Name: 양에서 성인 및 프레우버탈 난소에서 채취한 생체외 성숙 난소의 진동 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 배우세요 양의 성인 및 프레우버탈 난소에서 채취한 난자의 유리화 및 체외 성숙 프로토콜. 이 방법은 생식 생물학 및 동물 생명공학 연구에 활용됩니다.

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저자는이 작품에 대한 구체적인 자금을받지 못했습니다. 마리아 그라치아 카파이 교수와 발레리아 파시우 박사는 비디오 보이스오버와 비디오 제작 중 실험실 을 설립한 것에 대해 감사하게 인정받고 있습니다.

동물 프로토콜 및 아래에 설명된 구현된 절차는 유럽 연합 지침 86/609/EC및 유럽 공동체 위원회 2007/526/EC의 권고에 따라 사사리 대학의 발효 윤리 지침에 따라 결정됩니다.
1. 오낭 조작을 위한 미디어 준비
<ol><li>덜벡코의 인산완충식식염을 0.1g/L 페니실린과 0.1g/L 연쇄상구균(PBS)으로 보충하여 수집된 난소의 수송을 위한 매체를 준비한다.</li>
	<li>페니실린으로 보충된 밀리큐 물 1L1L로 파우더로 9.5g의 조직 배양 배지(TCM) 199를 희석하여 난피테 수집 및 성숙을 위한 배지를 준비합니다(0.1%) 연쇄상 구균(0.1%).<ol>
<li>희석 후, 100mL의 매체를 필터링하고 1주일 동안 사용할 스톡 성숙 매체(SMM)로 4°C로 저장한다.</li>
		<li>나머지 900mL를 25m HEPES, 0.36g/L 중탄산염, 0.1% (w/v) 폴리비닐 알코올(PVA) (pH 7.3, osmolality 290 mOsm/kg)로 보충하여 수집 매체(CM)를 준비한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>0.021 g/L 중탄산염, 10% 열 처리에 필요한 에스트루스 양 세럼, 1 IU/mL FSH, IU/mL LH 1개, 시스증기인 100μL 및 피루바테 8 mg/mL로 보충된 SMM으로 성숙 배지를 준비한다. 참고: 10mL의 부피의 성숙 배지는 사용하기 전에 최소 4시간 동안 표준 조건(공기 중에서 39°C에서 최대 가습대기)에서 배양되어야 합니다.</li>
	<li>Ca++ 및 Mg++없이 PBS로 구성된 체외 성숙 후 난미성 조작을 위한 기본 매체(BM)를 준비하여 20%의 태아 종아리 혈청(FCS)으로 보충한다.</li>
</ol>2. 오키테 컬렉션 및 성숙
<ol><li>청소년 (30-40 일, 체중 6-10kg)과 성인 난소에서 난모를 복구하십시오.</li>
	<li>27°C에서 PBS에서 1-2 h 이내에 있는 실험실로 상업용 도축장에서 수집된 난소를 수송한다.</li>
	<li>PBS 신선한 배지에서 세척한 후, 마이크로 블레이드를 사용하여 CM의 난소를 슬라이스하여 여포 함량을 방출합니다.</li>
	<li>60배율의 입체현미경 검사에서, 과립세포의 4-10층, 분모세포, 세포질내 지질방울의 균일분포, 외경 90μm(평균)를 가진 분비제를 선택하여 체외 성숙을 위한 적수-oocyte 복합체(COC)를 선택한다.</li>
	<li>선택한 COC를 CM에서 세 번 세척하고 마침내 성숙 배지로 옮겨드시다. 참고 : 청소년 난모세포의 경우, 진동 후 생존을 개선하기 위해, 100 μM trehalose와 성숙 배지를 보완합니다.</li>
	<li>체외 성숙의 경우, 30-35 COC를 4웰 페트리 접시에 성숙 배지 600 μL로 옮기고, 300 μL의 미네랄 오일로 덮여 있으며, 39°C에서 공기 중 5% CO2에서 22(성인 난미세포)/24(청소년 난우세포)를 배양한다.</li>
	<li>체외 성숙 후, 부드럽게 파이펫팅하여 적혈구의 누드 COC. 60배율의 입체현미경하에서 검사를 받은 후, 첫 극지 체에서 압출을 보이는 사람만 선택하여, 따라서 지하 II(MII) 단계에서 유리화를 선택한다.</li>
</ol>3. 정액 수집, 동결 및 해동 절차
<ol><li>램 익스텐더 (200 mM Tris; 70 mM 구연산; 55 mM 과당; pH 7.2, osmolality 300 mOsm/kg)로 구성된 정액 냉동 보존을위한 기본 매체를 준비 20 % (v / v)로 보충.</li>
	<li>양 사육 시즌(10월~11월)에만 정액을 모으게 한다.</li>
	<li>성인 램 (2-5 세)에서 인공 질에 의해 사정을 얻고, 야외 환경에서 유지 및 라이브 웨이트 유지 보수 배급을 공급. 램을 별도의 펜에 분리하지만 서로 시각적으로 접촉하십시오.</li>
