Name: 설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: 학습하세요 형광 분광법을 활용한 설치류 및 인간 뇌 조직의 액틴 중합 상태 평가 방법을. 이 고속 분석 기법은 시냅스 가소성 및 신경병리학 연구에 필수적인 도구입니다.

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이 작품은 뉴질랜드의 신경학회(1835-PG), 뉴질랜드 건강 연구 위원회(#16-597) 및 뉴질랜드 오타고 대학교 해부학부에 의해 지원되었습니다. 우리는 인간의 뇌 조직에 대한 HCB-IDIBAPS 바이오 뱅크 (스페인)의 신경 조직 은행에 빚지고 있습니다. 우리는 비디오의 녹음 및 편집에 그녀의 도움 에 대한 Jiaxian 장 감사합니다.

모든 실험 절차는 오타고 대학의 윤리위원회의 규정에 따라 실험실 동물의 치료 및 사용에 관한 규정에 따라 수행되었습니다 (윤리 프로토콜 번호. AUP95/18 및 AUP80/17) 및 뉴질랜드 의회. 인간의 뇌 조직은 바르셀로나, 스페인에 있는 병원 Clínic-IDIBAPS BioBank의 신경 조직 은행에서 취득되었습니다. 모든 조직 수집 프로토콜은 병원 Clínic의 윤리위원회에 의해 승인되었다, 바르셀로나, 통보 된 동의는 가족에서 얻은.
1. 버퍼 및 시약 준비
<ol><li>뇌 조직의 균질화 및 시냅스 말기의 농축 된 분수의 준비를 위해 다음과 같은 버퍼를 준비하십시오. 균질화 버퍼: 5 mM HEPES, pH 7.4 0.32 M 자당으로 보충 재서스펜션 버퍼: 5 mM Tris, pH 7.4 0.32 M 자당으로 보충 세척 버퍼 : 5 mM 트리스, pH 8.1 1.2 M 자당 1.0 M 자당 0.85 M 자당</li>
	<li>프로테아제와 인산염 억제제의 수제 또는 상업적 혼합을 추가합니다. 참고: 우리는 완전한 프로테아제 억제제 믹스 (10 mL 버퍼 당 1 정)와 포스파타제 억제제 칵테일 IV (1:100; 볼륨 : 볼륨)의 EDTA가없는 버전을 사용했습니다.</li>
	<li>다음 버퍼 및 시약을 준비하여 펠로이드의 고정, 투과성 및 바인딩을 준비합니다. 크렙스 버퍼: 118.5 mM NaCl, 4.7 mM KCl, 1.2 mM MgCl2,2 mM CaCl2,0.1 mM KH2PO4,5 mM NaHCO3,10mM 포도당, 20 mM HEPES, pH 7.4 1 M KCl 25% 글루타랄데히드 (스톡 솔루션) 크렙스 버퍼 포함 0.1% 트리톤 X-100 및 1 mg/mL NaBH4 400x 알렉사 플루어 647 DMSO의 팔로이드인 0.32 M 자당함유 크렙스 버퍼 DMSO의 50 μM 라트런큘린 A(스톡 솔루션) 1 M KCl (스톡 솔루션) 주의: 판로이드는 독성 (LD50 = 2 mg /kg) 조심스럽게 처리해야합니다. 글루타랄데히드의 흡입은 독성이 있으며 연기 후드로 처리해야합니다.</li>
	<li>버퍼를 4°C및 프할로이딘 및 라트룬쿨린 A에 -20°C에 저장하여 장기 보관합니다. 참고: 버퍼의 장기 저장소는 권장되지 않습니다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>2. 뇌 조직 균질화
<ol><li>포터-엘베젬 유리 튜브에서 10권의 균질화 완충제에서 냉동 보존 또는 갓 해부된 쥐 뇌 조직을 균질화하고 얼음 위에 유봉합니다. 참고: 최적의 균질화는 뇌 조직을 위해 손으로 유봉의 15-20 스트로크에 의해 달성됩니다. 유리 튜브를 통한 서스펜션의 원활한 흐름에 의해 성공적인 균질화를 확인할 수 있다. 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
	<li>브래드포드 분석31을사용하여 동종모네이트의 단백질 농도를 결정한다. 참고: 단백질 추정을 위한 대체 수제 또는 상업적인 소법도 사용될 수 있습니다.</li>
	<li>크렙스 버퍼의 균질화 샘플을 50 μL의 부피로 2-3 mg 단백질/mL 농도로 희석시 희석시. 참고 : 일부 실험에서, 우리는 1 h에 대한 37 ° C에서 2 μM 라트런큘린 A 또는 DMSO (컨트롤)로 균질화를 배양. 이를 위해 균질화는 크렙스 버퍼48μL로 재주항되며, 50 μM 라트런큘린 A 또는 DMSO 2 μL의 2μL이 첨가된다. 면역블로팅을 위해, 소량의 시료(10 μg)가 인큐베이션 후 수집된다.</li>
	<li>균등질 샘플을 수정합니다(섹션 5).</li>
</ol>3. 고립 된 신경 단말의 준비
<ol><li>시냅토좀 의 준비 참고: 시냅토좀의 대체 프로토콜32,33도 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>원심분리기 뇌는 4°C에서 10분 동안 1,200 x g에서 동형으로 항성합니다.</li>
		<li>원유 핵 분획인 펠릿을 폐기하십시오.</li>
		<li>추가 원심분리기 상류체(S1)는 4°C에서 15분 동안 12,000 x g에서 3.1.1 단계에서 수득하였다.</li>
