Name: 최소 샘플이지만 최대 자동화 모드에서 NMR 기반 단편 스크리닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: 배우세요 고분자 표적에 대한 NMR 기반 단편 스크리닝 방법을 통해 신약 후보 물질을 효율적으로 식별하는 기술을 익히세요. 자동화된 워크플로우가 데이터 품질과 재현성을 향상시킵니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작업은 유럽연합 집행위원회(European Commission)의 Horizon 2020 프로그램에서 자금을 지원하는 프로젝트 번호 871037인 iNEXT-Discovery의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Yanamala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR-Based+Screening+of+Membrane+Protein+Ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Biology+%26+Drug+Design%22%5BJournal%5D)">NMR-Based Screening of Membrane Protein Ligands.</a> Chemical Biology & Drug Design. 75, 237-256 (2010).</li>
<li>Souers, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABT-199%2C+a+potent+and+selective+BCL-2+inhibitor%2C+achieves+antitumor+activity+while+sparing+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets.</a> Nature Medicine. 19, 202-208 (2013).</li>
<li>Su, M. C., Te Chang, C., Chu, C. H., Tsai, C. H., Chang, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atypical+RNA+pseudoknot+stimulator+and+an+upstream+attenuation+signal+for+-1+ribosomal+frameshifting+of+SARS+coronavirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">An atypical RNA pseudoknot stimulator and an upstream attenuation signal for -1 ribosomal frameshifting of SARS coronavirus.</a> Nucleic Acids Research. 33, 4265-4275 (2005).</li>
<li>Perera, T. P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+%26+pharmacological+characterization+of+JNJ-42756493+%28Erdafitinib%29%2C+a+functionally+selective+small-molecule+FGFR+family+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Discovery & pharmacological characterization of JNJ-42756493 (Erdafitinib), a functionally selective small-molecule FGFR family inhibitor.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 16, 1010-1020 (2017).</li>
<li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+pharmacology+of+a+highly+specific+dual+FMS+and+KIT+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Design and pharmacology of a highly specific dual FMS and KIT kinase inhibitor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 5689-5694 (2013).</li>
<li>Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., Feeney, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+and+computational+approaches+to+estimate+solubility+and+permeability+in+drug+discovery+and+development+settings%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 23, 3-25 (1997).</li>
<li>Congreve, M., Carr, R., Murray, C., Jhoti, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%27Rule+of+Three%27+for+fragment-based+lead+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discovery+Today%22%5BJournal%5D)">A 'Rule of Three' for fragment-based lead discovery.</a> Drug Discovery Today. 8, 876-877 (2003).</li>
<li>Chávez-Hernández, A. L., Sánchez-Cruz, N., Medina-Franco, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fragment+Library+of+Natural+Products+and+its+Comparative+Chemoinformatic+Characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Informatics%22%5BJournal%5D)">A Fragment Library of Natural Products and its Comparative Chemoinformatic Characterization.</a> Molecular Informatics. 39, 2000050(2020).</li>
<li>Sreeramulu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+quality+control+of+fragment+libraries+for+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomolecular+NMR%22%5BJournal%5D)">NMR quality control of fragment libraries for screening.</a> Journal of Biomolecular NMR. , 00327-00329 (2020).</li>
<li>Gao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+NMR+Fragment+Based+Screening+Identified+a+Novel+Interface+Blocker+to+the+LARG%2FRhoA+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated NMR Fragment Based Screening Identified a Novel Interface Blocker to the LARG/RhoA Complex.</a> PLoS One. 9, 88098(2014).</li>
<li>Peng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+Efficient+Fragment-Based+Lead+Generation+by+Fully+Automated+Processing+and+Analysis+of+Ligand-Observed+NMR+Binding+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Fast and Efficient Fragment-Based Lead Generation by Fully Automated Processing and Analysis of Ligand-Observed NMR Binding Data.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 59, 3303-3310 (2016).</li>
<li>Cox, O. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+poised+fragment+library+enables+rapid+synthetic+expansion+yielding+the+first+reported+inhibitors+of+PHIP%282%29%2C+an+atypical+bromodomain%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain.</a> Chemical Science. 7, 2322-2330 (2016).</li>
<li>Hwang, T. L., Shaka, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Water+Suppression+That+Works.+Excitation+Sculpting+Using+Arbitrary+Wave-Forms+and+Pulsed-Field+Gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%2C+Series+A%22%5BJournal%5D)">Water Suppression That Works. Excitation Sculpting Using Arbitrary Wave-Forms and Pulsed-Field Gradients.</a> Journal of Magnetic Resonance, Series A. 112, 275-279 (1995).</li>
<li>Gossert, A. D., Jahnke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+in+drug+discovery%3A+A+practical+guide+to+identification+and+validation+of+ligands+interacting+with+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Nuclear+Magnetic+Resonance+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">NMR in drug discovery: A practical guide to identification and validation of ligands interacting with biological macromolecules.</a> Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 97, 82-125 (2016).</li>
<li>Sklenar, V., Bax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+water+suppression+technique+for+generating+pure-phase+spectra+with+equal+excitation+over+a+wide+bandwidth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Magnetic+Resonance%22%5BJournal%5D)">A new water suppression technique for generating pure-phase spectra with equal excitation over a wide bandwidth.</a> Journal of Magnetic Resonance. 75, 378-383 (1987).</li>
<li>Binas, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((19F+NMR-Based+Fragment+Screening+for+14+Different+Biologically+Active+RNAs+and+10+DNA+and+Protein+Counter-Screens%5BTitle%5D)+AND+%22ChemBioChem%22%5BJournal%5D)">19F NMR-Based Fragment Screening for 14 Different Biologically Active RNAs and 10 DNA and Protein Counter-Screens.</a> ChemBioChem. , (2020).</li>
</ol>