	<li>전체 번식 기 동안 일주일에 한 번 정액 수집을 반복하여 각 남성으로부터 적어도 8 개의 사정을 얻습니다.</li>
	<li>정액 샘플을 수집 후 5분 이내에 환경 온도로 실험실로 운반하고 즉시 처리합니다. 2-3 램의 사정을 풀과 정자 농도 분광측정을 평가.</li>
	<li>풀링 후, 400 x 106 spermatozoa/mL까지 사정을 희석시키는 정액 냉동 보존을 위한 기본 배지로 4% 글리세롤을 보충하였다. 그런 다음 희석된 정액을 2h의 기간 동안 4°C로 식히고 동결하기 전에 20분 동안 상량화합니다.</li>
	<li>정액 샘플을 마른 얼음에 펠릿 형태(0.25 mL)로 동결한 다음 액체 질소로 떨어지게 합니다.</li>
	<li>해동을 위해 펠릿을 멸균 유리 매에 넣고 39°C에서 20s의 수조에 넣습니다.</li>
</ol>4. 체외 수정 및 배아 배양
<ol><li>합성 난관유체(SOF)의 체질에 대한 재고를 준비한다.<ol>
<li>재고 A 준비: 밀리크 워터 99.4 mL; NaCl 6.29 g; KCl0.534 g; 0.161 g 의 KH2PO4; 0.182 g 의 MgSO4 ·7H2O; 및 나트륨 락테이트의 0.6 mL. 최대 3개월 동안 4°C로 보관하십시오.</li>
		<li>재고 B 준비: 밀리크 워터 의 10 mL; 0.210 g 의 NaHCO3; 페놀 레드 2-3 g. 1 개월 동안 4 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>재고 C 준비: 밀리크 워터 의 10 mL; 및 피루바테 나트륨 0.051 g. 1 개월 동안 4 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>재고 D 준비: 밀리크 워터 10 mL; 및 CaCl2 2H 2O.의 0.262 g는 1 개월 동안 4 °C에서 보관하십시오.</li>
		<li>밀리큐 물 7.630mL, 주식 A 1mL, 주식 B 1mL, 주식 C 0.07mL, 주식 D 0.7mL로 구성된 SOF 10mL을 준비하십시오.</li>
		<li>체외 수정 (IVF) 매체 준비: SOF는 2 % 열 처리 에스트라스트 양 혈청, 10 μg / mL 헤파린 및 1 μg / mL hypoutarine (osmolality 280-290 mOsm / kg)로 보충합니다. 참고: 10mL의 부피의 IVF 배지는 표준 조건(5% CO 2, 5% O2 및 90%N2에서39°C에서 최대 가습된 대기)에서 적어도 4시간 이상 배양되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>온난한 IVF 배지의 1.5mL 이하의 멸균 유리 원추형 튜브에 냉동/해동 된 정액 알리쿼트를 전송하고 공기 중 5 % CO2에서 가습 된 분위기에서 39 °C에서 15 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>잠복 후, 운동성 정자는 액체 기둥의 정액 부분을 향해 수영한다. 상단 층을 수집하고 정자 운동성 평가를 관찰합니다. 참고: 정자 운동성 매개 변수는 다음과 같은 설정과 컴퓨터 보조 정자 분석 (CASA) 시스템을 사용하여 평가되어야한다 : 25 프레임은 정자 트랙 중복을 피하기 위해 획득, 최소 대비 10, 평균 경로의 최소 속도 30 μm / s, 진보적 인 운동성은 80 % 직선 >. 이 시스템은 램 정자 평가를위한 특정 설정이 있습니다. 각 샘플에 대해, 정자 현탁액의 5 μL 하위 샘플은 10 μm의 깊이를 가진 미리 따뜻진 분석 챔버에 로드됩니다. 정자 운동성은 상 대비 현미경을 사용하여 40x에서 37°C에서 평가되며 서브샘플당 최소 500개의 정자를 적어도 4개의 상이다른 현미경 분야에서 분석해야 한다. 총 운동및 진보적인 운동성 정자의 백분율이 평가되었습니다. IVF의 경우, 진보적 인 운동성 정자의 비율은 30 %≥.</li>
	<li>1 x 106 spermatozoa/mL 최종 농도에서 수영 유래 모틸성 정자를 희석하고 4웰 페트리 접시에 미네랄 오일로 덮인 IVF 매체의 300 μL에서 MII 난소세포로 공동 배양합니다.</li>
	<li>22h 후 SOF를 함유한 4웰 페트리 요리로 추정 된 zygotes를 0.4 % 소 세럼 알부민과16 산산에서 보고한 바와 같이 oviductal 농도에서 필수적이고 불필요한 필수 아미노산을 함유하고 있으며, 발아세포 단계까지 표준 조건하에서 배양합니다.</li>
