Name: Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: 배우세요 Scipion을 활용한 극저온 전자현미경 단일 입자 분석 방법을 통해 고해상도 3D 구조 재구성을 수행하는 기술입니다. 다양한 이미지 처리 패키지 통합으로 생물학적 구조 연구의 정확성과 재현성을 높입니다.

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저자는 에서 경제적 지원을 인정하고 싶습니다: 보조금을 통해 과학 혁신의 스페인 부: PID2019-104757RB-I00/AEI/10.13039/501100011033, 그랜트를 통해 "코무니다드 Autónoma 드 마드리드" 그랜트를 통해: S2017/BMD-3817, 인스티투토 드 살루드 카를로스 III, PT17/0009/0010 (ISCIII-SGEFI/ERDF), 유럽 연합(EU) 및 호라이즌 2020 보조금: 교육 - ULTRA (INFRADEV-03-2016-2017, 제안: 731005), EOSC 생활 (INFRAOSC-0418, 2418 824087), iNEXT - 디스커버리 (제안 : 871037), 및 HighResCells (ERC - 2018 - SyG, 제안 : 810057). 이러한 결과를 낳은 프로젝트는 "라 카이사"재단 (ID 100010434)의 펠로우십의 지원을 받았다. 펠로우십 코드는 LCF/BQ/DI18/11660021. 이 프로젝트는 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 No. 713673 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에서 자금을 받았습니다. 저자는 랜드마크 ESFRI 프로젝트인 지도의 지원과 자원의 사용을 인정합니다.

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현재, 저온-EM은 생물학적 샘플의 3D 구조를 드러내는 핵심 도구입니다. 현미경으로 좋은 데이터를 수집하면 사용 가능한 처리 도구를 사용하면 연구 하에 거대 분자의 3D 재구성을 얻을 수 있습니다. Cryo-EM 데이터 처리는 거대 분자의 기능 적 행동을 이해하는 열쇠이며 약물 발견에서도 중요한 거의 원자 해상도를 달성 할 수 있습니다.
Scipion은 통합 방식으로 가장 관련성이 뛰어난 이미지 처리 패키지를 결합한 전체 워크플로우를 만들 수 있는 소프트웨어로 전체 이미지 처리 워크플로우의 추적성과 재현성을 지원합니다. Scipion은 처리를 수행하는 매우 완벽한 도구 세트를 제공합니다. 그러나 고해상도 재구성을 얻는 것은 획득한 데이터의 품질과 이러한 데이터가 처리되는 방식에 완전히 달려 있습니다. 
고해상도 3D 재구성을 위해 첫 번째 요구 사항은 구조적 정보를 고해상도로 보존하는 현미경으로부터 좋은 영화를 얻는 것입니다. 그렇지 않은 경우 워크플로는 데이터에서 고화질 정보를 추출할 수 없습니다. 그런 다음 성공적인 처리 워크플로우가 구조에 실제로 해당하는 입자를 추출하고 3D 공간에서 이러한 파티클의 방향을 찾을 수 있어야 합니다. 워크플로의 단계가 실패하면 재구성된 볼륨의 품질이 저하됩니다. Scipion은 모든 처리 단계에서 다른 패키지를 사용할 수 있으므로 데이터를 처리하는 가장 적절한 방법을 찾는 데 도움이 됩니다. 또한 다양한 방법의 예상 출력에서 합의를 찾아 정확도를 높이는 컨센서스 도구를 사용할 수 있는 패키지가 많기 때문에 사용할 수 있습니다. 또한 대표 결과 섹션에서 여러 유효성 검사 도구와 워크플로의 모든 단계에서 정확하고 부정확한 결과를 식별하고 잠재적인 문제를 감지하는 방법 및 이를 해결하는 방법에 대해 자세히 설명했습니다. 프로토콜을 따라 프로토콜이 제대로 실행중인지 아닌지 깨닫는 데 도움이 되는 몇 가지 검사점이 있습니다. 가장 관련성이 높은 것 중 일부는 피킹, 2D 분류, 초기 볼륨 추정 및 3D 정렬입니다. 입력을 확인하거나, 다른 방법으로 단계를 반복하거나, 컨센서스를 사용하면 사용자가 문제가 나타날 때 솔루션을 찾는 데 사용할 수 있는 옵션입니다. 
Cryo-EM 필드의 패키지 통합에 대한 이전의 접근 방식과 관련하여 Appion31 은 다른 소프트웨어 패키지를 실제 통합할 수 있는 유일한 방법이다. 그러나, Appion은 단단히 레기논32, 전자 현미경에서 이미지의 자동화 된 수집을위한 시스템과 연결되어 있습니다. Scipion의 주요 차이점은 데이터 모델과 스토리지가 덜 결합된다는 것입니다. 이러한 방식으로 Scipion에서 새 프로토콜을 만들려면 파이썬 스크립트만 개발해야 합니다. 그러나 Appion에서 개발자는 스크립트를 작성하고 기본 데이터베이스를 변경해야 합니다. 요약하자면, Scipion은 유지 보수 및 확장성을 단순화하기 위해 개발되었습니다.
우리는이 원고에 Plasmodium falciparum 80S 리보솜의 실제 사례 데이터 세트를 사용하여 Cryo-EM 처리를위한 완전한 워크 플로우를 제시했습니다 (EMPIAR 항목 : 10028, EMDB 항목 : 2660). 여기서 다루어지고 논의된 단계는 영화 정렬, CTF 추정, 입자 따기, 2D 분류, 초기 지도 추정, 3D 분류, 3D 정제, 평가 및 사후 처리로 요약할 수 있습니다. 다른 패키지가 사용되었으며 이러한 여러 단계에서 합의 도구가 적용되었습니다. 최종 3D 재구성 볼륨은 3Å의 해상도를 달성했으며, 처리 후 부피에서 일부 보조 구조는 알파 헬릭과 같이 구별될 수 있으며, 이는 원자가 공간에서 배열되는 방식을 설명하는 데 도움이 됩니다.
이 원고에 제시된 워크플로우는 Scipion을 사용하여 다양한 Cryo-EM 패키지를 간단하고 통합적인 방식으로 결합하여 처리를 단순화하고 동시에 보다 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있는 방법을 보여줍니다.
미래에새로운 방법과 패키지의 개발은 성장을 계속하고 쉽게 그들 모두를 통합하는 Scipion 같은 소프트웨어는 연구원에 대한 더 중요 할 것이다. 합의 접근법은 다른 기초가 있는 많은 방법이 제공될 때, Cryo-EM의 재건 과정에 관련된 모든 매개 변수에 대한 보다 정확한 추정을 얻는 데 도움이 될 때 더욱 관련성이 높을 것입니다. 추적 및 재현성은 연구 프로세스의 핵심이며 완전한 워크플로우 실행을 위한 공통프레임워크를 가지고 있기 때문에 Scipion을 통해 쉽게 달성할 수 있습니다.