NMR 기반 단편/약물 스크리닝의 다양성. BMRZ는 약물 발견을 위한 광범위한 친화성 영역 내에서 단편을 식별하기 위해 STD-NMR, waterLOGSY 및 이완 실험뿐만 아니라 최첨단 자동 NMR 기기를 성공적으로 구현했습니다. 설치된 하드웨어에는 고처리량 시료 전처리 로봇과 600MHz 분광계와 관련된 고처리량 시료 저장, 교환기 및 데이터 수집 장치가 포함됩니다. 최근에 구입한 1H, 19F, 13C및 15N용 극저온 프로브는 제안된 측정에 필요한 감도를 보장하고 19F검출 중에 1H(1)디커플링을 허용합니다. 이 프로브는 CMC-q, CMC-assist, CMC-se 및 FBS(TopSpin에 포함됨)를 포함한 Bruker의 고급 소프트웨어 도구를 사용할 수 있는 최신 세대의 NMR 콘솔에 연결됩니다. 절편 기반 스크리닝(FBS) 도구는 최신 버전의 TopSpin에 포함되어 있으며 STD, waterLOGSY,T2/T1r-relaxation 실험으로 구성된 고처리량 데이터를 분석하는 데 도움이 됩니다. 액체 1D 1H 샘플 수집은 샘플 충전 로봇을 사용하여 자동화된 방식으로 NMR 튜브에 충전할 수 있습니다. 일반적으로 96개의 튜브(3mm) 블록이 약 2시간 내에 채워집니다. 96웰 플레이트 랙은 HT 샘플 체인저에 직접 배치되어 블록의 바코드를 판독하고 자동화 소프트웨어(IconNMR)에 의해 제어되는 실험에 NMR 튜브를 할당합니다. 5개의 96웰 플레이트 랙을 HT 자동 시료 주입기에 동시에 보관하고 프로그래밍할 수 있습니다. 각 개별 랙의 온도는 개별적으로 제어하고 조절할 수 있습니다. 또한 각 개별 시료는 측정 전에 원하는 온도로 사전 컨디셔닝(응축 습도 제거를 위한 예열 및 튜브 건조)할 수 있습니다.
광범위한 응용 분야에 적합합니다. 이 자동화된 NMR 기반 스크리닝의 광범위한 응용 분야 중 하나는 생체고분자 표적(DNA/RNA/단백질)에 결합하는 새로운 리간드를 식별하고 개발하는 것입니다. 이들 리간드는 전형적으로 비공유적으로 결합하는 오르토스테릭 및 알로스테릭 억제제를 포함할 수 있다. 또한, NMR에 의한 FBDD는 전형적으로 유망한 화합물을 선택하기 위한 제1 단계로서 사용되며, 충족되어야 하는 요건은 충분한 양의 생체분자 표적의 가용성이다. 이 목표는 두 가지 주요 작업으로 나뉩니다.
첫 번째 과제는 다음과 같은 이유로 사내 단편 라이브러리를 개발하고 특성화하는 것입니다 : 1000 개 이상의 단편의 초기 및 주기적 품질 관리, 특성화 및 정량화; 각 표적, 특히 단백질 표적에 대해 최적화된 완충액에서 단편의 용해도 측정; 다양한 스캐폴드를 수용하고 다른 거대분자 부류로 확장하기 위해 여러 라이브러리를 설립합니다. 작업 2는 다음을 사용하여 NMR에 의한 단편 기반 약물 설계(FBDD)를 위한 워크플로우를 통합하는 것입니다: 자동화된 1D-리간드 관찰 스크리닝(1H 및 19F관찰); orthosteric 및 allosteric 결합을 구별하기 위한 자동 교체 분석((천연) 리간드를 사용한 경쟁 실험); 여러 단편을 사용한 자동화된 2차 스크리닝; 자동화된 2D-단백질 스크리닝 및 EU-OPENSCREEN 라이브러리 또는 기타 라이브러리를 사용하는 초기 히트 주변의 유도체 세트의 2차 스크리닝; 선택한 대상에 대한 FDA 라이브러리의 재프로파일링 스크리닝.
또한, 세포주기 조절과 대사를 연결하는 조절 메커니즘을 밝히기 위해 다양한 세포주(질병 관련)의 대사형 분석이 수행될 수 있습니다. 또한, 구축물/도메인 최적화(구조 조사(완충액, pH, 온도 및 염 스크리닝)를 위한 안정성 최적화)의 최적화를 위한 생체 내 및 시험관 내에서 RNA/DNA/단백질 조절 요소의 기능적 특성화와 일반적으로 다른 기술로는 접근할 수 없는 막 단백질 및 본질적으로 무질서한 단백질에 대한 NMR 기반 단편 스크리닝의 확장이 있습니다.
제한. 19F 및 1H 단편 라이브러리의 사용에는 장단점이 있으며, 그 중 일부는 다음에서 언급 할 것입니다. 19F대 1H측정의 가장 큰 이점은 혼합물에 거의 두 배의 단편이 포함되어 있고 더 적은 수의 실험을 수행해야 하기 때문에 실제 측정 시간과 후속 분석의 속도입니다. 또한 버퍼의 간섭이 없고 최적으로 설계된 단편 혼합물에 대해 신호 겹침이 거의 없는 더 넓은 화학적 이동 범위를 추가로 제공하기 때문에 19F스크리닝의 경우 후속 분석이 더 쉽습니다. 스펙트럼 자체는 크게 단순화되어 일반적으로 불소 원자의 수에 따라 단편당 하나 또는 두 개의 신호만 갖습니다. 따라서 이러한 스펙트럼의 분석을 자동화하여 시간을 단축할 수 있습니다. 이것은 적어도이 연구에 사용 된 도서관에 대한 화학적 다양성을 희생시켜줍니다. 라이브러리의 ~13%만이 19F를 포함하고 있지만 당연히 모두 1H 스크리닝에 사용할 수 있으므로 19F스크리닝 조각의 다양성은 더 낮아집니다. 이것은 더 많은 조각과 더 큰 화학적 다양성을 가진 특별히 설계된 19F라이브러리를 사용하여 우회할 수 있습니다. 19F스크리닝의 또 다른 단점은 단편당 신호 수가 적다는 것입니다. 단편은 일반적으로 하나 이상의 수소 원자로 구성된다. 따라서 1H관찰 스크리닝 실험은 결합을 검출하기 위해 동일한 단편에 대해 서로 다른 신호에 의존할 수 있습니다. 이는 1H 스크리닝에 대한 히트를 식별할 때 더 높은 신뢰도를 제공하는 반면, 19F스크리닝은 단편당 주어진 하나 또는 두 개의 신호에 의존해야 합니다.
현대의 자동화된 NMR 기반 단편 스크리닝 기기, 소프트웨어 및 분석 방법 및 프로토콜에 대한 자세한 설명이 제시되었습니다. 설치된 하드웨어에는 고처리량 시료 전처리 로봇과 600MHz 분광계와 관련된 고처리량 시료 저장, 교환기 및 데이터 수집 장치가 포함됩니다. 최근에 설치된 1 H, 19 F, 13 C 및 15N용 극저온 프로브 헤드는 제안된 측정에 필요한 감도를 보장하고 19F 검출 중에 1H 디커플링을 허용합니다. 또한 최신 세대의 NMR 콘솔은 획득 및 즉석 분석을 지원하기 위해 고급 분석 소프트웨어를 사용할 수 있는 가능성을 제공합니다. 위에서 논의한 기술, 워크플로 및 설명된 프로토콜은 NMR에 의해 FBS를 추구하는 사용자에게 놀라운 성공을 촉진할 것입니다.