	<li>22-, 26- 및 32-h 에서, 60 배율와 스테레오 현미경의 밑에 검사에 의해, 두 개의 뚜렷한 blastomeres를 보여주는, 갈라진 난투의 수를 기록합니다.</li>
	<li>배아를 매일 관찰하는 배아는 문화의 다섯 번째에서 9 일째까지 이고 새로 형성된 분폭제는 60배율을 가진 스테레오현미경의 밑에 검사에 의해 기록되어야 합니다.</li>
</ol>5. 오키테 바이트로피화 및 온난화
참고: 장치극저온(17)을사용하여 최소 필수 볼륨(MEV) 방법에 따라 진동화를 수행합니다.
<ol><li>BM에서 2 분 동안 38.5 °C에서 5 개의 난초의 그룹을 상형화합니다. BM의 사용은 낮은 칼슘 농도 보장 ([Ca2++]2.2 mg/dL)10.</li>
	<li>BM에서 7.5%(v/v) 디메틸 설산화물(DMSO) 및 7.5%(v/v) 에틸렌 글리콜(EG)을 함유한 평형 용액에 3분 노출을 통해 난미를 탈수한다.</li>
	<li>난소는 16.5%(v/v) DMSO, 16.5%(v/v) EG 및 BM의 0.5M 트레할로스를 함유한 바이트화 용액으로 전송한 후 극저온 장치에 적재하고 30대 이내에 액체 질소로 직접 급락한다.</li>
	<li>생물학적 온도로 따뜻해지기 위해 각 유리화 장치의 함량을 38.5°C에서 1분 동안 BM에서 1.25M 트레할로오스의 200 μL 방울로 옮기고 부드럽게 저어 혼합을 용이하게 합니다.</li>
	<li>세포 내 냉동 보호제의 제거를 촉진하기 위해, 피낭을 단계별로 200 μL 방울로 옮기기 위해 감소하는 트레할로오스 용액(BM의 0.5M, 0.25 M, 0.125 M trehalose)으로 30s에서 38.5°C로 38.5°C로 평형화됩니다.</li>
</ol>6. 온난화 후 난모세포 품질 평가
<ol><li>온난화 후, Ca++와 Mg++ 플러스 20% FCS (BM) 없이 PBS에서 6 h에 대 한 난모 를 배양 5% CO2 공기에서 38.5°C. 참고: 유리화 후 생물학적 및 구조적 특징을 복원하는 난모세포 능력은 사용된 난모세포의 종 과 클래스와 관련이 있습니다.</li>
	<li>냉동 보존 손상을 복구하는 난모세포 능력은 시간에 따라 달라지므로 온난화 후 체외 배양(0h, 2h, 4h, 6h)의 다른 시점에서 난낭의 품질을 평가하여 난소 비료를 위한 최적의 시간 창을 정의합니다. 참고 : 성인 양 oocyte에서 최적의 시간은 4 시간 후 온난화입니다. 프레우버탈 오피테의 경우, 최적의 시간은 2시간 후 온난화입니다.</li>
</ol>7. 오사이클 생존 평가
<ol><li>온난화 직후와 온난화 후 문화의 각 시간 지점에 대해 100배 배율로 반전된 현미경을 사용하여 난미세포를 형태학적으로 평가합니다. 참고: 희미한 세포질, 손상 조나 펠루시다 및/또는 멤브레인과 같은 구조적 변경 기능이 있는 오사이클은 퇴화로 분류되어야 합니다.</li>
	<li>이중 차동 형광 염색을 사용하여 멤브레인 무결성 평가를 검증합니다.</li>
	<li>38.5°C에서 5%의CO2에서 5분 동안 프로피듐 요오드(PI; 10 μg/mL) 및 Hoechst 33342(10 μg/mL)를 함유하는 BM의 2mL에 난모사이클을 배양한다.</li>
	<li>신선한 BM에서 세 번 세척한 후, 350nm의 흥분 필터와 Hoechst 33342의 460 nm 의 방출을 사용하여 형광 현미경으로 난토를 관찰하고 535 nm의 발광 필터와 PI용 617 nm의 방출을 관찰하십시오. 참고: 그대로 막이 있는 난동은 Hoechst 33342를 가진 색깔DNA의 푸른 형광에 의해 인식될 수 있습니다. 손상된 막을 가진 Oocyte는 PI를 가진 DNA 염색 때문에 빨간 형광을 보여줍니다.</li>
</ol>8. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사에 의한 미토콘드리아 활성 및 ROS 세포내 수치 평가
<ol><li>미토트래커 레드 CM-H2XRos(MT-Red) 프로브를 준비합니다.<ol>
<li>1mM 용액을 얻기 위해 1심(50 μg)의 함량을 DMSO 1mL로 희석한다. 희석된 유리알을 액체 질소에 보관하십시오.</li>
		<li>100 μM 스톡 용액을 얻기 위해 DMSO로 용액 1m를 희석하고 어둠 속에서 -80 °C에 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>준비 2′,7′-디클로로디하이드로플루오레세신 (H2DCF-DA) 프로브.<ol>