		<li>수용성 세포질 분획인 상체(S2)를 제거합니다.</li>
		<li>3.1.3 단계에서 얻은 펠릿(P2)을 다시 중단하는 것은 재서스펜션 버퍼에서 원유 시냅토소말 분획이다. 참고: 재서스펜션 버퍼의 양은 시작 조직의 양과 얻은 펠릿의 양에 따라 달라집니다. 예를 들어, 뇌 조직의 150-300 mg으로 시작할 때, 얻어진 펠릿은 200 μL의 재서스펜션 버퍼에서 재장중단될 수 있다.</li>
		<li>재중단된 원유 시냅토솜을 0.85-1.0-1.2 M 의 동일한 부피로 만든 불연속 자당 그라데이션에 로드합니다. 참고: 우리는 일반적으로 사용 1 mL 자당 용액의 각 (에 대 한 150-300 mg 조직). 이것은 더 큰 조직 양을 위해 변경될 수 있습니다. 불연속 그라데이션은 초원심분리기 튜브의 내부 벽에 압착된 25G 주사기를 사용하여 만들 수 있으며, 자당층의 부드러운 층화를 할 수 있다.</li>
		<li>원심분리기는 85,000 x g에서 4°C에서 2시간 동안. 참고: 원심분리의 고속으로 인해 난방을 줄이기 위해 진공을 만들 수 있는 초원심분리기가 필요합니다.</li>
		<li>200 μL 파이펫 팁을 사용하여 1.0과 1.2 M 자당 사이의 인터페이스에서 시냅토소말 분획을 수집합니다.</li>
		<li>시냅토소말 분획을 4°C에서 10분간 18,000 x g에서 원심분리로 원심분리하여 시냅토소말 분획을 세척합니다. 참고: 세척의 경우, 1.0 mL 및 1.2M 자당계에서 얻은 시냅토소말 분획은 신선한 1.5mL 튜브에서 수집되고, 동일한 양의 세척 버퍼가 첨가되어 매체로부터 높은 자당의 제거를 보장한다.</li>
		<li>시냅토소말 펠릿을 얼음냉균질화 버퍼로 4°C에서 10분간 12,000g으로 다시 세척합니다.</li>
		<li>얼음에 균질화 버퍼에서 시냅토솜을 다시 일시 중지합니다. 참고: 프로토콜은 여기에서 잠시 일시 중지할 수 있습니다.</li>
		<li>브래드포드 분석서를 사용하여 단백질 농도를 결정합니다.</li>
		<li>Krebs 완충제의 시냅토좀을 50 μL의 부피에서 2-3 mg 단백질/mL의 농도로 재보페한다(시냅토좀이 KCl에 의해 탈극화될 경우 47.5 μL; 섹션 4 참조). 참고: 재서스펜션의 경우 시냅토소말 분획은 먼저 12,000 x g에서 4°C에서 5분 동안 회전하고 상체(buffer)가 제거됩니다. 시냅토소말 펠릿은 200 μL 파이펫 팁을 사용하여 부드러운 파이펫팅으로 크렙스 버퍼에서 다시 수주됩니다.</li>
		<li>탈극화를 진행합니다(섹션 4).</li>
	</ol></li>
	<li>시 냅 토 신경증의 준비 참고: 시냅토신경좀의 대체 프로토콜34,35도 사용할 수 있다.<ol>
<li>1 mL 주사기를 사용하여 필터 홀더에 100 μm 모공 크기의 미리 습윤된 그물 필터를 통해 뇌를 균일지게 전달합니다. 참고: 모든 필터의 사전 습윤은 시료 손실을 방지하는 것이 중요하며 균질화 버퍼를 사용하여 수행해야 합니다. 이를 위해, 균질화 버퍼는 버퍼가 유출될 때까지 1mL 주사기를 사용하여 필터 홀더의 필터를 통과한다.</li>
		<li>얼음 에 미리 차가운 1.5 mL 튜브에 여과 (F1)를 수집합니다.</li>
		<li>F1 분획에 대한 프로세스(3.2.1 및 3.2.2 단계)를 반복하여 두 번째 여과(F2)를 얻습니다.</li>
		<li>5 μm 모공 크기의 그물 필터를 통해 F2 여과를 전달합니다.</li>
		<li>얼음 에 미리 차가운 1.5 mL 튜브에 여과 (F3)를 수집합니다.</li>
		<li>원심분리기 는 4 °C에서 10 분 동안 1,500 x g에서 F3를 여과합니다.</li>
		<li>50 μL의 부피에서 2-3 mg 단백질/mL의 농도에서 얼음에 크렙스 버퍼 (시 냅 토 신경좀)에서 펠릿 (시 냅 토 신경좀)을 다시 중단 (47.5 μL 시 냅 토성 KCl에 의해 탈극화 될 경우; 섹션 4 참조). 참고: 프로토콜은 여기에서 잠시 일시 중지할 수 있습니다.</li>
		<li>브래드포드 분석서를 사용하여 단백질 농도를 추정합니다.</li>
		<li>탈극화를 진행합니다(섹션 4).</li>
	</ol></li>
</ol>4. KCl 매개 분리된 시냅스 단자의 탈극성
<ol><li>시냅토좀/시냅토신경좀을 37°C에서 5-10분 동안 평형화한다.</li>
	<li>37°C에서 30s에 대해 세포외 K+를 50mM로 늘리고 각 자극되지 않은 제어 세트에 크렙스 버퍼의 동일한 부피를 추가하기 위해 KCl을 추가하여 시냅토좀/시냅토신경좀을 자극한다. 참고: 예를 들어, 크렙스 버퍼의 47.5 μL에서 다시 중단된 시냅토좀에 1M KCl의 2.5 μL을 추가합니다. 그리고 각각의 자극되지 않은 제어 시냅토솜에 크렙스 버퍼의 2.5 μL을 추가합니다. 많은 수의 샘플이 관여하는 실험의 경우, 탈극화 시간이 30s를 초과하지 않도록 한 번에 2개 이상의 시료를 진행하지 않습니다.</li>