극저온 전자 현미경 검사법(cryo-EM)에서, 유리화 된 냉동 수화 표본의 단일 입자 분석 (SPA)은 분자 상호 작용및 생물학적 앙상블의 기능을 이해할 수 있기 때문에 생물학적 거대 분자에 대한 이미징의 가장 널리 사용되고 성공적인 변형 중 하나입니다1. 이것은 "해상도 혁명"2 를 초래하고 거의 원자 해상도를 가진 생물학 3D 구조물의 성공적인 결정을 허용한 이 화상 진찰 기술의 최근 어드밴스 덕분에 입니다. 현재 SPA 극저온EM에서 달성한 가장 높은 해상도는 아포페리틴3 (EMDB 입력: 11668)의 경우 1.15Å였습니다. 이러한 기술적 진보는 샘플 제제4, 이미지 수집5 및 이미지 처리 방법의 개선을 포함한다6. 이 문서는 이 마지막 점에 중점을 두습니다. 
간단히, 영상 처리 방법의 목표는 현미경의 이미징 과정을 반전시키고 연구 하에 생물학적 표본의 3D 구조를 복구하기 위해 모든 획득 파라미터를 식별하는 것이다. 이들 파라미터는 카메라의 게인, 빔 유도 운동, 현미경의 수차(주로 디포커스), 각 입자의 3D 각도 방향 및 번역, 및 형태 적 변화를 갖는 시편이 있는 경우 의 형성 상태입니다. 그러나, 파라미터의 수는 매우 높고 극저온-EM은 방사선 손상을 피하기 위해 저용량 이미지를 사용하여 획득된 이미지의 신호 대 잡음 비율(SNR)을 현저히 감소시킨다. 따라서 문제를 명백히 해결할 수 없으며 계산할 모든 매개 변수는 추정일 수 있습니다. 이미지 처리 워크플로우를 따라 올바른 매개 변수를 식별하고 나머지 매개 변수를 제거하여 고해상도 3D 재구성을 마지막으로 얻어야 합니다.
현미경에 의해 생성된 데이터는 프레임으로 수집됩니다. 단순화, 프레임은 전자 계수 검출기를 사용할 때마다 이미지의 특정 위치(픽셀)에 도착한 전자의 수를 포함합니다. 특정 시야에서 여러 프레임이 수집되고 이를 영화라고 합니다. 낮은 전자 용량은 샘플을 파괴 할 수있는 방사선 손상을 방지하기 위해 사용되기 때문에, SNR은 매우 낮으며 동일한 영화에 대응하는 프레임은 샘플에 대한 구조적 정보를 밝히는 이미지를 얻기 위해 평균될 필요가있다. 그러나, 단순한 평균뿐만 아니라, 시료는 보상이 필요한 빔 유도 운동으로 인해 이미징 시간 동안 교대 및 기타 종류의 움직임을 겪을 수 있다. 시프트 보정 및 평균 프레임은 현미경 그래프에서 발생합니다.
일단 현미경이 얻어지면, 우리는 주파수의 함수로 현미경의 대조에 있는 변경을 나타내는 대조 전송 기능 (CTF)에게 불린 그들 각각에 대한 현미경에 의해 소개된 수차를 추정할 필요가 있습니다. 그런 다음 파티클을 선택하고 추출할 수 있으며, 이는 입자 따기라고 합니다. 모든 입자는 연구 중인 표본의 복사본을 하나만 포함하는 작은 이미지여야 합니다. 입자 따기 알고리즘의 세 제품군이 있습니다: 1) 입자의 모양의 일부 기본 매개 변수를 사용하여 전체 현미경 사진 세트(예: 파티클 크기), 2) 파티클이 사용자 또는 미리 학습된 집합에서 어떻게 보이는지 배우는 것, 그리고 3) 이미지 템플릿을 사용하는 알고리즘이 있습니다. 각 패밀리에는 나중에 표시되는 속성이 다릅니다.
마이크로그래프에서 발견되는 추출된 입자 세트는 2D 분류 공정에 사용되며, 1) 순수한 노이즈 이미지, 겹치는 입자 또는 기타 아티팩트를 포함하는 하위 집합을 폐기하여 입자 세트를 청소하고, 2) 각 클래스를 나타내는 평균 입자는 3D 초기 부피를 계산하기 위해 초기 정보로 사용될 수 있다. 
