경, 내부 직경 및 길이는 각각 1.5mm, 1.1mm 및 100mm입니다.</li>
	<li>풀러에 대한 당기는 매개 변수를 설정합니다. 구체적으로, 열, 당기기, 속도, 시간 및 압력의 값은 기본적으로 각각 560, 255, 255, 150 및 500으로 설정됩니다. 이러한 매개 변수 에서 노즐을 당깁니다. 주의: 이륙 후 얻은 노즐은 매우 날카롭고 부주의한 수술로 인해 부상을 입을 수 있습니다.</li>
	<li>제조업체의 지시에 따라 마이크로 포지 장치에 의해 지정된 직경에서 생성된 노즐(2.2단계)을 잘라 내어 특정 팁 직경을 얻습니다. 구체적으로, 가열 된 백금 와이어에 노즐의 지정된 직경을 찾습니다. 와이어를 약 5s에 대해 60 °C까지 가열하고 노즐을 분리합니다.</li>
	<li>노즐의 인쇄헤드를 소수성 제제에 30분 동안 담그고, 그 다음에는 멸균된 물로 헹구는 세 사이클을 제공합니다.</li>
	<li>인쇄하기 전에 노즐을 알코올로 5분 동안 살균하고 살균된 물로 세 번 헹구어 잔류 알코올을 제거합니다.</li>
</ol>3. 하이드로겔 바이오잉크 준비
<ol><li>NaCl(0.45 g)을 멸균수 50mL에 녹여 0.9%(w/v) NaCl 용액을 얻습니다. 용해를 촉진하기 위해 솔루션을 진동합니다. 완전히 용해 된 후 0.45 μm 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필터 멤브레인을 통해 용액을 필터링합니다.</li>
	<li>저점도 나트륨 알기네이트 분말(1g)을 계량하고 NaCl 용액(Step 3.1)의 25mL에 하룻밤 사이에 60-80°C의 고온에서 용해하여 4%(w/v) 나트륨 알기네이트 스톡 용액을 얻습니다. 스톡 용액은 1개월 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>알긴산 나트륨 스톡 용액(3.2단계)을 오븐(70°C)에서 3회 가열하여 30분 간 살균한다.</li>
	<li>알기네이트 나트륨 재고 용액(3.3단계)을 0.9% NaCl 용액(3.1단계)으로 희석하여 2%, 1.5%, 0.5%(w/v)로 희석합니다. 참고: 오븐에서 가열하는 것 외에도, 알기네이트 나트륨 용액의 다른 준비 과정은 후드에서 수행되어야 합니다.</li>
	<li>4%(w/v) 젤라틴 스톡 용액을 얻기 위해 하룻밤 사이에 60-80°C의 고온에서 NaCl 용액(Step 3.1)의 25mL에 젤라틴 분말 1g을 녹입니다. 스톡 용액은 1개월 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>젤라틴 스톡 용액(3.5단계)을 오븐(70°C)에서 3회 가열하여 30분 간 살균한다.</li>
	<li>젤라틴 주식 용액의 적절한 부피(3.6단계)를 0.9% NaCl 용액(단계 3.1)으로 희석하여 1.5%(w/v)의 농도로 희석합니다. 참고 : 오븐에서 가열하는 것 외에도 젤라틴 용액의 다른 준비 과정이 후드에서 수행되어야합니다.</li>
	<li>마이크로 캐리어에 세포 결합을 촉진하기 위해, 2 % (w /v) 나트륨 알기네이트 용액과 3 :1의 비율로 쥐 꼬리 (4 mg / mL)에서 타입 I 콜라겐 용액을 혼합하여 알지네이트 콜라겐 용액을 준비합니다. 0.1 M NaOH 솔루션으로 pH 7.2로 솔루션을 조정하고 준비 후 즉시 사용하십시오.</li>
	<li>티로신 변형 HA flocculent 고체인 인산완충식 살린(PBS) 용액을 하룻밤 사이에 60-80°C에서 용해하여 티로신 변형 히알루론산 PBS 용액을 0.8% w/w로 확보한다. 스톡 용액은 1개월 동안 4°C로 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>30분 동안 오븐(70°C)에서 3회 가열하여 티로신 변형 HA PBS 용액을 살균한다.</li>
	<li>PBS 용액에 고추냉이 과산화효소 분말(500효소 활성 단위/mg)을 용해하여 8개의 효소 활성 유닛/mg 고추냉이 과산화구체 PBS 용액을 확보한다.</li>
	<li>디워터에서 4mM로 과산화수소 용액(30%, w/w)을 희석시 희석시켰다.</li>
	<li>티로신 변형 히알루론산 PBS 용액과 고추냉이 과록시다제 PBS 용액을 1:1의 비율로 혼합하여 수정된 HA-고추냉이 과록시다제 용액을 준비한다. 참고: 오븐에서 가열하는 것 외에도 HA-고추냉이 과산화제 용액의 다른 준비 과정이 후드에서 수행되어야 합니다.</li>
</ol>4. AVIFJ를 기반으로 한 마이크로 드롭렛 형성
<ol><li>이전에 보고된 대로 가정용 세포 인쇄 시스템을 사용합니다(그림 1A)26. 파형 발생기의 전기 신호 출력은 먼저 증폭된 다음 압전 세라믹을 구동하여 제어 가능한 변형을 생성합니다. 압전 세라믹에 고정된 노즐은 제어 가능한 진동을 생성합니다.</li>
	<li>하룻밤 사이에 75%(v/v) 알코올및 자외선(UV)으로 닦아 인쇄 시스템을 살균합니다.</li>
	<li>일회용 멸균 주사기에 5mL의 바이오잉크(3.1단계)를 적재한다. 주사기 펌프에 주사기를 설치합니다.</li>
	<li>주사기(4.3단계) 및 노즐(2.5단계)을 내부 직경 1mm의 실리콘 호스와 연결합니다.</li>
	<li>클램핑 나사의 압박감을 조정하여 인쇄에 사용할 노즐(4.4단계)을 수정합니다. 노즐 의 끝은 손상과 오염을 방지하기 위해 설치 하는 동안 기판에서 멀리 유지. 주의: 설치 중에 노즐이 파손된 경우 두꺼운 장갑을 착용하고 유리 조각과 잔류물을 조심스럽게 청소하십시오.</li>
	<li>주사기 펌프를 빠르게 밀어 노즐(4.5단계)에 바이오잉크(4.3단계)를 적재한다. 유량을 30 μL/분으로 설정합니다. 끝에 여분의 재료를 닦아.</li>
	<li>신호 발생기 매개 변수를 설정합니다. 500,000개의 샘플링 점을 포함하는 자체 설계 파형을 가져옵니다. 샘플링 속도와 피크-투-피크 전압(Vpp)을 각각 500만 개의 샘플/s 및 10V로 설정합니다.</li>
	<li>깨끗한 슬라이드 또는 탈온화 된 물로 페트리 요리. 노즐 아래에 인쇄 기판으로 놓습니다.</li>
	<li>모션 경로를 미리 설정하고 진동 모드를 주문형 드롭으로 트리거합니다.</li>
	<li>미리 설계된 패턴에 따라 액적을 인쇄합니다.</li>
</ol>5. AVIFJ를 기반으로 하는 마이크로 캐리어 형성
<ol><li>반복 단계 4.1-4.4, 바이오 잉크를 2% (w/v) 알기네이트 용액(단계 3.4), 알기네이트 콜라겐 용액(Step 3.8) 또는 수정된 HA-고추냉이 과록시다제 용액(step 3.13)으로 변경하는 것을 제외하고는.</li>
	<li>염화칼슘 3g을 멸균수 100mL에 녹여 3%(w/v) 염화칼슘 용액을 얻습니다. 완전히 용해 된 후 0.45 μm 폴리에틸렌 테레프탈레이트 필터 멤브레인을 통해 용액을 필터링합니다.</li>
	<li>5mL의 교차 연결 용액(염화칼슘 용액 또는 과산화수소 용액)을 페트리 접시에 넣습니다. 페트리 접시를 노즐 아래에 놓아 기판으로 작동합니다.</li>
	<li>인쇄 후 마이크로 캐리어를 3 분 동안 교차 연결합니다.</li>
	<li>원심분리기 튜브에서 마이크로캐리어 서스펜션을 수집하고, 3분 동안 29 x g 의 원심분리로 마이크로캐리어를 풍부하게 합니다. 약 600 마이크로 캐리어 / mL에서 문화 매체에서 마이크로 캐리어를 다시 중단합니다.</li>
</ol>6. 마이크로 캐리어의 표면에 세포를 접종
<ol><li>세포의 관찰을 용이하게 하기 위해 세포 추적기 녹색 CMFDA를 가진 스테인 A549 세포. 구체적으로, 배양 매체를 제거하고, 10 μM 셀 트래커 염료를 함유한 혈청 없는 배지 5mL를 추가하고, 인큐베이터에서 30분 동안 세포를 배양한다. 그런 다음 염료 용액을 신선한 매체로 대체합니다.</li>
	<li>1.6 x 106 세포/mL의 밀도로 A549 세포 현탁액을 다시 중단합니다.</li>
	<li>알기네이트 콜라겐 마이크로캐리어 서스펜션(Step 5.3)과 A549 세포 서스펜션(Step 6.1)의 1mL을 저부착 6웰 배양판에 넣습니다.</li>
	<li>플레이트를 37°C 및 5% CO2의 인큐베이터에 30rpm에 셰이커에 놓습니다.</li>
	<li>셰이커에서 접시를 꺼내 마이크로 캐리어가 정착 할 때까지 30 분 기다립니다. 절반은 2일마다 배양 매체를 변경합니다.</li>
</ol>7. 마이크로 드롭렛 /마이크로 캐리어 형성의 분석
<ol><li>노즐(2.2단계), 페트리 접시(4.10 단계 및 단계 5.4), 미세 운반체(6.5단계)를 가진 세포를 관찰하고 측정하여 밝은 필드 현미경 또는 공초점 현미경으로 측정한다. 구체적으로, 객관적배율은 4배, 10배, 20배이고 접안의 배율은 10배이다.</li>
	<li>ImageJ 소프트웨어로 마이크로 캐리어의 직경을 측정합니다. 사진에서 촬영할 때 현미경과 함께 제공되는 스케일 바에 따르면 ImageJ에서 스케일의 실제 크기를 설정하고 마이크로 캐리어의 반경 또는 반경 또는 반주요 축의 10 줄을 그립니다. ImageJ는 이러한 선 세그먼트의 평균 크기와 표준 편차를 얻을 수 있습니다.</li>
</ol>