단편 기반 스크리닝은 이제 단백질, DNA 및 RNA를 포함한 거대분자 표적에 약한 결합을 보이는 다소 간단하고 저분자량 분자(MW <250Da)를 식별하는 데 일반적으로 사용되는 방법입니다. 1차 스크린으로부터의 초기 히트는 상업적으로 이용가능한 히트의 더 큰 유사체의 2차 스크린을 수행한 다음 화학 기반 단편 성장 또는 연결 전략을 활용하기 위한 기초 역할을 합니다. 성공적인 단편 기반 약물 발견(FBDD) 플랫폼을 위해서는 일반적으로 약한 적중, 단편 라이브러리, 생체 분자 표적 및 후속 화학 전략을 검출하고 특성화하기 위한 강력한 생물물리학적 방법이 필요합니다. 약물 발견 캠페인에서 일반적으로 적용되는 네 가지 생물물리학적 방법은 열 이동 분석, 표면 플라즈몬 공명(SPR), 결정학 및 핵자기 공명 분광법(NMR)입니다.
NMR 분광법은 FBDD의 여러 단계에서 다양한 역할을 나타냈습니다. 최적화된 완충액 시스템에 용해된 단편 라이브러리에서 단편의 화학적 순도 및 용해도를 보장하는 것 외에도, 리간드 관찰 NMR 실험은 낮은 친화력으로 표적에 대한 단편 결합을 검출할 수 있고, 표적 관찰 NMR 실험은 단편의 결합 에피토프를 묘사할 수 있으므로 상세한 구조-활성 관계 연구가 가능합니다. 에피토프 매핑 내에서 NMR 기반 화학적 이동 변화는 오르토스테릭 결합 부위뿐만 아니라 생체 분자 표적의 소위 흥분된 형태 상태에서만 접근할 수 있고 비밀스러울 수 있는 알로스테릭 부위도 식별할 수 있습니다. 생체 분자 표적이 이미 내인성 리간드에 결합하는 경우, 확인된 단편 히트는 NMR 기반 경쟁 실험을 수행하여 알로스테릭 또는 오르토스테릭으로 쉽게 분류할 수 있습니다. 리간드-표적 상호작용의 해리 상수(KD)를 결정하는 것은 FBDD 공정에서 중요한 측면이다. NMR 기반 화학적 이동 적정은, 관찰된 리간드 또는 표적 중 어느 것이든, KD를 결정하기 위해 용이하게 수행될 수 있다. NMR의 주요 장점은 상호 작용 연구가 용액에서 생리적 조건에 가깝게 수행된다는 것입니다. 따라서 표적과의 리간드/단편 상호작용 분석을 위한 모든 구조적 상태를 조사할 수 있습니다. 또한, NMR 기반 접근법은 잘 접힌 가용성 단백질의 스크리닝으로 제한될 뿐만 아니라 DNA, RNA, 막 결합 및 본질적으로 무질서한 단백질을 포함한 더 큰 표적 공간을 수용하기 위해 적용되고 있습니다1.
프래그먼트 라이브러리는 FBDD 프로세스에서 없어서는 안될 부분입니다. 일반적으로, 단편은 초기 전구체로서 작용하며, 이는 결국 생물학적 표적을 위해 개발된 새로운 억제제의 일부(하부구조)가 된다. 여러 약물(베네토클락스2, 베무라페닙3, 에르다피티닙4, 펙시다르닙5)이 단편으로 시작하여 현재 클리닉에서 성공적으로 사용되는 것으로 보고되었습니다. 전형적으로, 단편은 높은 수성 용해도 및 안정성을 갖는 저분자량 (<250 Da) 유기 분자이다. 일반적으로 수백 개의 조각이 포함된 세심하게 제작된 조각 라이브러리는 이미 화학 공간의 효율적인 탐사를 약속할 수 있습니다. 단편 라이브러리의 일반적인 구성은 시간이 지남에 따라 발전해 왔으며 대부분 알려진 약물을 더 작은 조각으로 해부하거나 계산적으로 설계하여 파생되었습니다. 이러한 다양한 단편 라이브러리는 주로 편평한 방향족 또는 헤테로 원자를 포함하며 5 6의 리핀스키 규칙 또는 3 7의 현재 상업적 추세 규칙을 준수하지만 반응성 그룹은 피합니다. 일부 단편 라이브러리는 또한 고용해성 대사산물, 천연물 및/또는 이들의 유도체로 유도되거나 구성되었다8. 대부분의 단편 라이브러리가 제기하는 일반적인 과제는 다운스트림 화학의 용이성입니다.
프랑크푸르트 괴테대학교의 생체분자 자기공명 센터(BMRZ)는 생화학 및 생물의학 연구 분야의 모든 유럽 연구자들을 위한 구조 연구 인프라 컨소시엄인 iNEXT-Discovery(중개 연구-발견을 위한 NMR, EM 및 X-ray를 위한 인프라)의 파트너입니다. 2019년에 종료된 iNEXT의 이전 이니셔티브 내에서 768개의 조각으로 구성된 조각 라이브러리는 넓은 화학 공간을 포괄하는 "최소 조각과 최대 다양성"을 목표로 제작되었습니다. 또한, 다른 단편 라이브러리와 달리 iNEXT 단편 라이브러리는 복잡하고 친화성이 높은 리간드의 다운스트림 합성을 용이하게 하기 위해 "포이즈드 단편"이라는 개념을 기반으로 설계되었으며, 이후 사내 라이브러리(Diamond, Structural Genomic Consortium 및 iNEXT)로 알려져 있습니다.
NMR로 FBDD를 설정하려면 인력, 지식 및 계측이 필요합니다. BMRZ에서는 NMR에 의한 단편 스크리닝에 대한 기술 지원을 지원하기 위해 최적화된 워크플로우가 개발되었습니다. 여기에는 단편 라이브러리(9)의 품질 관리 및 용해도 평가, 선택된 표적에 대한 완충액 최적화, 1H 또는 19F-관찰된 1D-리간드 기반 스크리닝, 오르토스테릭 결합과 알로스테릭 결합을 구별하기 위한 경쟁 실험, 에피토프 맵핑을 위한 2D 기반 표적 관찰 NMR 실험 및 초기 단편 적중의 유도체의 2차 세트와의 상호작용을 특성화하기 위한 것이 포함된다. BMRZ는 이전에 문헌 10,11에서 논의된 바와 같이 소분자-단백질 상호작용의 분석을 위한 자동화된 루틴을 확립했으며 NMR 기반 단편 스크리닝에 필요한 모든 자동화된 인프라를 갖추고 있습니다. 포화 전달 차이 NMR(STD-NMR), 그래디언트 분광법(waterLOGSY)을 통해 관찰된 물-리간드, 광범위한 친화성 영역 내의 단편을 식별하기 위한 Carr-Purcell-Meiboom-Gill 기반(CPMG 기반) 이완 실험을 구현했을 뿐만 아니라 약물 발견을 위한 최첨단 자동 NMR 기기 및 소프트웨어. NMR 기반 단편 스크리닝은 단백질에 대해 잘 확립되어 있지만, 이 접근법은 RNA 및 DNA와 상호 작용하는 새로운 리간드를 찾는 데 덜 일반적으로 사용됩니다. BMRZ는 소분자-RNA/DNA 상호작용을 식별할 수 있는 새로운 프로토콜에 대한 개념 증명을 확립했습니다. 이 기여의 다음 섹션에서는 단백질 및 RNA 샘플에 대한 스크리닝 루틴의 적용이 생체 고분자 연구의 광범위한 사용자 기반에 대해 확립된 프로토콜을 인식하는 것으로 보고되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Bruker Avance III HD</td><td></td><td>Bruker</td><td>600MHz NMR 분광계</td></tr><tr><td>매트릭스 투명 폴리프로필렌 2D 바코드 개방형 저장 튜브</td><td>3731-11 0.75ML V-하단 튜브/래치 랙</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>바코드 튜브</td></tr><tr><td>매트릭스 SepraSeal und DuraSeal&</td><td>4463 캡 매트, SeptraSeal 10/CS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td></tr><tr><td>SampleJet</td><td></td><td>Bruker</td><td>HT 샘플 체인저</td></tr><tr><td>SamplePro 튜브</td><td></td><td>Bruker</td><td>피펫팅 로봇</td></tr></tbody></table>

