애기장대 및 기타 식물의 흰가루병 감염 표현형을 정확하게 평가하기 위한 쉽고 유연한 접종 방법
2021년 3월 9일
우리는 ~ 50 μm 메쉬가있는 접종 상자와 투명한 플라스틱 챔버로 구성된 간단한 포자 분배 시스템을 구성하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이것은 식물에 흰가루병 포자를 고르게 접종하는 데 사용할 수 있으므로 연구 중인 식물의 질병 표현형을 정확하고 재현 가능하게 평가할 수 있습니다.
흰가루병은 중요한 식물 질병입니다. 질병 표현형을 정확하게 결정하려면 병원균의 접종이 필요합니다. 기존 방법은 비효율적이기 때문에이 프로토콜을 개발했습니다.
우리의 포자 접종 방법은 쉽게 접종을 할 수 있으며 간단하고 확장 가능합니다. 따라서 흰가루병을 다루는 모든 실험실에서이 방법을 쉽게 사용할 수 있습니다. 연구원들은 또한 골판지 상자 위에 메쉬를 장착하여 포자 접종에 사용할 수 있습니다.
포자를 제거하고 메쉬를 통해 솔질하는 방법은 중요한 단계입니다. 따라서 이것을 비디오로 시연하면 매우 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 경우 50마이크로미터 나일론 멤브레인 메쉬 또는 48마이크로미터 스테인리스 스틸 메쉬 롤을 얻습니다.
접종 상자를 만들기 위해 큰 크기의 중간 밀도 합판을 24.5X10 인치 및 12X10 인치 조각으로 자릅니다. 메쉬로 탈착식 상단 뚜껑을 만들려면 긴 나무 사각형 다웰을 26 인치와 12.75 인치의 두 세트로 자릅니다. 상자 주위에 맞도록 네 조각을 붙이고 못을 박습니다.
아크릴 시트를 가져 와서 8 개의 모서리 클램프를 사용하여 모든 아크릴 시트를 상자에 조립하십시오. 상자의 아크릴 시트 앞면에 7X2 인치 개구부를 자릅니다. 신선한 흰가루병 포자를 접종 물로 준비하려면 섭씨 22도 및 65 % 상대 습도의 성장 챔버에서 깨끗한 애기장대 면역 저하 pad4-1 돌연변이 식물을 6-8 주 동안 재배하십시오.
표준 아파트에서 감염 표현형을 결정하기 위해 식물을 재배하십시오. pad4-1 식물의 하나 또는 절반을 접종하여 충분한 신선한 흰가루병 포자를 만듭니다. 감염된 식물의 신선한 포자를 사용할 수 있으면 감염 테스트를 위해 접종실 내부의 접종 상자로 식물을 옮깁니다.
심하게 감염된 애기장대 잎 15-20 개를 자르고 응축수가 있으면 말리십시오. 한 쌍의 긴 집게로 한 손에 한두 개의 잎을 거꾸로 잡습니다. 그런 다음 양손을 챔버의 개구부에 넣고 가위로 집게의 팔을 부드럽게 치고 접종 상자에 장착 된 메쉬 위의 잎을 천천히 움직입니다.
미세한 팬 블렌더 브러시로 포자를 전체 메쉬 표면을 다른 방향으로 솔질하여 식물에 포자의 균일한 분포를 최대화합니다. 브러시로 메쉬를 몇 번 가볍게 두드려 메쉬에 붙어있는 포자를 털어냅니다. 포자가 침전되면 접종 상자에서 접종 된 식물이 들어있는 평평한 곳으로 옮깁니다.
플라스틱 돔으로 플랫을 덮고 섭씨 22도 및 65 % 상대 습도의 성장 챔버에 놓습니다. 질환 표현형은 접종 후 5 또는 8 내지 12일에 수행될 수 있다. 상자의 상단과 하단을 제거하고 모서리를 테이프로 고정하고 접착제로 상단에 50마이크로미터 메쉬를 장착하여 판지 상자를 접종 상자로 변환합니다.