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<li>Hassan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+inks+and+extrusion-based+3D+printing+of+2D+materials%3A+a+review+of+current+research+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22NANOSCALE%22%5BJournal%5D)">Functional inks and extrusion-based 3D printing of 2D materials: a review of current research and applications.</a> NANOSCALE. 12, 19007-19042 (2020).</li>
<li>Vithani, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+3D+printing+technologies+for+soft+materials+and+potential+opportunities+for+lipid-based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+Research%22%5BJournal%5D)">An overview of 3D printing technologies for soft materials and potential opportunities for lipid-based drug delivery systems.</a> Pharmaceutical Research. 36, (2019).</li>
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저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 다중 유형의 하이드로겔 마이크로 캐리어 및 후속 세포 파종의 제조를 위한 지침을 제공합니다. 미세 유체 칩 및 잉크젯 인쇄 방법에 비해 마이크로 캐리어를 구축하는 AVIFJ 접근 방식은 더 큰 유연성과 생체 적합성을 제공합니다. 독립적인 노즐은 유리 마이크로파이프를 포함한 다양한 경량 노즐을 이러한 인쇄 시스템에 사용할 수 있습니다. 제어성이 높은 처리는 저수지의 부피, 내부 직경 및 인쇄헤드의 모양을 포함한 파라미터를 자유롭게 조정할 수 있게 합니다. 또한 일회용 노즐은 여러 물질 중전환을 위한 살균을 용이하게 하여 반복적인 사용으로 인한 잠재적 오염을 방지합니다. 마지막으로, 작고 빠른 변위는, 대신 심한 힘과 열 조건, 인쇄 공정 동안 노즐에 직접 작용하여 인쇄된 바이오잉크의 원래 물리적 및 화학적 특성을 최대 범위까지 유지한다. 이 기능은 생체 재료 응용 분야에 매우 매력적입니다.
올바른 크기의 마이크로 캐리어의 성공적인 생산을위한 가장 중요한 단...