<li>H2DCF-DA를 0.1% 폴리비닐 피롤리돈(PVA)/PBS로 희석하여 최초 100mM 솔루션을 얻습니다. 용액을 -80 °C에서 어둠 속에서 유지하십시오.</li>
		<li>첫 번째 용액을 0.1% PVA/PBS로 희석하여 100 μM 스톡 솔루션을 얻습니다. 어둠 속에서 -20 °C에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마운팅 매체(MM):10mLMM의 경우 글리세롤 5mL, PBS 5mL, 아지드 나트륨 250mg을 추가합니다. 사용할 때까지 -20 °C에 보관하십시오.</li>
	<li>500 nM MT-레드 (스톡 용액 : DMSO에서 100 μM)와 BM에서 38.5 °C에서 30 분 동안 난모세포를 배양합니다.</li>
	<li>MT-Red 프로브를 사용하여 배양 한 후, BM에서 난모세포를 세 번 세척하고 5 μM H2DCF-DA (스톡 용액 : BM에서 100 μM)를 포함하는 동일한 매체에서 20 분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>프로브에 노출 된 후 BM에서 난모구를 씻고 2.5 % 글루타랄데히드 / PBS에서 적어도 15 분 동안 수정하십시오.</li>
	<li>고정 후, BM에서 난모세포를 세 번 세척하고 샘플의 압축을 방지하기 위해 왁스 쿠션을 사용하여 1 mg / mL Hoechst 33342MM의 4 μL 드롭에 유리 슬라이드에 마운트.</li>
	<li>평가될 때까지 어둠 속에서 4°C로 슬라이드를 저장합니다.</li>
	<li>공초점 레이저 스캐닝 현미경으로 면역 라벨섹션의 분석을 수행합니다. 현미경은 40/60x 오일 목표를 사용하여 Ar/He/Ne 레이저를 장착하고 있습니다. 순차적으로 섹션을 분석합니다.</li>
	<li>미토콘드리아 평가를 위해, MT-Red를 검출하기 위해 다광 레이저로 샘플을 관찰한다(노출: 579 nm; 방출: 599 nm).</li>
	<li>488nm에서 아르곤 이온 레이저 광선과 B-2 A 필터(495nm 노출 및 519 nm 방출)를 사용하여 디클로로플루오레세신(DCF)18을지적한다.</li>
	<li>각 개별 난수체에서 적도평면(19)에서MT-Red 및 DCF 형광 강도를 측정한다.</li>
	<li>모든 이미지 수집 중 일정한 값에서 형광 강도와 관련된 매개변수를 유지(레이저 에너지 26%, 순차 설정 1: PMT1 이득 649-PMT2 gain 482; 순차설정 2: PMT1 이득 625-PMT2 이득 589; 오프셋 0; 핀홀 크기: 68).</li>
	<li>라이카 LAS AF 라이트 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 형광 강도의 정량적 분석을 수행하며,20까지표준화된 절차에 따라.</li>
	<li>적도 평면에 도달 할 때까지, Z 축에 이동, 한 번 사진을 캡처합니다.</li>
	<li>각 사진에 대해 회색 스케일로 변환하고 채널 1(Hoechst blue과 관련된)을 끕니다. 그런 다음 수동으로 외딴 지역에 관심 영역(ROI)을 그립니다. 참고: 소프트웨어는 채널 2(FITC)의 픽셀 평균 값을 자동으로 읽을 수 있으며 배경 값을 빼는 것입니다.</li>
	<li>픽셀의 평균 값을 기록하고 통계 분석을 위해 제출합니다.</li>
</ol>9. 통계 분석
<ol><li>다음과 같은 차이점을 분석합니다: 청소년 대 성인 난우낭의 생존율, 생존율 및 트레할로오스 처리된 청소년 난십세포의 생존율, 생존 및 파르테노유전학 활성화율 및 다른 칼슘 농도 미디어로 진동하는 성인 난소세포의 발달 능력, 저칼슘 농도 또는 높은 칼슘 농도로 진동된 청소년 난소 세포에서의 배아 생산, 활성 미토콘세포 피트리아제 치아 정사각형 검사를 사용하여 성인과 청소년 유리화 난수세포 사이의 온난화 후 문화와 파르테노 유전 활성화 비율의 다른 시간 지점.</li>
	<li>레븐의 시험에 의한 분산의 균질성을 분석한 후 ANOVA에 의한 온난화 후 문화의 다른 시간 지점에서 미토콘드리아 활성 및 ROS 내 세포 내 수의 다른 시간 지점에서 진동성 성인 난소세포에서 골짜기 속도와 배아 출력을 분석한다. 투키 후 테스트를 사용하여 그룹 간의 차이점을 강조표시합니다.</li>
	<li>통계 소프트웨어 프로그램을 사용하여 통계 분석을 수행하고 P < 0.05의 확률을 최소 유의 수준으로 간주합니다. 모든 결과는 s.E.M ± 의미로 표현됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