3D 초기 볼륨 계산은 다음 중요한 단계입니다. 3D 구조를 획득하는 문제는 다차원 솔루션 환경에서 최적화 문제로 볼 수 있으며, 여기서 글로벌 최소값은 원래 구조를 나타내는 최고의 3D 볼륨이지만, 최적이 아닌 솔루션을 나타내는 여러 로컬 미니마를 찾을 수 있으며, 갇히기 매우 쉬운 곳. 초기 볼륨은 검색 프로세스의 시작점을 나타내므로 초기 볼륨 추정이 좋지 않으므로 전역 최소값을 찾을 수 없습니다. 초기 부피에서 3D 분류 단계는 다른 형성 상태를 발견하고 입자 세트를 다시 청소하는 데 도움이 됩니다. 목표는 입자의 구조적으로 균일한 인구를 얻는 것입니다. 그 후, 3D 정제 단계는 가능한 최고의 3D 볼륨을 얻기 위해 모든 입자에 대한 각 및 번역 매개 변수를 정제담당합니다. 
마지막으로, 마지막 단계에서, 얻은 3D 재건은 선명하고 연마될 수 있다. 선명하게 하는 공정은 재구성된 부피의 높은 주파수를 증폭시키는 과정이며, 연마는 입자 수준에서 CTF 또는 빔 유도 이동 보정으로서 일부 파라미터를 더욱 정제하는 단계이다. 또한 일부 유효성 검사 프로시저는 워크플로가 끝날 때 달성된 해상도를 더 잘 이해하는 데 사용될 수 있습니다. 
이러한 모든 단계 후, 추적 및 도킹 프로세스7 은 원자 모델을 구축하거나 기존 모델을 피팅하여 얻어진 3D 재건에 생물학적 의미를 부여하는 데 도움이 될 것입니다. 고해상도가 달성되면 이러한 프로세스는 생물학적 구조의 위치를 알려줍니다.
Scipion8을 사용하면 가장 관련성이 뛰어난 이미지 프로세싱 패키지를 통합방식으로 결합한 전체 워크플로우를 만들 수 있습니다. Xmipp9, Relion10, CryoSPARC11, Eman12, Spider13, Cryolo14, Ctffind15, CCP416, Phenix17 및 더 많은 패키지가 시피온에 포함될 수 있습니다. 또한 통합, 상호 운용성, 추적성 및 재현성을 이점하는 데 필요한 모든 도구를 통합하여 전체 이미지 처리 워크플로우8을 완전히 추적합니다8.
Scipion이 사용할 수 있는 가장 강력한 도구 중 하나는 컨센서스로, 이는 보다 정확한 출력을 생성하기 위해 다른 방법으로 전달되는 정보의 조합을 만드는 처리의 한 단계에서 여러 가지 방법과 비교하여 얻은 결과를 비교하는 것을 의미합니다. 이렇게 하면 성능을 향상시키고 예상 매개 변수에서 달성된 품질을 개선하는 데 도움이 될 수 있습니다. 컨센서스 메서드를 사용하지 않고도 더 간단한 워크플로를 빌드할 수 있습니다. 그러나 이 도구의 힘을 보았습니다22,25 이 원고에 제시된 워크플로우는 여러 단계에서 사용할 것입니다.
이전 단락에 요약된 모든 단계는 다음 섹션에서 자세히 설명하고 Scipion을 사용하여 전체 워크플로에서 결합됩니다. 또한, 생성된 출력에서 더 높은 합의를 달성하기 위해 컨센서스 도구를 사용하는 방식이 표시됩니다. 이를 위해 플라스모듐 팔시파룸 80S 리보솜의 예제 데이터 집합이 선택되었습니다(EMPIAR 항목: 10028, EMDB 항목: 2660). 데이터 세트는 FEI FALCON II 카메라로 FEI POLARA 300에서 촬영한 1.34Å 크기의 16프레임 크기 4096x4096 픽셀의 600개 영화에 의해 형성되며 EMDB에서 보고된 해상도는 3.2Å18 입니다.