마이크로 캐리어는 직경 60-250 μm및 큰 특정 표면적을 가진 구슬이며 일반적으로 세포의 대규모 배양에 사용된다1,2. 그들의 외부 표면은 세포에 대한 풍부한 성장 부위를 제공하고, 내부는 공간 확산을위한 지원 구조를 제공합니다. 구형 구조는 또한 pH, O2 및 영양소와 대사 산물의 농도를 포함한 파라미터를 모니터링하고 제어하는 데 편리함을 제공합니다. 교반탱크 생물반응기와 함께 사용하면 마이크로캐리어는 기존 배양에 비해 상대적으로 적은 부피로 더 높은 세포 밀도를 달성할 수 있어 대규모 배양3를 달성하는 비용 효율적인 방법을 제공한다. 마이크로캐리어 배양 기술은 세포학 연구의 주요 기술 중 하나가 되었으며, 줄기세포, 간세포, 연골세포, 섬유아세포 및 기타 구조물의 대규모 확장 분야에서 많은 진전이 이루어지고 있다. 그(것)들은 또한 이상적인 약 납품 차량 및 상향식 단위로, 그러므로 임상 약 검열 및 체외 조직 공학 수리에 있는 점점 중요한 역할을 취하는 것으로 밝혀졌습니다5.
다양한 시나리오에서 기계적 특성 요구 사항을 충족하기 위해 여러 유형의 하이드로겔 재료가 마이크로 캐리어 6,7,8,9,10,11의 건설에 사용하기 위해 개발되었습니다. 알기네이트와 히알루론산(HA) 하이드로겔은 생체 적합성과 교차 연결성 12,13로 인해 가장 많이 사용되는 마이크로캐리어 물질 중 두 가지입니다. 알기네이트는 염화칼슘에 의해 쉽게 교차 연결될 수 있으며, 그 기계적 특성은 교차 연결 시간을 변경하여 변조될 수 있다. 티라민-공주 HA는 과산화수소와 고추냉이 과산화기 과산화기과 고추냉이 과산화기과 고추냉이에 의해 촉매된 티라민 모에이티의 산화 결합에 의해 교차 연결됩니다. 콜라겐은 독특한 나선형 구조와 교차 연결된 섬유 네트워크로 인해 종종 세포 부착을 촉진하기 위해 마이크로 캐리어에 혼합하는 보조체로 사용됩니다15,16.
마이크로 캐리어를 준비하기위한 현재 의 방법은 미세 유체 칩을 포함, 잉크젯 인쇄, 및 전기 스프레이17,18,19,20,21,22,23. 미세 유체 칩은 균일한 크기의 마이크로 캐리어24를 생산하는 데 빠르고 효율적인 것으로 입증되었습니다. 그러나 이 기술은 복잡한 흐름 채널 설계 및 제조 프로세스25에 의존합니다. 잉크젯 인쇄 시 고온 또는 과도한 압출력뿐만 아니라 전기 스프레이 접근법에서 강렬한 전기장은 재료, 특히 생물학적 활성의 특성에 부정적인 영향을 미칠 수 있다19. 또한, 다양한 생체 재료와 직경에 적용될 때, 이러한 방법에 사용되는 맞춤형 노즐은 제한된 처리 복잡성, 높은 비용 및 낮은 유연성을 초래합니다.
마이크로캐리어 준비를 위한 편리한 방법을 제공하기 위해, 수레겔 마이크로캐리어를 시공하기 위해 점성-관성력 분사(AVIFJ)를 번갈아 하는 3D 프린팅 기술이 적용되었다. 이 기술은 수직 진동 중에 발생하는 하향 구동력과 정적 압력을 활용하여 노즐 팁의 표면 장력을 극복하고 물방울을 형성합니다. 가혹한 힘 및 열 조건 대신, 작은 급속한 변위는 인쇄 도중 노즐에 직접 작용하여 생잉크의 물리화학적 특성에 사소한 영향을 미치고 생리 활성 물질에 대한 큰 매력을 제시합니다. AVIFJ 방법을 활용하여 직경 100-300 μm의 다중 생체 재료의 마이크로 캐리어가 성공적으로 형성되었습니다. 게다가, 마이크로 캐리어는 세포를 잘 결합하고 부착 된 세포에 적합한 성장 환경을 제공하는 것이 더 입증되었다.