가축의 오키테 냉동 보존은 여성 유전 자원의 장기적인 보존뿐만 아니라 배아 생명 공학의 개발을 진전시킬 수 있습니다. 따라서, 난소 진동을 위한 표준 방법의 개발은 가축과 연구 분야 모두에 유리할 것이다. 이 프로토콜에서는 성인 양 난소 진동을 위한 완전한 방법이 제시되고 청소년 oocyte에 대한 효율적인 유리화 시스템의 개발을 위한 견고한 출발점을 나타낼 수 있습니다.
제안 된 방법의 주요 장점 중 하나는 난모세포 수집, 시험관 성숙, 진동 및 온난화의 모든 단계를 포함한다는 것입니다. 또한, 난모세포가 수정되기 전에 진동 절차 중에 발생한 손해로부터 회수할 수 있도록 온난화 후 문화 기간을 포함한다. 수정을 위한 최적의 시간은 저온 보존, 초기 난소세포 질, 환자 연령 및 종의 방법에 따라 조정되어야 하며, 시간 회복과 난소 세포 노화의 양상을 고려하는 데 필수적이다25,26.</...

여성 게임테의 장기 저장은 유전적 선정 프로그램에 의한 국내 동물 사육 개선, 전시 야생동물 종 보존 프로그램을 통한 생물다양성 보존 에 기여하고, 생체외 배아 생산 또는 핵이식 프로그램1,2,3에통합될 저장된 난모세포의 가용성에 힘입어 체외 생명공학 연구 및 응용 프로그램을 강화하는 등 광범위한 응용 프로그램을 제공할 수 있다. 청소년 난소 성 유리화는 또한 사육 프로그램4에서생성 간격을 단축하여 유전 적 이득을 증가시킬 것이다. 난모세포의 초고속 냉각 및 온난화에 의한 진동은 현재 가축 난모세포 냉동 보존5에대한 표준 접근법으로 간주됩니다. 반추제에서는, 진동하기 전에, 난소는 일반적으로 아바토이르 유래 난소2로부터얻은 여포로부터 회수 한 후 시험관 내에서 성숙된다. 성인, 특히 프레우버탈 난소4,6은실제로 냉동 보존될 난귀의 거의 무제한 수를 공급할 수 있다.
가축에서, 오낭 성 진동 및 온난화 후, 배반물 수확량>10% 일반적으로 지난 10 년 동안 여러 실험실에 의해 보고 되었습니다3. 그러나, 작은 반추제 난미제에서 난막염 은 여전히 청소년과 성인 난소 모두에 대해 상대적으로 새로운 것으로 간주되며, 양 난미화물 진동에 대한 표준 방법은2,5로확립되어야 한다. 최근의 발전에도 불구하고, 유리화되고 따뜻해진 난소세포는 실제로 발달 잠재력을 제한하는 몇 가지 기능적 및 구조적 변화를 제시합니다7,8,9. 따라서, 생체화/온수 양 난모세포 2에서 10% 이상에서 발아세포 개발을 보고한 기사는 거의없다. 전술한 변경 사항을 줄이기 위해 여러 가지 접근법을 조사했습니다: 바이트로화 및 해동 용액의 조성을최적화(10·11); 다른 저온 장치의 사용을 실험8,12,13; 및 시험관 내 성숙(IVM)4,14, 15 및/또는온난화후 회복 시간 동안 6.
여기에서 우리는 청소년과 성인 기증자에게서 집합되고 냉동 보존 의 앞에 시험관에서 성숙한 양 난모세포의 병용 을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜에는 시험외 성숙에서 부터 진동, 온난화 및 온난화 후 문화 기간에 이르는 모든 절차가 포함되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>2&prime;,7&prime;-Dichlorofluorescin diacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-6883</td><td></td></tr><tr><td>알부민 소 분획 V, 프로테아제 무료</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td></td></tr><tr><td>Bisbenzimide H 33342 trihydrochloride (Hoechst 33342)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘(CaCl2 2H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2404</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>Leica Microsystems GmbH,Wetzlar</td><td>TCS SP5 DMI 6000CS</td><td></td></tr><tr><td>Cryotop Kitazato</td><td>Medical Biological Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cysteamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9768</td><td></td></tr><tr><td>D-(-) 과당</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0127</td><td></td></tr><tr><td>D(+)트레할로스 탈수</td><td>시그마-알드리치</td><td>T0167</td><td></td></tr><tr><td>디메틸설폭사이드(DMSO)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 인산염 완충 식염수</td><td>시그마-알드리치</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>달걀 노른자</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3556</td><td></td></tr><tr><td>에틸렌 글리콜(EG)</td><td>시그마-알드리치</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>FSH</td><td>시그마-알드리치</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>글루탐산</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5638</td><td></td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>시그마-알드리치</td><td>G8790</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>시그마-알드리치</td><td>H4149</td><td></td></tr><tr><td>헤페스</td><td>시그마-알드리치</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>하이포우타린</td><td>시그마-알드리치</td><td>H1384</td><td></td></tr><tr><td>도립현미경</td><td>Diaphot, 니콘</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-알라닌</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>A3534</td><td></td></tr>, <tr><td>L-아르기닌</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>A3784</td><td></td></tr>, <tr><td>L-아스파라긴</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>A4284</td><td></td></tr>, <tr><td>L-아스파르트산,</td><td>시그마-알드리치</td><td>A4534</td><td></td></tr>, <tr><td>L-시스테인</td><td>시그마-알드리치</td><td>C7352</td><td></td></tr>, <tr><td>L-시스틴</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>C8786</td><td></td></tr>, <tr><td>L-글루타민</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>G3126</td><td></td></tr>, <tr><td>LH</td>, <td>시그마-알드리치</td>, <td>L6420</td><td></td></tr>, <tr><td>L-히스티딘</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>H9511</td><td></td></tr>, <tr><td>L-이소류신</td><td>, 시그마-알드리치</td>, <td>I7383</td><td></td></tr>, <tr><td>L-류신</td><td>시그마-알드리치</td><td>L1512</td><td></td></tr>, <tr><td>L-라이신</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>L1137</td><td></td></tr>, <tr><td>L-메티오닌</td>, <td>시그마-알드리치</td><td>M2893</td><td></td></tr>, <tr><td>L-오르니틴</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>O6503</td><td></td></tr>, <tr><td>L-페닐알라닌</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>P5030</td><td></td></tr>, <tr><td>L-프롤린</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>P4655</td><td></td></tr>, <tr><td>L-세린</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5511</td><td></td></tr><tr><td>L-티로신</td><td>시그마-알드리치</td><td>T1020</td><td></td></tr><tr><td>L-발린</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>V6504</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 헵타하이드레이트(MgSO4.7H2O)시</td><td>그마-알드리치</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>Makler 계수 챔버</td><td>Sefi-Medical Instruments ltd. 바이오시그마 S.r.l.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>미디엄 199</td><td>시그마-알드리치</td><td>M5017</td><td></td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>시그마-알드리치</td><td>M8410</td><td></td></tr><tr><td>MitoTracker 레드 CM-H2XRos</td><td>ThermoFisher</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>신생아 송아지 혈청 열 비활성화(FCS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>N4762</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 G 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>페놀 레드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>폴리비닐 알코올 (87-90% 가수분해, 평균 몰 중량 30,000-70,000)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P8136</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성(KH2PO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>프로피듐 요오드화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>양 혈청</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2263</td><td></td></tr><tr><td>아지드화 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S2202</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dl-lactate 용액 시럽</td><td>시그마-알드리치</td><td>L4263</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>정자 등급 분석기</td><td>미생물 SL</td><td>S.C.A. v 3.2.0</td><td></td></tr><tr><td>통계 소프트웨어 Minitab 18.1</td><td>2017 Minitab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Olimpus</td><td>SZ61</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신 설페이</td><td>트 시그마-알드리치</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>시그마-알드리치</td><td>T7146</td><td></td></tr><tr><td>트리스</td><td>시그마-알드리치</td><td>15,456-3</td><td></td></tr></tbody></table>