<table><tbody><tr><td>이 기사에는 자료가 사용되지 않았습니다</td><td>-</td><td>--</td><td></td></tr></tbody></table>

scipion을 가진 극저온 em 및 단일 입자 분석

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

극저온 전자 현미경 검사는 거의 원자 분해능에서 거대 분자의 구조적 정보를 밝히기 위한 생물학적 연구에서 가장 중요한 도구 중 하나가 되었습니다. 단일 입자 분석에서, 유리화 된 샘플은 전자 빔에 의해 심화되고 현미경 기둥의 끝에 검출기는 그 샘플의 영화를 생성한다. 이 영화에는 임의 방향으로 동일한 파티클의 수천 개의 이미지가 포함되어 있습니다. 데이터는 최종 3D 재구성 볼륨을 얻기 위해 여러 단계로 이미지 처리 워크플로우를 거쳐야 합니다. 이미지 처리 워크플로우의 목표는 연구 중인 시편을 재구성할 수 있는 획득 매개 변수를 식별하는 것입니다. Scipion은 통합 프레임워크에서 여러 이미지 처리 패키지를 사용하여 이 워크플로우를 만드는 모든 도구를 제공하여 결과의 추적성을 제공합니다. 이 문서에서Scipion의 전체 이미지 처리 워크플로우가 실제 테스트 사례에서 나오는 데이터와 함께 제시되고 논의되어 현미경에서 얻은 영화에서 고해상도 최종 3D 재구성으로 이동하는 데 필요한 모든 세부 정보를 제공합니다. 또한, 결합 방법을 허용하는 합의 도구를 사용하고 워크플로의 모든 단계에서 결과를 확인하여 얻은 결과의 정확성을 향상시키는 힘에 대해 논의합니다.