최소 샘플이지만 최대 자동화 모드에서 nmr 기반 단편 스크리닝

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

단편 기반 스크리닝(FBS)은 학계와 산업계 모두에서 신약 개발 프로세스 내에서 잘 검증되고 인정되는 개념입니다. NMR 기반 단편 스크리닝의 가장 큰 장점은 7-8배 이상의 친화도 이상의 결합제를 검출할 수 있을 뿐만 아니라 단편의 순도와 화학적 품질을 모니터링하여 고품질 히트와 최소한의 위양성 또는 위음성을 생성할 수 있다는 것입니다. FBS의 전제 조건은 단편 라이브러리의 초기 및 주기적 품질 관리를 수행하고, 관련 완충액에서 단편의 용해도 및 화학적 무결성을 결정하고, 다양한 거대분자 표적 클래스(단백질/RNA/DNA)를 수용하기 위해 다양한 스캐폴드를 포괄하는 여러 라이브러리를 구축하는 것입니다. 또한, 생물학적 구성물/단편 공간, 조건-공간(완충액, 첨가제, 이온, pH 및 온도) 및 리간드-공간(리간드 유사체, 리간드 농도) 수준에서 샘플 양, 획득 및 분석 속도에 대한 광범위한 NMR 기반 스크리닝 프로토콜 최적화가 필요합니다. 적어도 학계에서는 이러한 스크리닝 노력이 지금까지 매우 제한된 방식으로 수동으로 수행되어 약물 개발 프로세스뿐만 아니라 화학 프로브 개발의 맥락에서도 스크리닝 인프라의 가용성이 제한되었습니다. 경제적으로 요구 사항을 충족하기 위해 고급 워크 플로우가 제공됩니다. 그들은 액체 샘플 수집을 온도 제어 방식으로 NMR-튜브에 자동화된 방식으로 채울 수 있는 최신 최첨단 고급 하드웨어를 활용합니다. 1이어서, H/19FNMR 리간드-기반 스펙트럼을 주어진 온도에서 수집한다. 고처리량 시료 주입기(HT 시료 주입기)는 온도 제어 블록에서 500개 이상의 시료를 처리할 수 있습니다. 이는 고급 소프트웨어 도구와 함께 데이터 수집 및 분석 속도를 높입니다. 또한, 단백질 및 RNA 샘플에 대한 스크리닝 루틴의 적용은 생체 고분자 연구에서 광범위한 사용자 기반을 위해 확립된 프로토콜을 인식하기 위해 설명됩니다.