양에서 성인 및 프레우버탈 난소에서 채취한 생체외 성숙 난소의 진동

Vitrification of In Vitro Matured Oocytes Collected from Adult and Prepubertal Ovaries in Sheep

가축에서는 도살장에서 쉽게 얻을 수 있는 많은 수의 난소와 난소 로 인해 체외 배아 생산 시스템을 개발하고 지속할 수 있다. 성인 난소는 항상 여러 개 항성 여포를 부담, 전 사춘기 기증자에서 난소의 최대 수는 4 주에 사용할 수 있습니다, 때 난소는 개소 여포의 피크 번호를 곰. 따라서, 4 주 된 양은 좋은 기증자로 간주됩니다, 프레우버탈 난모세포의 발달 능력이 성인 대응에 비해 낮은 경우에도. 
기본 연구 및 상업 응용 프로그램은 성인 및 프레우버탈 기증자 모두에서 얻은 유리화 된 난초를 성공적으로 냉동 보존 할 수있는 가능성에 의해 증폭 될 것입니다. 프레우버탈 기증자로부터 수집된 난소세포의 병리화는 또한 생성 간격을 단축하고 따라서 사육 프로그램에서 유전 이득을 증가시키는 것을 허용할 것입니다. 그러나, 동결 보존 후 발달 잠재력의 손실은 포유류 난모세포를 아마 냉동 보존하는 가장 어려운 세포 유형 중 하나를 만든다. 사용 가능한 냉동 보존 기술 중, 유리화는 동물과 인간의 난모세포에 널리 적용됩니다. 기술의 최근 발전에도 불구하고, 냉동 보호제의 고농도에 노출뿐만 아니라 차가운 부상과 삼투압은 여전히 여러 구조적 및 분자 변화를 유도하고 포유류 난모세포의 발달 잠재력을 감소. 여기에서, 우리는 청소년과 성인 기증자에게서 집합되고 냉동 보존 의 앞에 시험관에서 성숙한 양 난모세포의 병신을 위한 프로토콜을 기술합니다. 이 프로토콜에는 시험외 성숙에서 부터 진동, 온난화 및 후 침습 기간에 이르는 모든 절차가 포함되어 있습니다. MII 단계에서 진동하는 난초는 실제로 온난화 에 따라 수정 될 수 있지만 냉동 보존 절차로 인한 손상을 복원하고 발달 잠재력을 높이기 위해 수정되기 전에 추가 시간이 필요합니다. 따라서, 온난화 후 문화 조건과 타이밍은 난모세포 발달 잠재력의 회복을위한 중요한 단계입니다, 특히 난모세포는 청소년 기증자로부터 수집 될 때.

청소년 기증자의 난소 세포의 극온성은 성인 기증자에 비해 낮습니다. 관찰된 첫 번째 효과는 성인 난모세포에 비해 온난화 후 생존율이 낮습니다(도1A;θ 2 시험 P&lt;0.001). 청소년 난모세포는 온난화 후 멤브레인 무결성이 낮은 것으로나타났다(그림 1B). 성숙 배지에서 트레할로오스를 사용하는 것은 이 설탕이 청소년 난모세포에서 저온 부상을 줄일 수 있는지 여부를 확인하기 위한 것이었습니다. 이 데이터는23년 동안 트레할로오스 보충을 통해 24시간 동안 숙성된 난모세포가 비처리군에 비해 진동/온난화 후 생존율이 더 높은 것으로나타났다(표 1: 85.7% vs 75.3%, θ2 시험 P&lt;0.05). Trehalose 보충 실제로 온난화 후 높은 막 무결성과 관련 된...

이 프로토콜은 성인 및 청소년 양 난모세포의 유리화를 위한 표준 방법을 제공하는 것을 목표로 합니다. 여기에는 시험관 내 성숙 미디어 준비부터 온난화 후 문화에 이르기까지 모든 단계가 포함됩니다. 난동체는 최소한의 필수 볼륨을 보장하기 위해 Cryotop을 사용하여 MII 단계에서 진동됩니다.

In livestock, in vitro embryo production systems can be developed and sustained thanks to the large number of ovaries and oocytes that can be easily ...