접종실 내부에 식물이 들어있는 플랫을 옮기고 더 작은 접종 상자를 플랫 위에 놓아 식물을 덮습니다. 그런 다음 포자를 제거하고 닦으십시오. 페트리 접시보다 약간 큰 미니 접종 상자를 만드십시오.
접시를 사용할 때까지 섭씨 4도에서 냉장고에 보관하십시오. 테스트 할 각 식물에 대해 잎자루 바닥에서 하나 또는 두 개의 완전히 확장 된 잎을 자릅니다. 분리 된 잎의 잎자루를 한천 배지에 30도 각도로 삽입하십시오.
접종실 내부의 잎을 접종하고 뚜껑이있는 판을 성장 챔버로 옮깁니다. 감염 표현형을 평가하기 위해 접종 후 4-5일에 잎을 신선한 무균 MS 한천 플레이트로 옮깁니다. 잎을 신선한 한천 배지에 넣기 전에 잎자루의 바닥을 자릅니다.
접종 후 8일 또는 9일에 질병 표현형을 평가합니다. 현미경 분석은 평평한 바닥의 미세한 슬라이드에 포자의 분포를 균일하게 표시했습니다. 광 접종 후 6 개의 다른 위치에 분포 된 계산 된 포자 밀도는 큰 차이를 보이지 않았다.
포자를 많이 접종 한 후에도 비슷한 결과가 나타났습니다. 접종 균등성은 무거운 접종 후 12 일에 다른 식물 유전자형간에 검사되었습니다. pad4-1 식물은 야생형 식물인 콜롬비아 0에 비해 향상된 질병 감수성을 보였다.
취약한 식물에 접종 후 약 10 일 후에 생성 된 적절한 신선한 포자를 사용하는 것이 중요한데, 이는 신선한 포자가 제거되기 쉽고 식민지화를 확립 할 가능성이 더 높기 때문입니다. 흰가루병은 식물 표피 세포 만 식민지화합니다. 표피 박리 또는 레이저 미세 해부를 통한 흰가루병 감염 세포의 분리는 숙주 반응에 대한보다 표적화 된 전사체 및 단백질체 연구를 가능하게합니다.
이 방법은 연구자가 분말 곰팡이 감염 표현형을보다 효율적으로 결정하는 데 도움이되므로 식물 흰가루병 상호 작용에 대한보다 효과적인 기능 연구를 촉진해야합니다.
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개요
본 논문은 생물영양성 곰팡이 병원균인 흰가루병에 감염된 Arabidopsis 식물의 질병 표현형 분석을 위한 안전하고 효율적이며 재현 가능한 시스템을 제시합니다. 본 프로토콜은 균일한 접종과 정확한 질병 표현형 평가를 달성하는 과정의 어려움을 해결하며, 식물-병원균 상호작용 연구의 성과를 높이기 위해 특수 접종 장비를 제작하고 사용하는 상세한 단계를 제공합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 식물 병리학
- 식물-미생물 상호작용
- 실험 식물 생물학
배경
- 흰가루병은 Arabidopsis를 포함한 식물에 영향을 미치는 주요 진균성 질병입니다.
- 정확한 질병 표현형 분석은 식물 면역력과 진균의 병원성을 이해하는 데 필수적입니다.
- 기존의 접종 방법은 종종 포자 분포가 불균일하게 나타나 재현성을 제한합니다.
- 흰가루병과 같은 생물영양성 병원균은 배양이 어려워 표현형 분석 작업을 복잡하게 만듭니다.
연구 목적
- 흰가루병 포자를 Arabidopsis에 균일하게 접종하기 위한 간단하고 확장 가능하며 비용 효율적인 시스템을 개발한다.
- 식물-곰팡이 상호작용 연구에서 질병 표현형 분석의 정확성과 재현성을 향상시킨다.
- 접종 시스템의 구축 및 사용을 위한 상세한 프로토콜과 시연을 제공한다.
사용된 방법
- 탈착 가능한 메쉬 덮개(50 μm 나일론 또는 48 μm 스테인리스 스틸 메쉬)가 있는 나무 재질의 접종 박스 제작.
- 포자 유출을 최소화하기 위해 전면에 작은 개구부가 있는 투명 아크릴 접종 챔버 사용.