조각 라이브러리의 품질 관리 사내 라이브러리로부터의 단편은 90% d6-DMSO 및 10% D2O 중 50 mM 원액으로서 전달되었다 (10%D2O는 반복적인 동결-해동 사이클로 인한 화합물 분해의 최소화를 보장한다14). 단일 화합물 샘플은 50 mM 포스페이트 완충제 (25 mM KPi pH 6.2 + 50 mM KCl + 5 mMMgCl2), 90% H2O/9% D2O/1% d6-DMSO 중 pH 6.0 중 1 mM 리간드로 구성되었다. 1iNEXT 라이브러리로부터의 단편의 H-NMR 실험은 500/600 MHz NMR 분광계에서 측정하였다. 이 데이터는 사용자가 자동화된 방식으로 스펙트럼을 완전히 획득할 수 있도록 하는 CMC-q 소프트웨어를 사용하여 1시간 스크리닝 캠페인에서 단일 화합물을 식별하는 데 추가로 사용되었으며 분석 애드온 CMC-a단편의 품질(용해도 및 무결성)을 평가했습니다. CMC-a의 자동 분석 결과는 그림 3에 표시된 것과 유사한 그래픽 출력으로 표시됩니다. 그래픽 출력은 96웰 플레이트의 표현을 보여줍니다. 빨간색 원은 이 조각이 구조나 농도에 불일치를 나타낸다는 것을 의미합니다. 녹색 우물은 조각이 일관성이 있음을 나타냅니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig03.jpg"> 그림 3: 조각 라이브러리의 품질 관리. CMC-a 기반 자동 출력의 개략도. 농도 및 구조적 무결성과 같은 단편 특성이 평가됩니다. 녹색은 일관성을 나타내고 주황색은 일관성이 없음을 나타냅니다. 일관되지 않은 조각은 표시된 워크플로우에 따라 수동으로 수정됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
대략적으로, 단편의 65% 및 35%는 DMSO 및 완충액 둘 다에서 각각 일관성 및 비일관성으로 분류되었다. 또한, 일관되지 않은 분류된 리간드의 30%는 스펙트럼9의 신중한 수동 검사 후에 일관되게 변했습니다.
19F혼합물 디자인 사내 라이브러리에서 하나 또는 여러 개의 불소기를 포함하는 103개의 단편을 5개의 혼합물(A, B, C, D, E)로 분할했습니다. 각 믹스에는 20-21 개의 단편이 있습니다. 이 경우 혼합물은 신호 겹침을 피하기 위해 신중하게 설계되어야 했습니다. 19F 횡방향 이완 실험은 CPMG 펄스 트레인을 적용하는 각 혼합물에 대해 측정되었다. 이러한 실험은 완화 지연을 변화시킴으로써 수정될 수 있다. 혼합물 AE의 19F화학적 이동은 그림 4에서 볼 수 있습니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig04.jpg"> 그림 4 : 사내 라이브러리의 혼합물 샘플의 19F 1D-NMR 스펙트럼. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> 
시료 전처리 19F스크리닝 절차의 샘플 준비는 수동으로 수행되거나 피펫팅 로봇을 사용한 자동 피펫팅으로 수행되었습니다. 각각의 혼합물 중의 단편은 90% d6-DMSO 및 10%D2O중 2.5 mM의 농도를 가졌다. 스크리닝 샘플의 최종 부피는 170 μL였으며 5%D2O를 잠금제로서 사용하였다. 각 혼합물을 두 번 피펫팅했는데, 하나는 완충액 함유 용액(표적 없음)에, 다른 하나는 완충액 함유 표적에 넣었다. 표적과 절편의 비율을 1:1로 설정하여 최종 표적/리간드 농도가 50μM이 되었습니다. 또한 대조군 시료는 표적 무결성을 보장하기 위해 혼합물 없이 선별 완충액에서 표적 생체분자를 스크리닝하고, 완충액 품질을 보장하기 위해 완충액과D2O만 있는 대조군 시료입니다.
19F-1D및 19F-CPMG-T2의 NMR 스크리닝 데이터는 섹션 3.1에 기재된 바와 같이 측정하였다. 예를 들어, RNA의 경우 완충액의 단일 표적 샘플에 대해 점프-리턴 에코 서열(pp = zggpjrse,15)을 획득했습니다.
데이터 분석 19F스크리닝 절차는 몇몇 다른 표적 중에서 대장균의 TPP 리보스위치 thiM 및 M. tuberculosis의 단백질 티로신 키나아제(PtkA)에 적용되었습니다(16). 19F 스크리닝 라이브러리에는 Mix A에서 E까지 라벨링된 5개의 Mix로 분할된 103개의 단편이 있습니다. 스크리닝 샘플의 준비는 샘플 피펫팅 로봇을 사용하지 않고 수동으로 수행할 수 있습니다. 40 μM thiM RNA 함유 용액 (완충액 조건)을 혼합물로부터의 3.2 μL와 혼합하였다. 추가의 대조군 샘플은 완충액만, 5%의 DMSO를 갖는 완충액(이전에는 원하는 DMSO 농도의 존재 하에서 생체거대분자의 안정성을 보장함) 및 RNA를 갖는 완충액으로 구성되었다. 