극저온 전자 현미경 검사법의 단일 입자 분석은 고해상도에서 생물학적 앙상블의 구조를 결정하는 데 사용되는 주요 기술 중 하나입니다. Scipion은 현미경에 의해 획득된 정보를 처리하고 생물학적 표본의 3D 재구성을 달성하기 위해 전체 파이프라인을 만드는 도구를 제공합니다.

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

Scipion은 생물학적 시편의 고해상도 재구성을 달성하기 위해 cryo-EM에서 단일 입자 분석을 위한 통합 방식으로 전체 처리 워크플로우를 생성하는 도구를 제공합니다. 이 프레임워크를 사용하면 상호 운용성, 추적성, 재현성 및 보다 정확한 출력을 생성하기 위해 서로 다른 방법으로 전달되는 정보의 조합을 선호하는 여러 이미지 처리 패키지를 사용하여 처리 워크플로우를 만들 수 있습니다. Scipion은 새로운 방법과 패키지를 포함하여 끊임없이 성장하고 있습니다.또한 극저온 전자 단층 촬영 및 원자 모델링으로 확장되어 이러한 데이터를 처리하는 워크플로우를 만들 수 있습니다. Scipion에서 프로젝트를 만들려면 프로젝트 만들기를 클릭하여 프로젝트를 만듭니다. 현미경 동영상을 가져오려면 가져오기 영화를 선택합니다.새 창이 나타납니다. 이 창에서, 데이터에 대한 경로를 입력하고 현미경 전압을 300 킬로볼트로 설정하고, 구형 수차는 2밀리미터로, 진폭 대비는 0.1, 배율50, 000으로, 샘플링 속도 모드에서 이미지까지, 픽셀 크기는 1.34 angstroms로 설정합니다. 모든 매개 변수가 설정된 경우 실행을 클릭합니다.메서드가 완료되면 요약 탭을 열어 결과 분석을 클릭합니다. 메서드에서 생성된 출력 목록과 함께 새 창이 나타납니다. 영화 정렬을 위한 광학 유동 방법을 실행하려면 xmipp3 광학 정렬 방법을 열고 가져온 영화를 입력 영화로 선택하고 프레임범위를 2에서 13사이로 정렬하도록 설정합니다.추가 매개 변수에서 이전 영화 정렬을 SUM 프레임 옵션으로 설정하여 기본 값으로 설정된 다른 모든 옵션을 그대로 두고 프로그램을 실행합니다. 결과를 분석하여 얻은 현미경 그래프와 예상 교대의 궤적을 확인합니다. 모든 현미경촬영에 대해, 카르테시안및 극성 좌표 모두에서 영화를 정렬하기 위해 얻은 전력 스펙트럼 밀도, 궤적, 및 얻어진 현미경의 파일 이름을 확인할 수 있다.표본의 입자가 영화의 단일 프레임에 비해 현미경 그래프에서 훨씬 더 많이 표시됩니다. 파티클 따기의 경우 xmipp3 수동 피킹 방법을 열고 이전에 얻은 현미경 그래프를 입력 현미경으로 선택합니다. 실행을 클릭합니다.새 대화형 창이 나타납니다. 이 창에서는 픽셀 크기를 150으로 변경합니다. 선택한 현미경이 더 큰 창에 나타납니다.한 영역 내에서 표시되는 모든 파티클을 선택합니다. 모든 파티클을 수동으로 선택한 경우 학습 활성화를 클릭하여 학습을 시작합니다. 현미경 그래프의 나머지 영역은 자동으로 선택됩니다.선택한 파티클을 확인합니다. 추가 파티클을 포함하려면 관심 있는 파티클을 클릭합니다. 잘못된 파티클을 제거하려면 시프트를 길게 유지하고 필요에 따라 파티클을 클릭합니다.모든 파티클을 자동으로 선택하면 다음 네 개의 현미경 그래프를 한 번에 하나씩 선택하여 대표 교육 세트를 만듭니다. 선택한 각 현미경 그래프의 파티클은 자동으로 선택되어 각 현미경 그래프를 확인하여 필요에 따라 입자를 포함하거나 제거합니다. 학습 집합을 획득하면 좌표를 클릭하여 선택한 모든 파티클의 좌표를 저장합니다.교육 세트를 획득한 후 xmipp3 자동 피킹을 열어 Xmipp 입자 따기 실행에서 이전 수동 피킹을 나타내고 마이크로그래프를 감독과 동일하게 선택하도록 설정합니다. 실행을 클릭하여 약 100, 000 좌표 세트를 생성합니다. 합의 접근법을 적용하려면 스포리 크라이올로 따기를 열고 미리 처리된 현미경 그래프를 선택 모델의 입력 현미경으로 기본값으로 설정합니다.신뢰도 임계값을 0.3로 설정하고 상자 크기를 150으로 설정한 다음 실행을 클릭합니다. 