<table><tbody><tr><td>A549 세포</td>, <td>ATCC</td>, <td>CCL-185</td>, <td>인간 비소세포, 폐암 세포주</td></tr>, <tr><td>명시야 현미경</td>, <td>올림푸스</td><td>DP70</td><td></td></tr>, <tr><td>컨포칼 현미경</td>, <td>니콘</td>, <td>TI-FL</td><td></td></tr>, <tr><td>소 태아 혈청, FBS, BI,</td><td>04-001-1ACS</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>젤라틴</td><td>, SIGMA</td>, <td>G1890</td><td></td></tr>, <tr><td>유리 마이크로피펫,</td><td>셔터 기기</td><td>b150-110-10</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>GIBCO</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>H-DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11960-044</td><td>Dulbecco의 변형 독수리 배지</td></tr><tr><td>양 고추 냉이 퍼 옥시 다제 분말</td><td>SIGMA</td><td>P6782</td><td></td></tr><tr><td>소수성 제</td><td>3M</td><td>PN7026</td><td>제조업체의 지침을 따르고 희석 후 사용하십시오</td></tr><tr><td>Micro-forge 장치</td><td>narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산, NEAA</td><td>GIBCO</td><td>11140-050</td><td>비필수 아미노산</td></tr><tr><td>페니실린 G 및 스트렙토마이신</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>SIGMA</td><td>P5731-500EA</td><td></td></tr><tr><td>풀러</td><td>셔터 기기</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>알긴산 나트륨</td><td>SIGMA</td><td>A0682</td><td></td></tr><tr>쥐꼬리 <td>SIGMA</td><td>C3867</td><td></td>의 Trypsin GIBCO 25200-056<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 유형 I 콜라겐 용액</tbody></table>