	<li>글루타랄데히드(섹션 5)를 추가하여 자극을 종료합니다.</li>
</ol>5. 시료의 고정 및 팔로이진 염색
<ol><li>실온에서 2-3 분 동안 2.5 %의 최종 농도에 호모게네이트 / 시냅토소말 / 시냅토 신경소말 샘플에 글루타랄데히드를 추가합니다. 참고: 50μL 샘플(균질제/시냅토좀/시냅토신경좀)에 글루타랄데히드의 최종 농도가 2.5%가 되도록 25%의 글루타랄데히드 용액의 6μL을 추가했습니다. 고정은 중요하고 빠르므로 글루타랄데히드를 추가한 직후, 시료는 적극적으로 소용돌이쳐야 합니다.</li>
	<li>샘플을 5분 동안 20,000 x g로 퇴적시합니다.</li>
	<li>상부체를 제거합니다. 참고: 글루타랄데히드가 독성이 있기 때문에 연기 후드에 상체를 버리십시오.</li>
	<li>0.1% 트리톤 X-100 및 1 mg/mL NaHB4를 함유한 크렙스 버퍼의 100 μL에서 실온에서 2-3분 동안 환액하여 펠릿을 페메아빌화한다.</li>
	<li>샘플을 5분 동안 20,000 x g로 퇴적시합니다.</li>
	<li>투과화 버퍼를 제거합니다.</li>
	<li>200 μL의 Krebs 버퍼로 펠릿을 20,000 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세척합니다.</li>
	<li>1x 알렉사 플루어 647 Phalloidin (500 μU에 해당)으로 펠릿을 실온에서 10 분 동안 10 분 동안 버퍼링합니다. 참고: 다른 종류의 형광 판로이딘 유사체는 시판되고 분석용으로 대체될 수 있습니다. 판로이드의 농도와 배큐어의 총 샘플 부피는 테스트되는 조직 /샘플의 양 및 유형에 따라 수정되어야 할 수 있으며 최적의 조건은 그에 따라 표준화되어야합니다.</li>
	<li>5 분 동안 20,000 x g에서 스테인드 샘플을 원심 분리합니다.</li>
	<li>언바운드 프할로이딘(상수)을 제거합니다.</li>
	<li>크렙스 버퍼 200μL로 샘플을 5분 동안 20,000 x g에서 원심분리하여 세척합니다.</li>
	<li>0.32 M 자당을 포함하는 크렙스 버퍼의 200 μL에서 재중단. 참고: 프로토콜은 여기에서 잠시 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>6. 불소 분석 및 광 산란
<ol><li>블랙 96웰 플레이트에 알렉사 플루어 647 판로이드 염색 샘플을 분배합니다.</li>
	<li>645nm의 발산 파장과 실온에서 플레이트 판독기에서 670nm의 방출 파장에서 형광 강도를 측정합니다.</li>
	<li>200 μL 파이프 팁을 사용하여 검은 색 96 웰 플레이트에서 투명 96 웰 플레이트로 샘플을 전송합니다.</li>
	<li>540nm에서 광 산란을 측정하여 고정, 투과화 및 염색의 이전 단계에서 발생할 수 있는 손실을 수정합니다. 참고: 스테인드 샘플에 유지되는 생물학적 물질의 변이는 더 적은 양의 시작 재료에 대해 더 두드러질 수 있습니다(토론 참조).</li>
	<li>다른 농도에서 Krebs 버퍼에 있는 알렉사 플루어 647 Phalloidin 세트를 포함 (0.05 x, 0.1 x, 0.25 x, 0.35 x, 0.75 x, 0.5 x 및 1x 에 해당 25, 50, 125, 175, 250, 375 및 500 μu) 각 배치의 경우. 참고: 이것은 선택적 단계이며 특히 F-액틴 수준이 상대적인 방식으로 표현될 때 분석 결과에 영향을 미치지 않습니다(섹션 7). 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.</li>
</ol>7. 데이터 분석
<ol><li>시료의 F-액틴의 양은 바운드 판로이드의 형광 강도에 직접 비례한다. 태그된 프할로이딘 표준의 선형 곡선으로부터 계산된 팔로이드진 바운드 단위의 절대적인 측면에서 표현한다. 참고: 예를 들어 그림 2A-B, 3A, 4A-B 및 보충 도 2를참조하십시오.</li>
	<li>제어 샘플의 일부로 F-액틴 수준을 표현합니다. 참고: 예를 들어 그림 5A-B를참조하십시오.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 설명된 분석체는, 본질적으로 수정과 이전 연구30에서 적응, 형광 라벨태그 남백색, 남근을 고용한다. 형광 판로이드 유사체는 고정조직47,48,49에서액틴 필라멘트를 염색하기위한 금 본위제로 간주됩니다. 사실, 그들은 특히 actin 필라멘트50을 식별하는 가장 오래된 도구이며, 여전히 특히 후속 형광 현미경 기반 분석을 위해 액틴 필라멘트를 검출하는 가장 널리 사용되는 계측기남아있다. 중요한 것은, phalloidin은 짧은 액틴 필라멘트(51)의느슨하고 불규칙한 메쉬 워크조차도 얼룩지게 된 것으로 나타났으며, 이는 phalloidin 결합이 필라멘트 길이에 의존하지 않는다는 것을 나타낸다. 반면에 당사의 프로토콜은 형광 분광법...