이 13개의 스크리닝 샘플을 준비하여 3mm NMR-튜브로 옮겼습니다. NMR 튜브의 바코드는 RNA의 존재 및 부재 하에서 각각의 혼합물을 주사하고, 대조군 샘플뿐만 아니라 298 K에서 수행된 전술한 19FNMR 실험에 따라 측정하였다. 사내 라이브러리에 대한 thiM RNA의 스크리닝은 각각의 상이한 샘플에 대해 0 ms 및 200 ms의 CPMG로T2 측정을 수행함으로써 수행하였다. 모든 샘플에 대해 추가로 측정된 1H 1D실험의 라인 넓힘 및 강도 손실 측면에서 모든 DMSO 피크를 비교하여 측정을 마친 후 적절한 shimming 및 수분 억제를 모니터링했습니다. 수득된 CPMGT219F이완 스펙트럼의 처리는 각각 TopSpin에서 미리 제조되고 자동화된 매크로를 사용하여 수행되었다. 데이터 분석은 프로토콜 섹션의 지침에 따라 수행되었습니다. TopSpin에서 얻은 적분 데이터(프로토콜의 지침에 따름)는 올바른 조건과 임계값을 설정하여 미리 만들어진 스프레드시트 또는 유사한 프로그램을 사용하여 빠르고 쉽게 평가할 수 있습니다. 앞에서 설명한 대로 임계값은 바인더, 약한 바인더 또는 비바인더를 정의하는 데 유용합니다. 도 5는 각각 thiM RNA 및 PtkA의 CPMG 스펙트럼의 전형적인 결과를 보여준다. 어떤 경우에는 추가 전문가 수정이 필요했습니다. 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig05.jpg"> 도 5: CPMG 기반 실험의 상이한 지연 시간으로부터 얻어진 강도 변화를 보여주는 19F CPMG NMR 스펙트럼 중 컷아웃. (A) E. coli로부터의 TPP riboswitch thiM RNA에 대해 수행된 19F단편 기반 스크리닝에서의 결합제(hit) 및 비결합제의 표현. (B) M. tuberculosis의 PtkA에 대해 수행된 19F단편 기반 스크리닝에서 결합제 및 비결합제의 표현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
1시간 스크리닝
혼합물 설계 사용된 사내 라이브러리는 매우 다양하여 1시간 스크리닝 목적으로 혼합물 설계가 수행되지 않았습니다. 이는 하나의 혼합물에서 혼합할 12개를 무작위로 선택하여 64개의 혼합물을 준비했음을 의미합니다.
시료 전처리 예시적인 SARS-CoV-2 RNA의 1시간 스크리닝을 위해, 샘플을 준비하기 위해 피펫팅 로봇을 사용한 자동 피펫팅을 수행하였다. 각각의 혼합물 중의 단편은 90% d6-DMSO 및 10%D2O중 4.2 mM의 농도를 가졌다. 스크리닝 샘플의 최종 부피는 200 μL였으며, 5%D2O를 잠금제로서 사용하였다. pH 6.2에서 25 mM KPi, 50 mM KCl의 상이한 혼합물을 각각 함유하는 64개의 샘플을 표적 RNA 없이 피펫팅하였다. 각각, 64개의 샘플을 각각 다른 혼합물을 함유하는 표적 RNA로 피펫팅하였다. RNA:리간드 비율을 1:20으로 설정하여 RNA 농도는 10μM, 리간드 농도는 200μM가 되었습니다.
데이터 분석 1시간 분석을 위해 TopSpin의 FBS 도구가 사용되었습니다. 단편이 적중인지를 결정하기 위해, 1D 화학적 이동, waterLOGSY, 및T2 완화 실험을 수행하였다. T2 완화의 경우, 30 % 초과의 강도 감소가 히트로 계산되었고, 화학적 이동의 경우 6Hz 초과의 이동이 컷오프 (cut-off)였다. waterLOGSY는 상당한 신호 변화(이 경우 음수에서 양수로)를 보여야 했습니다. 이 세 가지 기준 중 두 가지가 양수이면 조각이 적중으로 계산되었습니다. 이에 대한 두 가지 예는 그림 6에서 볼 수 있습니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62262/62262fig06.jpg"> 그림 6: 적중 결정 기준을 보여주는 예시적인 SARS-CoV-2 RNA에 대해 수행된 1시간 스크리닝. 3개의 상이한 실험 (1H T2 CPMG (5/100 ms), waterLOGSY, 및 1D 1H)의 획득. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62262/62262fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
Hit-1은 ~50%의T2 감소 및 6Hz≥ CSP를 나타낸다. waterLOGSY는 신호의 유의미한 변화를 나타내지 않아 양수로 간주됩니다. 3개의 실험 중 2개가 양성이므로 이 조각은 적중으로 계산됩니다. Hit-2의 경우 T2 는 ~80% 신호 강도의 감소를 나타내며 waterLOGSY에 대해 명확한 신호 변화를 볼 수 있습니다. 이 경우 CSP로는 충분하지 않지만 앞의 두 기준이 양수이므로 여전히 적중으로 계산됩니다.