이 메서드는 또한 약 100, 000 좌표를 생성해야 합니다. 다음으로, xmipp3 딥 컨센서스 피킹을 열고 입력 좌표를 설정하여 스파이어 크라이올로 및 xmipp3 자동 피킹, 미리 학습된 선택 모델 유형, 미리 학습된 모델과 함께 직접 건너뛰기 훈련 및 점수를 예로 클릭한 다음 실행을 클릭합니다.실행이 끝나면 결과 분석분석을 클릭합니다. 새 창에서 눈 아이콘을 클릭합니다. 두 번째 새 창은 모든 파티클 목록과 함께 열립니다.열의 Z 점수 값은 낮은 값이 품질이 좋지 함을 나타내기 때문에 각 파티클의 품질에 대한 통찰력을 제공합니다. 가장 높은 Z 점수에서 가장 낮은 Z 점수까지 의 입자를 주문하려면 Xmipp Z 점수 딥 러닝을 클릭하고 0.75보다 높은 Z 점수로 입자를 선택합니다. 그런 다음 좌표를 클릭하여 약 50, 000 좌표로 새 하위 집합을 만듭니다.로컬에서 해상도를 계산하려면 xmipp3 로컬 MonoRe를 열고 입력 볼륨을 마지막 구체화 단계의 출력으로 설정하려면 절반 볼륨을 예로 사용하고 해상도 범위를 1에서 10 angstroms로 설정합니다. 매개 변수가 설정된 경우 실행 실행을 클릭합니다. 해상도가 계산되면 결과 분석을 클릭하고 해상도 표시 히스토그램을 선택하고 컬러 슬라이스 표시를 선택합니다.볼륨의 다른 부분의 해상도가 표시됩니다. 구조물의 중앙 부분의 복셀 대부분은 세 개의 협전성 주위에 해상도를 나타내야 하며, 최악의 해상도는 구조물의 외부 영역에서 관찰될 것이다. 3개의 협질의 주위에 또는 아래 피크와 복셀 당 해상도의 히스토그램도 표시됩니다.선명하게 하는 xmipp3 로컬데블러를 열고 마지막 구체화 단계의 출력을 입력 맵으로 선택하고 해상도 맵을 획득 모노리스 맵으로 설정합니다. 명령이 실행된 후 요약 탭에서 출력으로 생성된 볼륨 집합을 두 번 클릭합니다. 각 반복에서 생성된 볼륨을 확인할 수 있습니다.또한 UCSF Chimera와 같은 다른 도구로 볼륨을 열어 볼륨의 기능을 3D로 더 잘 관찰하는 것이 좋습니다. 이 그림에서는 나이퀴스트 한계에 매우 가까운 세 개의 협스트롬의 포리에 쉘 상관 관계를 관찰할 수 있습니다. 그림과 같이, 재구성된 3D 볼륨 슬라이스는 높은 수준의 디테일과 잘 정의된 구조를 나타낸다.로컬 분석 후 대부분의 중앙 복셀은 세 개의 협질 아래 해상도를 달성합니다. 그러나 로컬 해상도 슬라이스의 외부 영역은 낮은 해상도를 보여 주며, 이는 해당 영역 내에서 관찰된 흐림과 일치합니다. 후처리 후 3D 맵 볼륨의 주파수가 높을수록 더 자세한 내용을 공개하고 표현을 개선할 수 있습니다.달성된 분해능이 충분히 높을 때, 구조의 일부 생화학적 부분도 관찰할 수 있다. 얻어진 구조가 낮은 해상도를 가지며, 더 나은 것으로 진화할 수 없는 경우, 푸리에 쉘 상관관계, 해상도 곡선 및 국소 추정의 히스토그램이 낮은 흐린 부피를 관찰할 수 있다. 따기 후, 2D 분류를 검사하여 입자 품질을 평가할 수 있습니다.예를 들어 이 분류에서 파티클은 시들하거나 중심이 없거나 결합되어 따기가 잘못되었음을 나타냅니다. 초기 볼륨 추정 중에 다른 검사점이 수행될 수 있습니다. 이 예제에서는 메서드에 대한 잘못된 설정을 사용하여 잘못된 추정이 만들어졌습니다.충분한 해상도가 있는 3D 맵이 생성되면 다음 단계는 맵에 대한 원자 모델을 제안하는 것입니다. 모델링 플러그인을 사용하여 Scipion 내에서 수행할 수 있습니다. 이 기술은 성공적으로 약물 설계를위한 기초로 자신의 분자 상호 작용 및 생물학적 앙상블 기능의 평가를 위한 생물학적 거대 분자를 재구성하는 데 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 논문은 소프트웨어 스위트 인 SPHIRE를 사용하여 저온 EM 이미지를 처리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 현재의 프로토콜은 원 자면 해상도를 목표로하는 거의 모든 단일 파티클 EM 프로젝트에 적용될 수 있습니다.