점성-관성 포스 제팅을 번갈아 가며 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어의 3d 프린팅

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

마이크로 캐리어는 직경 60-250 μm및 대규모 세포 배양을 위한 운반체로 일반적으로 사용되는 큰 특정 표면적을 가진 구슬입니다. 마이크로 캐리어 배양 기술은 세포 학 연구의 주요 기술 중 하나가되었으며 대규모 세포 확장 분야에서 일반적으로 사용됩니다. 마이크로 캐리어는 또한 체외 조직 엔지니어링 건설 및 임상 약물 선별에서 점점 더 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 마이크로 캐리어를 준비하기위한 현재 의 방법은 종종 복잡한 흐름 채널 설계, 호환되지 않는 2 상 인터페이스 및 고정 노즐 모양에 의존하는 미세 유체 칩과 잉크젯 인쇄를 포함한다. 이러한 방법은 여러 바이오잉크에 적용될 때 복잡한 노즐 처리, 불편한 노즐 변경 및 과도한 압출력의 과제에 직면해 있습니다. 이 연구에서는, 번갈아 점성-관성 힘 제팅이라고 불리는 3D 프린팅 기법이 직경 100-300 μm의 하이드로겔 마이크로 캐리어의 건설을 가능하게 하기 위해 적용되었다. 세포는 이후에 조직 공학 모듈을 형성하기 위해 마이크로 캐리어에 시드되었다. 기존 방법에 비해 이 방법은 무료 노즐 팁 직경, 유연한 노즐 스위칭, 인쇄 파라미터의 자유로운 제어, 광범위한 생리활성 재료에 대한 가벼운 인쇄 조건을 제공합니다.

다양한 수렴속도와 직경의 인쇄헤드는 여러 유형의 재료의 인쇄를 달성하기 위해 제작되었습니다. 당김 강도가 증가하여 얻은 노즐은 도 1B에 도시된다. 노즐은 저수지(III), 수축(II), 프린트헤드(I)의 세 가지 영역으로 나뉘었다. 저수지는 노즐의 처리되지 않은 부분으로, 액체가 인쇄를 위한 정적 압력 및 생체 잉크 입력을 제공했습니다. 수축 지역은 하향 구동력을 생성하는 주요 부분이었다. 당김 강도는 프린트헤드에 큰 영향을 미쳤으며, 확장된 풀 강도로 낮은 수렴률을 보여 줬다. 인쇄 중 표면 장력을 높이고 이산 마이크로드롭렛형성이 더 어려워졌지만, 후속 작업에서 직경이 작은 팁을 절단하는 것이 촉진되었습니다. 그 후, 바늘 위조 기구와 함께, 인쇄헤드는 지정된 직경(도 1C)에서 차단되었다. 100, 120, 150 및 200 μm을 포함한 다양한 직경의 팁은 다양한 체외 미세 조직의 요구 사항을 충족하...

하이드로겔 마이크로캐리어의 시공을 가능하게 하는 점성 관성력을 번갈아 가며 구동되는 온화한 3D 프린팅 기술이 여기에 제시되어 있다. 수제 노즐은 유연성을 제공하므로 다양한 재료와 직경을 쉽게 대체할 수 있습니다. 직경 50-500 μm의 세포 결합 마이크로 캐리어는 추가 배양을 위해 얻어서 수집할 수 있습니다.