NMR에 의한 단편 기반 스크리닝은 생체고분자(DNA, RNA 또는 단백질)에 대한 소분자 결합제를 신속하게 식별하는 강력한 방법입니다. 자동화 기반 시료 전처리, NMR 실험 및 획득 조건, 분석 워크플로우를 설명하는 프로토콜이 제시됩니다. 이 기술은 검출을 위해 1H 및 19FNMR 활성 핵 모두를 최적으로 이용할 수 있습니다.

최소 샘플이지만 최대 자동화 모드에서 NMR 기반 단편 스크리닝

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...

우리는 핵 자기 공명 연구를 수행합니다. 이를 통해 용액에서 단백질, RNA 및 DNA의 구조를 결정할 수 있습니다. 이러한 생체 분자는 구성 요소이며 세포의 구성 요소이며 여기에 제시하는 프로토콜은 소분자의 스크리닝 및 이러한 표적에 대한 결합과 관련이 있습니다.이러한 분자에서 우리의 의약 화학 및 구조 생물학은 질병과 싸우는 신약을 도출 할 수 있습니다. 우리 기술의 주요 장점은 단백질과 같은 분자 표적의 품질을 완전히 제어할 수 있고 소분자 단편 및 약물의 품질을 완전히 제어할 수 있으며 광범위한 친화도의 결합을 위해 단백질을 스크리닝할 수 있다는 것인데, 이는 다른 방법론에 비해 장점입니다. NMR 측정을 위한 스크린 샘플을 준비하려면 샘플 준비 로봇을 사용하여 768개의 화합물을 8개의 96웰 플레이트에 분배하여 혼합물당 4.2밀리몰의 최종 농도로 12개의 단편을 포함하는 64개의 혼합물을 얻습니다.적절한 스크리닝 완충액에 희석된 관심 생체 분자 표적을 적절한 수의 바코드가 부착된 3mm NMR 고처리량 시료 교환 튜브로 옮기고 로봇을 사용하여 각 리간드 혼합물 10마이크로리터를 표적 생체 분자의 각 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 로봇이 용액을 철저히 혼합하도록 합니다. NMR 획득을 위해 샘플을 분광계에 로드합니다.분광계 소프트웨어를 연 다음, 리간드 기반 실험을 위한 파라미터 세트와 펄스 시퀀스를 선택합니다. 나열된 모든 실험에 대해 여기 조각(excitation sculpting)을 물 억제(water suppression)로 선택합니다. 불소-19 스크리닝의 경우 1D 및 T2 실험을 모두 선택합니다.스펙트럼 폭을 220ppm으로, 여기 주파수를 140ppm으로, 분석 시간을 1시간에서 5시간 사이로 선택합니다. T2의 경우 CPMG 시간은 5밀리초에서 100밀리초 사이로 번갈아 가며 사용됩니다. T1r 및 T2 실험을 기록합니다.포화 전달 차이를 의사 2D로 기록합니다. 두 개의 단일 1D 스펙트럼을 처리하려면 릴렉스 옵션의 유무에 관계없이 AU 프로그램 ProcStd 함수를 사용하십시오. WaterLOGSY는 용매 신호에 대해 음수로 단계적으로 단계적으로 처리되어야 하는 단일 1D입니다.수소 스크리닝 데이터를 분석하려면 단편 기반 스크리닝 도구에 대한 지침에 따라 스크리닝 캠페인의 생체 분자 자기 공명 NMR 데이터를 저장하여 각 스크리닝 혼합물에 샘플에서 측정된 다양한 실험이 포함된 하위 디렉토리가 있는 디렉토리를 갖습니다. 생체 분자 표적 없이 샘플에서 저장된 모든 데이터를 가지고 참조 스펙트럼을 저장하지만 혼합물과 단일 화합물은 서로 다른 디렉토리에 저장합니다. 수집 된 데이터가 포함 된 디렉토리에 대한 직접 경로를 만들고 모든 혼합물에 고유 한 디렉토리가 있어야하는 NMR 디렉토리를 선택하십시오.CSV, 조각 화면, XML 문서 및 BAC 파일도 데이터의 NMR 디렉터리에 복사되었는지 확인합니다. 스크리닝된 샘플에 대해 조각 기반 스크리닝 도구를 사용하려면 조각 기반 스크리닝 프로젝트 기호를 분석 창 가운데로 끕니다. 이전에 저장된 데이터 세트가 복사된 경우 기호가 나타나야 합니다.조각 기반 스크리닝 옵션 창이 자동으로 열립니다. 믹스 이름, 각 프래그먼트 이름 및 각 프래그먼트를 믹스로 나누는 내용이 포함된 CSV 칵테일 파일을 선택합니다. 단일 단편의 모든 측정된 스펙트럼이 포함된 참조 리간드 스펙트럼 폴더를 정의하고, 일반적으로 조사된 표적이 없는 혼합물의 데이터 세트를 포함하는 참조 빈 실험 폴더를 정의합니다.조사된 스펙트럼 및 스펙트럼 표시 색상을 정의하려면 스펙트럼 유형 탭을 열고 프로세스 데이터에 따라 사양 유형을 설정합니다. Display Layout 탭에서 사양 유형에 따라 비교할 스펙트럼을 정의합니다. 그런 다음 확인을 클릭하여 프로젝트를 시작합니다.데이터가 처리되는 동안 모든 칵테일 믹스와 각 믹스의 리간드를 요약하는 테이블이 있는 별도의 창이 열립니다. 셀을 두 번 클릭하여 해당 데이터셋을 엽니다. 바인더를 할당하기 전에 기준 피크가 서로 일치하고 화학적 이동이 동일한지 확인하십시오.차이점이 발견되면 프로세스 탭을 열고 직렬 처리 옵션을 사용하여 수정하십시오. 불소-19 혼합물에 대한 첫 번째 분석의 경우 분석 탭을 열고 적분 함수를 선택합니다. 혼합물의 각 단편에 대해 해당 불소-19 신호에 대한 명확한 통합 영역이 정의되어 있는지 확인합니다.내보내기 통합 영역을 저장하여 나중에 사용할 수 있도록 통합 파일을 내보내고 사용된 통합 파일을 적절한 설치 디렉토리에 저장합니다. 불소-19 데이터의 경우, 조사된 표적이 있거나 없는 데이터 세트를 열고, 분석 탭에서 통합 영역 통합 및 읽기를 클릭하여 해당 통합 파일을 현재 스펙트럼에 로드합니다. 그런 다음 저장 후 돌아가기를 클릭하여 적분 탭에서 통합 영역 목록을 찾고 다운스트림 분석을 위해 이 정보를 스프레드시트에 복사합니다.단편 라이브러리에 있는 리간드의 분자 구조 또는 구성은 입증된 대로 분자 신뢰 소프트웨어를 사용하여 분석되고 결과는 그래픽 출력으로 표시됩니다. 주황색은 조각이 구조나 농도에 불일치를 보임을 나타냅니다. 녹색 우물은 조각이 일관성이 있음을 나타냅니다.이 대표적인 분석에서, 사내 라이브러리에서 하나 또는 여러 개의 불소 그룹을 함유하는 103 개의 단편을 혼합물 당 20 내지 21 개의 단편으로 구성된 5 개의 혼합물로 나누었다. 불소-19 횡방향 이완 실험은 CPMG 펄스 트레인을 적용한 각 혼합물에 대해 측정되었습니다. 역치는 이러한 전형적인 티아민 단백질 티로신 키나아제 A 및 RNA 스펙트럼에서 관찰되는 바와 같이 혼합물에서 결합제, 약한 결합제 또는 비결합제를 정의하는 데 유용합니다.이 대표적인 분석에서 히트 1은 T2 약 50 %의 감소와 6 헤르츠 이상의 화학적 이동을 보였다. WaterLOGSY는 양성으로 간주되는 신호에 큰 변화를 나타내지 않았습니다. 그러나 3 건의 실험 중 2 건이 양성 이었기 때문에이 단편은 히트로 간주되었습니다.두 번째 히트의 경우 T2는 신호 강도가 약 80% 감소한 것으로 나타났습니다. WaterLOGSY에 대해서도 명확한 신호 변화가 관찰되었습니다. 이 실험에서는 화학적 이동이 충분하지 않았지만 이전의 두 가지 기준이 긍정적이었기 때문에 여전히 히트로 간주되었습니다.이러한 방법의 최종 목표는 예를 들어 효소와 같은 신약 또는 고친화성 억제제를 개발하는 것이며, 이 경우 의약 화학이 이러한 새로운 분자를 인수하고 합성하지만 구조 생물학, 여기에 적용하는 기술은 의약 화학을 안내하고 그 접근 방식을 훨씬 더 빠르게 만들 수 있습니다.