Cytoskeletal 단백질 액틴은 구조적 지지, 세포 수송, 세포 운동성 및 분열을 포함한 다중 세포 기능에 관여합니다. 액틴은 단일황 구형 액틴(G-actin) 및 중합필액트액틴(F-actin)의 두 가지 형태로 평형에서 발생한다. actin의 중합 상태의 급속한 변화 (G-와 F-형태 간의 상호 변환)는 신속한 필라멘트 조립 및 분해를 초래하고 세포 생리학에서 의 규제 역할을 기초로합니다. 액틴은 뉴런 사이토켈레탈 구조의 주요 성분을 형성하고 광범위한 뉴런 기능1,2에영향을 미친다. 참고로, 액틴 세포골격은 시냅스 단자의 구조 플랫폼의 필수적인 부분을 형성한다. 이와 같이, 시냅스 형태발생 및 생리학의 주요 결정자이며 시냅스3,4,5의크기, 수 및 형태에 대한 제어에 근본적인 역할을 한다. 특히, 동적 액틴 중합-중합제는 기억 및 학습 과정의 근간이 되는 시냅스 가소성과 관련된 시냅스 리모델링의 핵심 결정자이다. 실제로, 두 사전 시냅스(예:신경 전달물질 방출6,7,8,9,10)및 포스트냅스 기능(가소성 관련 동적 리모델링11,12,13,14)액틴 사이토스켈레톤의 중합 상태의 동적 변화에 비판적으로 의존한다.
생리학적 조건하에서, F-actin 수준은 번역 후 변형4,15,16뿐만 아니라 액틴결합 단백질(ABP)4,17을포함하는 다중 모달 통로를 통해 동적으로 엄격하게 조절된다. ABP는 여러 수준(예: 중합재 의 활성화 또는 억제, 필라멘트 분기 유도, 작은 조각으로 필라멘트의 단절, 중합을 촉진하고, 비합화로부터 보호)에서 액틴 역학에 영향을 미칠 수 있으며, 다양한 외세포 신호18,19,20에민감한 엄격한 변조 제어 하에 차례로 발생한다. 여러 수준에서 이러한 규제 검사는 시냅스 세포 골격에서 actin 역학의 엄격한 규제를 지시, 미세 조정 사전 튜닝 사전 및 기초 및 활동 유도 상태에서 신경 생리학의 포스트 냅스 측면.
신경 생리학에서 actin의 중요한 역할을 감안할 때, 여러 연구가 신경 변성, 심리질환뿐만 아니라 신경 발달 질환3,21,23,24,25,26, 27을포함한 광범위한 신경 질환에 연결된 중요한 병원성 이벤트로서 actin 역학의 변경에 대한 증거를 제공한 것은 놀라운 일이 아니다. 그러나, 중요한 격차는 특히 시냅스 세포골격에서 actin 역학의 이해에 남아 있는 신경 생리학 및 병리 생리학에 있는 actin의 중요한 역할을 가리키는 연구 데이터의 부에도 불구하고, 그러나, 중요한 간격은 아직도 actin 역학의 이해에 남아 있습니다. 더 많은 연구 연구는 신경 actin및 병리학 적인 조건 하에서 그것의 변경의 더 나은 이해가 필요 합니다. 이러한 맥락에서 초점의 한 가지 주요 영역은 액틴 중합 상태의 평가입니다. 서양 블로팅 기반 상용 키트가 있습니다 (생체 분석 생화학 키트의 G-Actin / F-Actin; 사이토스켈레톤 SKU BK03728,29)및 F-액틴 레벨6의평가를 위한 홈메이드 아세서. 그러나, 이들은 F-actin와 G-actin의 생화학적 격리를 필요로 하고 그들의 후속 정량화는 면역 blotting 프로토콜에 근거하기 때문에, 그(것)들은 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 본 명세서에서는 F-actin의 기저 수준과 조립 분해의 동적 변화를 평가하는 데 사용할 수 있는 수정으로 이전 연구30에서 조정된 형광 분광계 분석법을 보고합니다. 특히, 우리는 현재 96 웰 플레이트 포맷에 1mL 큐벳에 적합한 샘플을 필요로하는 원래 프로토콜을 효율적으로 수정했습니다. 따라서 수정된 프로토콜은 분석에 필요한 조직/샘플 양을 크게 감소시켰습니다. 또한, 우리는 프로토콜이 뇌 조직 균질화뿐만 아니라 고립 된 시냅스 말단 (시냅토좀 및 시냅토신경좀)과 같은 세포 외 분획에도 적합하다는 증거를 제공합니다. 마지막으로, 분석은 새로 해부 된 설치류 뇌 조직과 장기 저장된 사후 인간 뇌 샘플에 사용할 수 있습니다. 참고, 분석 신경 컨텍스트에서 제시 하는 동안, 그것은 적절 하 게 그들과 관련 된 다른 세포 유형 및 생리 과정에 확장 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>3.5 mL, 개방형 두꺼운 폴리카보네이트 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>349622</td><td>그래디언트 원심분리용(시냅토솜 준비)</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Phalloidin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A22287</td><td>F-actin 특정 리간드</td></tr><tr><td>항체 &nbsp; b-actin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-47778</td> GAPDH에 대한 면역 <td>블로팅 항체에 의한 총 액틴 수준 평가</td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>Ab181602</td><td>면역 블로팅에 의한 GAPDH 수준 평가</td></tr><tr><td>Bio-Rad 단백질 분석 염료 시약 농축액</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>Bradford 기반 단백질 추정</td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물 (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td>Krebs 완충액 성분</td></tr><tr><td>cOmplete, Mini, EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4693159001</td><td>샘플 준비 중 내인성 프로테아제 활성 억제용</td></tr><tr><td>Corning 96-well Clear Flat Bottom 폴리스티렌</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>광 산란 측정용</td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td><td>당Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Krebs 완충액 성분</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>phalloidin 및 latrunculin 용 용매 형</td></tr><tr><td>광 평판 스캐너 (Odyssey 적외선 스캐너)</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>면역 블롯의 면역 반응 신호 감지용</td></tr><tr><td>글루타르알데히드 용액(물 중 25%) 등급 II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6257</td><td>고정제</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>샘플 준비용 완충 성분 및 Krebs 완충 성분</td></tr><tr><td>Latrunculin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L5163</td><td>액틴 필라멘트의 해중합기</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물(MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td>Krebs 버퍼 구성 요소</td></tr><tr><td>Microplates</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mitex 멤브레인 필터 5mm</td><td>Millipore</td><td>LSWP01300</td><td>synaptoneurosomes Nunc</td></tr><tr><td>F96 MicroWell Black Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>237105</td><td>형광 측정용</td></tr><tr><td>나일론 네트 필터 100mm</td><td>Millipore</td><td>NY1H02500</td><td>시냅토뉴로솜 제제</td></tr><tr><td>Phosphatase Inhibitor Cocktail IV</td><td>Abcam</td><td>ab201115</td><td>시료 준비 중 내인성 인산</td></tr>가수분해효소 활성 억제 염화<tr><td>칼륨(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Krebs 완충액 성분 및 시냅스 말단 탈분극</td></tr> 인<tr><td>산칼륨 일염기성((KH2PO4 )</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td>Krebs 완충액 성분</td></tr> 수<tr><td>소화붕소나트륨(NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71320</td><td>투과화 완충액 성분</td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>LabServ(Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL944</td><td>크렙스 완충액 성분</td></tr><tr><td>탄산수소나트륨(NaHCO3)</td><td>LabServ(Thermo Fisher Scientific)</td><td>BSPSL900</td><td>Krebs 완충 성분</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>분자 장치</td><td></td><td>형광 측정용</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Fisher Chemical</td><td>S/8600/60</td><td>시료 준비를 위한 완충 성분</td></tr><tr><td>Swimnex 필터 홀더</td><td>Millipore</td><td>Sx0001300</td><td>시냅토뉴로솜 준비</td></tr><tr><td>조직 분쇄기 5mL Potter-Elvehjem</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>358034</td><td>조직 균질화를 위해</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td>투과 완충액</td></tr><tr><td>Trizma 기초</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6066</td><td>표본 준비를 위한 완충기 성분</td></tr></tbody></table>