장기 저장 후 난소 세포의 잠재적 생존의 유지는 좋은 기회의 도구를 나타냅니다. 청소년 난수체 진동은 번식 프로그램의 생성 간격에서 훨씬 짧아졌습니다. 초고속 냉각 및 온난화에 의한 진동은 가축 난소 보존의 표준 접근법으로 간주됩니다.그러나 양에서이 절차는 여전히 비교적 새로운 것으로 간주되며 표준 방법이 부족합니다. 이 비디오에서는 청소년과 성인 기증자 모두에서 수집한 양 난미세포의 병용 과실을 위한 프로토콜을 설명하고, 냉동 보존 이전에 숙성된 체외에서 설명합니다. 이 프로토콜에는 체외 성숙, 시험 신분, 온난화 및 온난화 후 문화의 모든 절차가 포함됩니다.정전기에서 24시간 동안 시험관에서 숙성된 Cumulus 난모세포 복합체를 회수한 후, 성숙 배지에서 트레할로오스의 백 마이크로몰러를 보충하는 조건. 체외 성숙에 따라, 난모세포는 60배 배율로 스테레오 현미경으로 부드럽게 피펫팅하여 기계적으로 적수푸스 세포를 탈피하였다. 바이트화 절차에서 제출할 난모세포의 선택은 이 절차의 성공적인 적용을 보증하는 첫 번째 중요한 단계를 나타냅니다.지질 방울의 균일한 분포, 모든 엠마의 무결성및 공간에서 연속적인 중추적인, 약 19 마이크로미터의 외경을 작고, 첫 번째 극지 체의 압출을 나타내고, 따라서 M2에서, 스테이지를 선택해야 한다. 유리화는 극저온 장치와 함께 최소 필수 볼륨 방법을 사용하여 수행되었다. 선발 후, 5명의 청소년 난모세포그룹이 2분 동안 기본 배지에서 섭씨 38.5도로 조절되었습니다.난모세포는 교정 용액에 3분 동안 노출되어 탈수되었습니다. 사용되는 유리화 장치에 난모세포의 하중은 중요하고 중요한 단계입니다. 극저온은 홀더에 부착된 폴리프로필렌 스트립을 사용합니다.이 방법에서, 진동용액의 난모세포는 0점 미만의 밀리리터가 필름 스트립 위에 유리 모세관으로 빠르게 적재된다. 그런 다음 용액을 제거해야 하며, 극저온 보존될 세포를 덮을 수 있을 만큼 얇은 층을 남겨두어야 합니다. Cryotop 장치에 로드되기 전에 30 초 이내에 액체 질소로 직접 급락했습니다.따뜻한 실내 생물학적 온도를 위해, 각 유리화 장치의 함량은 액체 질소에서 200 마이크로리터 방울로 리할로오스 용액을 감소시키는 것으로 옮겨졌다. 난피테는 얇은 유리 파이펫으로 난모세포를 드래그하여 추적 형 냉동 보호제의 제거를 촉진하기 위해 세트를 이송했다. 마지막으로, 난모세포는 5%의 이산화탄소를 배양한 배양기의 기본 배지에서 미리 번식하였다.온난화 직후, 그리고 온난화 후 문화의 각 시간 지점에 대해, 난소세포는 100배 배율로 반전된 현미경을 사용하여 형태학적으로 평가되었다. 청소년 기증자의 난모세포의 극저온 허용 오차는 온난화 후 멤브레인 무결성이 낮은 변경된 것과 비교하여 낮습니다. 청소년 난소에서 유도 된 성숙 배지에서 트레할로스의 사용은 더 높은 막 무결성을 증가시켜 진동 후 생존율을 증가시킵니다.그러나 골짜기, 수정, 및 청소년 난모세포의 발달 속도는 trehalose 보충에 의해 증가되지 않았다. 칼슘 농도가 2.2 밀리그램에 해당하는 탄압을 가진 매체를 사용하여 청소년 난모세포의 진동을 위해, 칼슘 농도로 진동하는 난모세포에 비해 더 높은 수정률을 취해야 하지만, 생산을 가능하게 하는 차이는 발견되지 않았다. 서로 다른 기간에 대한 온난화 후 문화를 비교하여, 우리는 이전 두에서 수집 된 배양 난미세포의 4 시간 후 에너지 결합및 미세 관 설정을 복구 할 수 있음을 보여 주었다, 높은 분열과 blastocytes 폐기물로 개발 능력을 복원 할 수 있습니다.미토콘드리아 활동은 다른 시간 점에 비해 온난화 후 문화의 4 시간 후에 유리화 된 따뜻한 청소년 난모세포에서 더 높았다. 미토콘드리아 분포 이별또한 온난화 후 6시간 동안 변경되었습니다. 더욱이, 반응성 산소 종 세포 내 수준은 0, 4, 및 6 시간에 비해 온난화 후 문화의 2 시간에 청소년 난모세포에서 현저하게 낮았다.그러나, 그리고 다른 난모세포에서 찾아낸 것과 는 대조적으로, 자발적인 parthenogentic 활성화의 비율은 청소년 난모세포에 있는 포스트 온난화 문화 도중 증가했습니다. 제안 된 방법의 주요 장점 중 하나는 난소 수집에서 체외 성숙, 진동 및 온난화에 이르기까지 모든 단계를 포함한다는 것입니다. 또한 온난 후 문화 기간을 포함하여 진동 절차 중에 발생한 손해로부터 난토테 복구를 허용합니다.수정을위한 최적의 시간을 선택하는 것은 도전이며, 유리화 프로그램의 결과에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한 느린 동결과 는 달리, 유리화가 수동 기술이며, 따라서 연산자 의존적이라고 생각되어야합니다. 이러한 이유로, 주요 과제는 시험화 프로그램의 결과 평가에서 운영자 효과를 고려하는 숙련 된 기술자와 연구원의 필요성입니다.우리의 실험실에서 추가 연구는 oocyte 진동 절차 및 선택을 표준화하는 시도, 청소년 oocyte의 요구에 미디어 구성을 더 잘 조정할 수 있습니다. 문화와 성격과 항산화제의 사용에 대한 무시는 유망한 기회를 제공합니다.