점성-관성 포스 제팅을 번갈아 가며 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어의 3D 프린팅

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...

우리는 좋은 제어 및 생체 적합성마이크로 캐리어를 준비하기위한 가벼운 생체 인쇄 공정을 제공합니다. 세포에 의해 캡슐화 한 후, 캐리어는 또한 체외 세포 확장 및 기능적 미세 조직 구조에 사용될 수있다. 제한된 변위는 유사한 조건하에서 심한 힘이 아니라 인쇄 공정 중에 노즐에 작용하여 바이오 잉크의 원래 물리적/화학적 특성을 최대 범위까지 유지합니다.종래의 마이크로캐리어 외에도, 내부 세포 분포 또는 트리토신 캡슐 캡슐 구조를 가진 단위는 상이한 조직 구조의 조립에 생성및 적용될 수 있다. 노즐 준비를 위해 제조업체의 지시에 따라 유리 마이크로 파이프를 풀러에 로드하고 풀러의 당김 매개 변수를 설정합니다. 마이크로포지를 사용하여 지정된 직경의 노즐을 차단하여 실험에 대한 특정 팁 직경을 얻고 5 분 동안 알코올의 노즐을 살균하십시오.그런 다음 노즐을 멸균물로 세 번 헹구어 잔류 알코올을 제거합니다. 하이드로겔 바이오 잉크를 제조하기 위해 염화나트륨 0.9% 0.9%에서 염화나트륨 0.9%, 1, 1.5, 중량별 농도 2%로 희석하였다. 마이크로 드롭렛 형성을 위해, 일회용 멸균 주사기에 바이오 잉크의 5 밀리리터를로드하고 주사기 펌프에 주사기를 설치합니다.1mm 의 내직경 호스를 사용하여 주사기와 인쇄 노즐을 연결합니다. 클램핑 나사를 조여 노즐을 제자리에 고정하고 주사기 펌프를 빠르게 누르고 바이오 잉크를 노즐에 적재합니다. 신호 발생기 매개 변수를 설정하고 모션 경로 및 진동의 트리거 모드를 미리 설정하여 온디맨드드롭합니다.그런 다음 미리 설계된 패턴에 따라 물방울을 인쇄합니다. 마이크로캐리어 형성의 경우, 페트리 접시에 교차 연결 용액 5밀리리터를 추가하고 인쇄 노즐 아래에 접시를 기판으로 놓습니다. 인쇄 후 마이크로캐리어를 3분간 크로스링크한 후 마이크로캐리어 서스펜션을 원심분리기 튜브로 옮기면 됩니다.그런 다음, 원심분리에 의해 마이크로 캐리어를 풍부하게하고 밀리리터 당 약 600 마이크로 캐리어에서 적절한 배양 배지에서 다시 중단. 그들의 접종 전에, 세포 배양에 있는 30 분 인큐베이션을 위한 10 micromolar 세포 추적기 녹색 CMFDA 염료로 보충된 혈청 없는 매체의 5밀리리터로 A549 세포 배양의 상체를 대체합니다. 인큐베이션의 끝에서, 염료 용액을 신선한 배지로 대체하고 배지의 밀리리터 당 6개의 세포로 1.6배 10배의 밀도로 세포를 재일시 중단한다.세포에 마이크로 캐리어 서스펜션

3d-printing-vitro-hydrogel-microcarriers-alternating-viscous-inertial

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

bioprinter는 희생 형에 따라 패턴 하이드로 겔을 만드는 데 사용되었다. 폴록 사머 형은 두 번째 히드로 겔로 채워질 그리고 세 번째 하이드로 겔로 채워졌다 빈 공간을 남겨 용출되었다. 이 방법은 생체 고분자의 복잡한 구조를 생성하는 빠른 용출과 폴록 사머의 좋은 인쇄 적성을 사용합니다.

모방의 창조 3D 세포 배양을위한 두 구성 요소 히드로 겔에 대한 Thermoresponsive 역 금형 인쇄

물방울 인터페이스 지질 이중층에 대한 미세 유체 분사는 막 비대칭, 횡단 단백질의 결합, 재료의 캡슐화 제어와 소포를 생성 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 구획화 된 생체 분자가 소망되는 생물학적 시스템의 다양한 연구에 적용 할 수있다.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

3 차원 (3D) 미세 복합 빔은 3 차원 다공성 미세 유체 네트워크로 나노 복합 재료의 감독 및 지역화 침투를 통해 제조된다. 이 제조 방법의 유연성은 기능적 3D 강화 나노 복합체 거시적 다양한 제품을 달성하기 위해 서로 다른 열경화성 재료와 nanofillers의 이용을 가능하게한다.