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues

세포 골격의 주요 구성 요소인 액틴은 신경 구조와 기능의 유지 에 중요한 역할을 합니다. 생리학적 상태에서 액틴은 모황 구형(G-actin) 및 중합된 필라멘트(F-actin)의 두 가지 형태의 평형에서 발생합니다. 시냅스 단자에서 액틴 세포골격은 중요한 시냅스 기능의 기초를 형성합니다. 더욱이, 액틴 중합 상태의 동적 변화(구형 및 필라멘트 형태의 액틴 간의 상호 변환)는 시냅스 구조 및 기능의 가소성 관련 변화에 밀접하게 연관되어 있다. 우리는 여기에 전 생체 조건에서 actin의 중합 상태를 평가하기 위해 변형 된 형광 기반 방법론을보고합니다. 이 분석법은 형광라벨이 부착된 플라로이드인을 사용하며, 이는 특히 액틴 필라멘트(F-actin)에 결합하여 중합화된 필라멘트 액틴을 직접 측정합니다. 원칙의 증거로, 우리는 설치류와 사후 인간 뇌 조직 균질화분석의 적합성에 대한 증거를 제공합니다. 라트룬큘린 A(액틴 필라멘트를 비합한 약물)를 사용하여, 우리는 F-액틴 수준에서 변경을 모니터링하는 분석의 유용성을 확인합니다. 또한, 우리는 높은 세포외 K+를가진 탈극화에 의한 자극시 증가된 액틴 중합화를 확인하는 고립된 시냅스 말단의 생화학적 분획으로 분석법을 확장한다.

F-액틴 레벨 평가를 위한 분석의 선형성 먼저, 알렉사 플루어(647)의 형광의 선형 증가를 위한 표준 곡선을 확인하였으며 각 실험세트(도 1)에대해 반복되었다. 분석의 선형 범위를 조사하기 위해 설치류(그림 2A 및 2B)와 사후 인간 과목(그림3A 및 3B)으로부터다양한 양의 뇌 균질화가 처리되었다. 상기 분석체는 라벨이 부착된 판로이드의 양에 의해 평가된 단백질의 50-200 μg 범위에서 선형으로 나타났다. 540 nm에서 광 산란은 샘플의 상이한 양을 확인하는 데 사용되었다(도 2C 및 도 3C).
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우리는 설치류와 인간 과목의 뇌 조직에서 전 생체 생물학적 샘플에서 actin 필라멘트의 정량화를위한 간단하고 시간 효율적이고 높은 처리량 형광 분광 기반 분석법을보고합니다.

Actin, the major component of cytoskeleton, plays a critical role in the maintenance of neuronal structure and function. Under physiological states, actin ...