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

여기에 제시된 프로토콜은 새로운 로봇 시스템인 Spotiton의 사용을 설명하며, 액체 저온기에서 진동하기 전에 최소 90ms를 혼합하는 나노 와이어 그리드에 관심 있는 두 샘플을 전달합니다.

새로운 로봇 시스템, 스포티폰을 사용하여 시간 해결 연구를 위한 극저온 전자 현미경 그리드 준비

이 프로토콜은 극저온 구조조명 현미경을 사용하여 생물학적 냉동 보존 샘플을 이미지화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 U2OS 세포의 세포 골격을 화상 진찰하여 방법론을 보여줍니다.

극저온 보존 된 세포에서 극저온 구조 조명 현미경 데이터 수집

극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

이 원고는 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위해 생물학적 표본을 수동으로 동결하는 블롯 앤 플런지 방법을 설명합니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

단일 입자 냉동 전자 현미경 검사법은 고처리량 자동 데이터 수집을 위한 적합한 소프트웨어 패키지 및 사용자 친화적인 파이프라인을 요구합니다. 여기서는 완전 자동화된 이미지 수집 소프트웨어 패키지인 Latitude-S의 적용과 저용량 조건에서 유리화된 생체 분자의 데이터 수집을 위한 실용적인 파이프라인을 소개합니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 사용자 친화적이고 높은 처리량 및 완전 자동화된 데이터 수집 소프트웨어

이 문서에서는 3개의 cryo-EM 처리 플랫폼(예: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3)을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위한 다양한 단일 입자 데이터 세트에 적용할 수 있는 단일하고 강력한 워크플로우를 만드는 방법을 설명합니다.

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

본 프로토콜은 Cryo-EM 실험에서 기울어진 단일 입자 데이터 수집을 위한 일반화되고 구현하기 쉬운 체계를 설명합니다. 이러한 절차는 공기-물 계면의 부착으로 인해 우선적인 방향 편향을 겪는 샘플에 대한 고품질 EM 맵을 얻는 데 특히 유용합니다.

Leginon을 사용한 스테이지 틸트를 이용한 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집

초저온 전자 현미경(CryoEM) 다중 그리드 스크리닝은 종종 몇 시간의 주의가 필요한 지루한 프로세스입니다. 이 프로토콜은 이 프로세스를 자동화하기 위해 표준 Leginon 컬렉션 및 Smart Leginon Autoscreen을 설정하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜은 대부분의 CryoEM 홀리 포일 그리드에 적용할 수 있습니다.

Smart Leginon을 사용한 여러 그리드에서 극저온 전자 현미경 스크리닝 자동화

Cryo-EM을 위한 고급 입자 선택 방법인 CryoSieve는 실제 데이터 세트에 적용하여 입증된 바와 같이 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거하여 밀도 맵 해상도를 향상시킵니다.

Enhancing Density Maps by removing the majority of particles in single particle cryyogenic electron microscopy final stacks(단일 입자 극저온 전자 현미경 최종 스택에서 대부분의 입자를 제거하여 밀도 맵 향상)

배우세요 Scipion을 활용한 극저온 전자현미경 단일 입자 분석 방법을 통해 고해상도 3D 구조 재구성을 수행하는 기술입니다. 다양한 이미지 처리 패키지 통합으로 생물학적 구조 연구의 정확성과 재현성을 높입니다.

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

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