vitrification-vitro-matured-oocytes-collected-from-adult-prepubertal

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 원고는 형태 학적 및 생화학 적으로 말의 난 모세포를 특성화하기위한 실험적 접근법을 기술한다. 특히, 본 연구는 초음파 유도 난자 채취 (OPU)에 의한 미성숙 및 성숙한 난 모세포를 수집하는 방법과 염색체 분리, 스핀들 형태, 전 세계 히스톤 아세틸 화 및 mRNA 발현을 조사하는 방법을 설명한다.

말의 난 모세포에서의 염색체 분리, 히스톤 아세틸 화 및 스핀들 형태의 분석

여기에 제시 된 3D 문화 조건에서 돼지 난모세포의 캡슐화를위한 두 가지 프로토콜이 있습니다. 첫 번째, 적수-oocyte 복합체 (COC) 피브린-알자네이트 구슬에 캡슐화 된다. 두 번째, 그들은 불소 에틸렌 프로필렌 분말 입자로 동봉되어 (미생물 반응기). 두 시스템 모두 최적의 조건을 통해 3D 조직을 유지관리합니다.

포르신 오시테 캡슐화를 위한 프로틸분해 된 알기네이트 하이드로겔 및 소수성 미생물 반응기

이 원고는 상업적 지원에 실험실에서 만든 미디어와 미숙한 고양이 난모세포의 최소 볼륨 바이트화에 대한 프로토콜을 설명합니다. 전 생체 부 조나에서 바이피화및 온난화에 이르는 난소 분리에서 부터 모든 단계를 다룹니다.

미성숙한 고양이 오키트의 최소 볼륨 바이트화

우리는 발달의 초기 단계에서 난소 여포에서 성장 난모세포의 분리절차뿐만 아니라 완전히 자란 단계까지 성장과 차별화를 지원할 수있는 체외 문화 시스템의 설정에 대해 설명합니다.

가축의 초기 개국 여포에서 온수에 대한 생체 외 문화 전략

Oocyte 냉동 보존은 후구형 여성의 불임 보존을위한 금 본위제로 여러 국제 과학 사회에 의해 인식된다. 적절한 임상 및 실험실 전략은 불임 보존 치료의 효능, 효율성 및 안전을 최대한 보장합니다.

오키테 바이트로피화를 통한 불임 보존: 임상 및 실험실 관점

널리 사용되는 느린 동결 프로토콜에 대한 대안적인 냉동 보존 방법으로서 난소 조직의 유리화를 위한 프로토콜이 제시됩니다.

난소 피질 조직의 유리화(vitrification of the glassy state of aggation)

여기에서는 홈메이드 주걱으로 구성되고 홈메이드 솔루션을 활용하여 마우스와 양의 착상 전 배아를 유리화하기 위한 Spatula Montevideo 프로토콜을 제시합니다. 배아는 농도가 증가하는 두 개의 동결 보호 용액에서 빠르게 평형을 이루고, 주걱에 적재되고, 액체 질소에 담근 다음, 최종적으로 0.5mL 빨대로 밀봉됩니다.

포유류 배아의 유리화를 위한 주걱 몬테비데오 장치

이 프로토콜은 IVF 절차에서 난포액, 체세포 및 미성숙 난모세포를 분리하고 처리하여 고품질 분자 및 세포 분석을 가능하게 하는 표준화된 방법을 간략하게 설명합니다. 이러한 접근 방식은 일반적으로 임상 치료에서 폐기되는 재료를 사용하여 생식력, 생식 노화 및 난소 기능 장애에 대한 중개 연구를 지원합니다.

체외 수정을 받는 개인의 인간 난포액, 난포 체세포 및 미성숙 난모세포 수집

Xenopus laevis 미성숙 난모세포를 조작하는 방법, 난자에서 난자로의 체외 성숙 및 세포질 내 정자 주입을 설명합니다. 이 프로토콜은 일부 모계 단백질의 분해와 수정 시 관심 유전자의 과발현을 허용하므로 초기 배아 발달에서 특정 요인의 역할을 연구하는 데 가치가 있습니다.

조작 및<em&gt; 체외</em의&gt; 성숙<em&gt; 아프리카 발톱 개구리 laevis의</em세포질 내 정자 주입에 이어&gt; 난 모세포, 배아 발달을 연구하는

자기 갱신 성인 쥐의 췌장으로부터 분리 전구 세포의 분화를 검출하는 시험 관내 콜로니 검정 고안되어있다. 이러한 분석에서, 췌장 전구 세포가 메틸 - 함유 반고체 배지에서 3 차원 공간에서 세포 콜로니를 야기. 단일 세포와 개별 식민지의 특성을 처리하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다.

체외 식민지 분석 실험에서 트라이 강력한 전구 세포를 특성화를위한 성인 쥐 췌장에서 분리

배우세요 양의 성인 및 프레우버탈 난소에서 채취한 난자의 유리화 및 체외 성숙 프로토콜. 이 방법은 생식 생물학 및 동물 생명공학 연구에 활용됩니다.

양에서 성인 및 프레우버탈 난소에서 채취한 생체외 성숙 난소의 진동

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