Actin은 세포 골격의 주요 구성 요소이며 뉴런을 포함하여 세포 형태학 및 생리학의 여러 측면을 비판적으로 조절합니다. 액틴은 두 가지 형태, 단황 구형 G-actin 또는 중합체 필라멘트 F-actin 사이의 평형에서 발생합니다. actin의 중합 상태는 actin 결합 단백질뿐만 아니라 자체 번역 후 규정에 의해 여러 수준에서 엄격하게 규제됩니다.신경 간 시냅스 접점에서 F-actin 수준의 동적 변화는 시냅스 전 및 사후 시냅스 터미널 모두에서 신호 및 가소성을 제어하는 주요 규제 이벤트입니다. 당연히, actin 기능 장애는 몇몇 신경 병증 상태에 연결됩니다. 최근 발전은 신경 생리학 및 병리 생리학에 있는 actin의 지식의 부를 지도했습니다.그러나 많은 아직 알려지지 않았으며 에 초점을 맞출 필요가있다. 이와 관련하여, 폰로이드인의 형광 유사체는 액틴 연구의 주요 도구로 입증되었습니다. 이 남근토신은 특히 필라멘트 액틴에 결합하고, 따라서 F-actin의 수량및 병리학적 상태의 변경의 직접적인 척도로 사용될 수 있다.이 연구는 뇌 조직에서 도매 균질화 및 생화학적으로 고립된 시냅스 말단과 같은 전 생체 내 생물학적 샘플에서 액틴 중합 상태의 평가를 위한 빠르고 효율적인 형광 분석법을 제시합니다. 참고, 분석은 다른 세포 및 조직 유형 및 관련 생리 현상에 적용될 수 있다. 이 스터디에 사용된 버퍼의 조리법은 자세한 텍스트를 참조하십시오.쥐 또는 인간 과목에서 뇌 조직 샘플 은 포터-엘베젬 유리 튜브에서 균질화 되었고 10권의 균질화 완충제에서 얼음에 유봉하였다. 시냅토솜 제제를 위해, 호모게네이트는 먼저 느린 속도로 회전한 다음 더 빠른 속도로 회전하여 조잡한 시냅토솜 미토콘드리아 분획을 얻었다. 이 조분획으로부터 의 한농축 시냅토솜은 불연속 자당 그라데이션에 따라 얻어졌다.시냅토신경소말 제제를 위해 균질화는 2개의 100미크론과 1개의 5미크론 필터를 순차적으로 전달했습니다. 단백질 추정은 브래드포드 시약을 사용하여 수행되었고 샘플은 50 마이크로리터의 최종 부피에서 mL 단백질 당 2 ~ 3 밀리그램의 농도로 크렙스 버퍼에서 희석되었다. 분리된 시냅스 단자, 시냅토좀 또는 시냅토신경좀의 자극은 37도에서 세포외 칼륨의 짧은 30초 증가에 의해 수행되었다.이를 위해, 1마리의 어금니 칼륨염을 15밀리몰라의 최종 농도로 시료에 첨가하였다. 균질화는 자극되지 않고 탈극성 단편이 2.5%의 글루타랄데히드로 고정되었으며, 25%의 글루타랄데히드 스톡 용액을 첨가하였다. 샘플은 실온에서 2 분, 3 분 동안 배양되었습니다.고정은 5 분 동안 20, 000 G에서 원심 분리에 의해 제거되었습니다. 샘플은 실온에서 2~3분 동안 0.1%트리톤 X-100 및 mL 나트륨 보로하이드라이드당 1 mg을 함유한 크렙스 버퍼에서 재서스펜션에 의해 투과화를 위해 진행되었다. 투과 완충제 버퍼는 원심분리에 의해 다시 제거되었고 펠릿은 크렙스 버퍼로 피상적으로 세척되었고 1X 알렉사 플루어 647 프할로이드인을 함유한 크렙스 버퍼에서 재장중단되었으며, 이는 500 마이크로 유닛의 판로이드인에 해당한다.바인딩은 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 진행할 수 있었습니다. 과도한 언바운드 프할로이드인은 20, 000 G에서 원심분리에 의해 시료로부터 5분 동안 제거되었고, 펠릿은 크렙스 버퍼로 표면적으로 세척되었고, 시냅토좀 또는 시냅토뉴모종의 부력을 유지하기 위해 0.32 개의 어어 자당을 함유한 크렙스 버퍼에서 다시 재장정하였다. 형광 판로이드 바운드 샘플은 플레이트 판독기에서 형광 판독을 위해 96 개의 잘 검은 색 판에 분배되었습니다.각광 및 방출 파장은 각각 645나노미터 및 670 나노미터로 설정되었다. 실험의 각 세트에 대해 우리는 0.32 어어 자당을 포함하는 크렙스 버퍼에서 알렉사 플루어 647 phalloidin의 다른 양을 포함했다. 세척 단계 동안 샘플의 손실을 설명하기 위해 샘플은 검은 색에서 투명 96 웰 플레이트로 전송되었습니다.샘플을 포획한 다음 440 나노미터에서 검사하였다. 형광 판로이드의 보존은 샘플에서 액틴 필라멘트 또는 F-액틴 수준의 양에 직접 비례한다. 프할로이딘 결합의 선형성은 50 에서 200 마이크로그램 단백질의 범위에서 관찰되었다.원칙의 증거로, 우리는 또한 라틀컬린 A에 의한 액틴 필라멘트의 약리학적 중단을 이용한 F액틴 분해 모델에서 우리의 분석 효능뿐만 아니라 KCl중재된 시냅스 단말의 자극에 의한 F액틴 형성의 자극을 시험했다. 바운드 판로이드로부터의 형광 방출은 표준 선형 곡선으로부터 생성된 바운드 프할로이드의 어느 단위로도 표현될 수 있으며 제어 시료를 기준으로 한다. 도 4의 경우, F-액틴 수준은 바운드 팔로이드의 마이크로 단위로 표현된다.한편, 탈극성 시냅스 단편에서 도 5 F-액틴 수준은 제어편광 시료에 따라 발현된다. 우리는 actin 필라멘트, 또는 F-actin의 분석을 위한 견고하고 시간 효율적이며 높은 처리량 분석, 그리고 96 웰 플레이트 형식에 적합한 생리및 병리학 적 상태의 변경에 대해 설명합니다. 분석법은 기존 대체 프로토콜보다 훨씬 빠르며, 단독으로 또는 기존 면역 히스토팅 기반 분석과 함께 액틴 관련 연구에서 필수적인 도구로 작용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오는 현미경 검사를 위해 쥐 피질 뉴런을 형광 염색하는 절차를 보여줍니다. F-액틴 및 수지상 단백질을 표적으로 하여 구조적 무결성을 분석하고 신경 기능과 건강을 연구하는 데 중요한 F-액틴 밀도를 계산합니다.