nmr-based-fragment-screening-minimum-sample-but-maximum-automation

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

의 샘플 준비<em&gt; Mycobacterium 결핵</em핵 자기 공명 Metabolomic의 연구&gt; 압축을 풉니 다

이 비디오에서는 자동화된 모세관 전기영동을 사용하여 cell-free DNA 또는 cfDNA 단편의 크기 분포를 분석합니다. 이 기술은 세포사멸 중에 암세포에서 방출되는 DNA 단편의 프로파일에 대한 통찰력을 얻는 데 도움이 됩니다.

CFDNA의 자동화된 모세관 전기영동 기반 단편 크기 분포 분석: 생체 유체에서 분리된 DNA 단편의 크기 분포를 연구하기 위한 DNA 마이크로칩 기반 방법

이 원고는 차세대 염기서열분석을 위해 DNA 단편을 정제하기 위한 자동화된 겔 크기 선택 접근법을 설명합니다. Ranger Technology는 아가로스 겔 로딩, 전기영동 분석 및 표적 DNA 단편 회수의 전체 프로세스를 완전히 자동화하여 고처리량 및 고품질 차세대 염기서열분석 라이브러리를 가능하게 합니다.

자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

종양학 검체의 차세대 표적 염기서열분석을 위한 통합 시스템에 대해 설명합니다. 이 크로스 플랫폼 시스템은 저품질 및 소량 종양 생검에 최적화되어 있고, 낮은 DNA 입력을 수용하며, 잘 특성화된 다중 변이 대조군을 포함하고, 정량적 사전 분석 품질 관리 측정에 의해 정보를 얻은 새로운 변이 호출자를 특징으로 합니다.

낮은 품질과 낮은 수량 종양 생검의 습식 및 건식 벤치 프로세스의 통합을 대상으로 최적화하여 차세대 시퀀싱

나노 크기의 PCR에 의한 DNA 및 RNA 기반 병원균 높은 처리량 테스트는 syndromic 개와 말 호흡기 PCR 패널을 사용하여 설명한다.

나노 PCR에 의한 동물 표본의 호흡기 병원체의 높은 처리량 검출

차세대 시퀀싱 (NGS) 플랫폼 (~0.5–2.0%)의 높은 오류 속도 의해 제한 되는 genomic 특성 분석을 위한 강력한 도구입니다. NGS 오류율을 제거 하 고 변형 대립 유전자 분수 0.0001 희귀에서 변이 감지 수 있는 오류 수정 시퀀싱의 우리의 방법을 설명 합니다.

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

여기서, 우리는 임상 시험에서 Sanger 시퀀싱, RT-PCR 및 서부 블로팅을 사용하여 dystrophin 38 발현의 분자 특성화를 제시합니다.

안티센스 올리고뉴클레오티드 임상 시험에서 DMD 환자 샘플에서 엑슨 건너뛰기 효율 특징

표적단백질(즉,열시프트 분석, TSA)의 용융 온도의 변화를 모니터링하는 것은 수백 개의 화합물의 단편 라이브러리를 선별하는 효율적인 방법입니다. 당사는 본질적인 트립토판 형광 및 단편 스크리닝을 위한 가벼운 백 산란을 모니터링하기 위한 로봇 보조 나노 차분 스캐닝 플루오리미터(나노 DSF)를 구현하는 TSA 프로토콜을 제시합니다.

단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광

이 프로토콜은 비용 효율적인 전사체 기반 약물 스크리닝을 위해 체외 또는 체외 세포 배양에서 전사체 데이터 전처리까지의 워크플로우를 설명합니다.

비용 효율적인 전사체 기반 약물 스크리닝

DNAzyme 기반 나노머신은 핵산의 매우 선택적이고 민감한 검출에 사용할 수 있습니다. 이 기사에서는 무료 소프트웨어를 사용하여 10-23 코어를 가진 DNAzyme 기반 나노머신을 설계하기 위한 자세한 프로토콜과 Epstein-Barr 바이러스 단편 검출에 대한 응용 프로그램에 대해 설명합니다.

DNAzyme 10-23 - 핵산 인식을 위한 기반 나노머신

이 프로토콜은 자동화 지원 유전자 라이브러리 생성 및 평가를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서의 체계적인 글로벌 최적화 방법을 제공합니다. 이는 실험을 간소화하고 유전적 구성 요소를 선택하여 바이오센서를 특정 설계 결과에 맞게 조정할 수 있도록 하는 실험 설계 방법론과 결합됩니다.

실험 설계 및 자동화 워크플로우를 통해 유전적으로 인코딩된 바이오센서 설계 공간의 효율적인 샘플링

배우세요 고분자 표적에 대한 NMR 기반 단편 스크리닝 방법을 통해 신약 후보 물질을 효율적으로 식별하는 기술을 익히세요. 자동화된 워크플로우가 데이터 품질과 재현성을 향상시킵니다.

최소 샘플이지만 최대 자동화 모드에서 NMR 기반 단편 스크리닝

더 많은 동영상 탐색