미세 유체 침투를 통해 세 가지 차원 미세 구조 나노 복합 재료의 제조

프로토콜 분해성 thermoresponsive hydrogels hydrazone 대량 규모, 미, 그리고 나노, 젤 나노 입자 및 nanofibers의 준비에 대 한 후자에 고분자 올리고의 cross-linking에 따라 제작에 대 한 설명 합니다.

자기 조립, 분해 Thermoresponsive Hydrogels 반응 압출, 마이크로, 통해 여러 길이 가늠 자에를 조작 하 고 전기

UV crosslinkable hydrogels 처리 첨가제 제조 전략 개발 되었습니다. 이 전략 ﹙ 하이드로 겔 구조의 레이어, 레이어 조립 뿐만 아니라 저조한 자석 회전에 반응 하는 움직이는 구성 요소를 포함 하는 통합된 장치 독립적인 구성 요소, 어셈블리 허용 한다.

첨가제 제조 기술은 자석으로 응답 구성 요소와 히드로 기반 Micromachines의 손쉬운 고 빠른 제작을 위해

우리 불멸 하 게 종양 및 섬유 세포 bioprintable alginate/젤라틴 bioink에 포함 된 구성 된 이기종 유 방 암 모델 개발. 모델이 비보에 종양 microenvironment tumorigenesis 운전 메커니즘에 대 한 통찰력을 양보 하는 다세포 종양 spheroids의 형성을 촉진 한다.

셀 회전 타원 체 형성을 유발 하는 모델 시스템에 3D 생체 외에서 Bioprintable Alginate/젤라틴 하이드로 겔

여기에 제시된 젤라틴 메타크릴로일의 3D 바이오프린팅을 위한 방법이다.

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

여기서, 우리는 캡슐화된 세포의 침전을 방지하기 위하여 액체 같이 bioinks (낮은 점도를 가진 젤라틴 methacryloyl)를 위한 새로운 다층 수정 전략을 개발했습니다.

다층 하이드로겔 바이오잉크를 3차원 바이오프린팅에 사용하여 균일한 세포 분배

엔지니어링 플랩은 통합된 기능적 혈관 네트워크가 필요합니다. 이 프로토콜에서, 우리는 계층 적 혈관 네트워크와 쥐 대퇴 동맥에 대한 직접적인 미세 외과 적 해부학을 포함하는 3D 인쇄 된 조직 플랩을 제작하는 방법을 제시합니다.

3D 프린팅 기술을 이용한 혈관 플랩 제작

하이드로겔 형성 중 전단 처리는 전단력이 제거된 후 전단이 얇지만 빠르게 재구성되는 마이크로겔 현탁액의 생성을 초래합니다. 이러한 물질은 바이오프린팅 복합체, 세포 함유 구조의 지지 매트릭스로 사용되었습니다. 여기서는지지 베드 및 호환 가능한 바이오 잉크를 제조하는 데 사용되는 방법을 설명합니다.

부유 된 3D 바이오 프린팅을위한 겔화 동안 전단 처리에 의해 형성된 Agarose 유체 겔

이 연구는 새로운 κ-carrageenan 서브 마이크로겔 현탁액 수조를 소개하여 놀라운 가역적 재밍-언재밍 전이 특성을 보여줍니다. 이러한 특성은 임베디드 3D 바이오프린팅에서 생체 모방 조직 및 장기를 구성하는 데 기여합니다. 고해상도와 세포 성장으로 심장/식도 유사 조직의 성공적인 프린팅은 고품질 바이오프린팅 및 조직 공학 응용 분야를 보여줍니다.

κ-Carrageenan Sub-Microgel Medium을 사용한 조직 유사 구조의 임베디드 바이오프린팅

학습하세요 점성-관성 포스를 번갈아 사용하는 온화한 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어 3D 프린팅 기법을 통해 세포 포집 및 기능성 미세조직 구축을 위한 생물학적 적합성과 제어 가능성을 확보하는 방법을.

점성-관성 포스 제팅을 번갈아 가며 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어의 3D 프린팅

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