쥐 피질 뉴런에서 Filamentous Actin Puncta의 정량화

필라멘트 액틴(F-actin)은 척추 발생, 시냅스 가소성 및 시냅스 안정성에 중요한 역할을 합니다. 따라서 F-actin puncta의 정량화는 시냅스 구조의 무결성을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이 프로토콜은 저밀도 1차 피질 신경 세포 배양에서 Phalloidin으로 표지된 F-actin puncta를 정량화하는 절차를 설명합니다.

쥐 두피 뉴런의 사상 액틴 (F - 굴지) puncta의 정량

우리는 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 기초 판독하여 단백질 상호 작용을 분석 자동화 형광 수명 이미징 (FLIM)을 이용하는 오픈 소스 고 함량 분석 (HCA) 기기를 제시한다. 이 openFLIM-HCA 기기에 대한 데이터 수집은 소프트웨어 μManager 작성 및 데이터 분석 FLIMfit에 착수에 의해 제어된다.

자동 형광 수명 이미징 현미경을 활용하여 오픈 소스 높은 콘텐츠 분석

제시 여기 경작 하는 수정 된 롤러 튜브 방법 이며 photoetched coverslips에 정확한 위치와 많은 주 동안 설치류 두뇌의 간헐적인 고해상도 이미징 조각. 신경 생존 및 슬라이스 형태로 잘 유지 됩니다. 셀 형 특정 식에 대 한 바이러스를 사용 하 여이 완전히 동봉 된 시스템의 응용 프로그램에 제공 됩니다.

정확 하 게 지역화 하 고 반복적인 뇌 조각 동봉 된 시스템에서의 장기적인 문화 중 간헐적인 이미징 수정된 롤러 튜브 메서드

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

절차는 머리 고정, 행동 마우스에서 단백질 키나제 A 활동을 시각화하기 위해 제시된다. 향상된 A-키나아제 활동 리포터, tAKARα는 피질 뉴런으로 표현되고 두개골 창을 통해 이미징에 접근할 수 있게 된다. 2 광자 형광 일생 화상 진찰 현미경 검사법은 강제운동 도중 생체 내 PKA 활동을 구상하기 위하여 이용됩니다.

생체 내 2 광자 형광 평생 이미징 현미경 을 사용하여 머리 고정 행동 마우스에서 단백질 키나제 활동을 시각화

여기서, 우리는 뇌 영역에서 단백질을 분석 하기 위해 면역 조직 화학 및 고해상도 스캔과 함께 근 적외선 염료를 사용 하는 프로토콜을 제시 합니다.

근 적외선 형광 및 고 분해능 주사를 사용 하 여 설치류 뇌의 단백질 발현 측정

우리는 광액성 신경필라멘트 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형광성 광섬유 단백질을 표현하는 형질성 광섬유 마우스에서 말초 신경의 단일 골수축축에서 신경필라멘트의 축산수송을 분석하는 방법을 설명합니다.

절제된 마우스 티비알 신경에 있는 신경필라멘트 수송의 화상 진찰 그리고 분석

시냅스 전달에 필요한 세포하 이벤트를 시각화하기 위해 두 가지 관련 방법이 설명된다. 이들 프로토콜은 시험관내 배양된 뉴런의 라이브 세포 이미징을 사용하여 시냅스 전 칼슘 유입 및 시냅스 소포막 융합의 역학의 실시간 모니터링을 가능하게 한다.

근위축성 측삭 경화증 모델에서 시냅스 기능의 실시간 형광 측정

우리는 형광 현미경과 함께 간단한 액틴 필라멘트 미세 유체 분석을위한 프로토콜을 제시하여 개별 액틴 필라멘트를 실시간으로 정확하게 모니터링하면서 순차적으로 다른 단백질 용액에 노출 할 수 있습니다.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

학습하세요 형광 분광법을 활용한 설치류 및 인간 뇌 조직의 액틴 중합 상태 평가 방법을. 이 고속 분석 기법은 시냅스 가소성 및 신경병리학 연구에 필수적인 도구입니다.

설치류 및 인간의 뇌 조직에서 액틴 중합 상태를 평가하기위한 시간 효율적인 형광 분광 법 분석 기반 분석

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