- 감염된 pad4-1 Arabidopsis 식물로부터 신선한 흰가루병 포자 준비.
- 메쉬를 통해 포자를 붓으로 쓸어내거나 가볍게 두드려 식물 또는 분리된 잎에 고르게 분포시킴.
- 접종 후 여러 시점에서 감염 표현형 평가.
주요 결과
- 이 프로토콜은 식물 트레이와 분리된 잎 전체에 흰가루병 포자를 균일하고 재현성 있게 분포시킬 수 있게 합니다.
- 현미경 분석 결과, 저농도 및 고농도 접종 모두에서 여러 위치의 포자 밀도가 균일함이 확인되었습니다.
- pad4-1 돌연변이 식물은 야생형 대조군에 비해 질병 감수성이 증가한 것으로 나타났습니다.
- 신선한 포자(접종 후 약 10일 뒤 생성)가 군락 형성 및 표현형 분석에 더 효과적이었습니다.
결론
- 이 시스템은 Arabidopsis-흰가루병 연구에서 균일한 접종과 정확한 질병 표현형 분석을 위한 신뢰할 수 있고 접근 가능한 방법을 제공합니다.
- 이 접근 방식은 적응성이 높고 비용이 저렴하여 다양한 실험실에서 사용하기에 적합합니다.
- 개선된 표현형 분석은 식물 면역 및 병원균 상호작용의 기능적 연구를 촉진할 것입니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
정확하고 재현 가능한 질병 표현형 분석은 식물-병원균 연구의 결정적인 병목 지점으로, 표적 검증 및 기능 연구의 예측 신뢰도에 직접적인 영향을 미칩니다. 이 유연한 접종 시스템은 흰가루병 감염을 위해 표준화되고 균일한 포자 전달을 가능하게 하여, 초기 발견 파이프라인에서의 강력한 가설 검증과 기전적 리스크 제거를 지원합니다. 본 시스템의 적응성과 확장성은 중개 식물 면역 연구 및 작물 보호 R&D를 위한 재사용 가능한 역량으로서 가치가 있습니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 균일한 병원균 접종을 보장함으로써 식물 면역 경로에 대한 엄격한 분석을 가능하게 합니다.
- 재현 가능한 감염 표현형 분석을 통해 유전적 표적의 기능적 검증을 지원합니다.
- 질병 판독 값의 가변성을 최소화하여 기전 분석의 리스크를 줄여줍니다.
- 후속 포트폴리오 선별 결정에 대한 예측 신뢰도를 향상시킵니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 높은 신뢰도의 스크리닝 워크플로우를 위해 검증된 식물-병원균 시스템을 준비합니다.
- 접종 조건을 표준화하여 분석의 재현성과 비교 가능성을 높입니다.
- 신뢰할 수 있는 화합물 평가를 위해 정량적이고 공간적으로 균일한 감염 결과를 제공합니다.
- 연구 팀 전반에 걸쳐 확장 가능하고 비용 효율적인 분석 배치를 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 표형 분석 결과와 질병 관련 식물 모델을 정렬하여 중개 연구의 연속성을 확보합니다.
- 강력한 감염 데이터를 바탕으로 후보 유전자 또는 치료제의 위험 조정된 진전을 지원합니다.
- 숙주-병원체 상호작용에 대한 표적 전사체 및 단백질체 연구를 위한 플랫폼을 제공합니다.
- 초기 단계의 데이터 품질을 향상시켜 후기 단계의 생물학적 위험을 감소시킵니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
이 접종 방법은 식물 병해 연구 파이프라인의 초기 발견 단계부터 리드 화합물 확인 및 전임상 검증 단계까지 원활하게 통합됩니다.
- 발견 생물학: 식물 면역 및 병원체 독성 기전에 대한 가설 기반 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 분석 준비 및 화합물 스크리닝을 위해 재현 가능하고 정량적인 감염 표현형을 제공합니다.
- 분석: 유전자형 및 처리 조건 간의 강력한 통계적 비교를 가능하게 하는 균일한 판독값을 제공합니다.
- 중개 연구: 발견 단계의 표현형 분석과 질병 관련 시스템에서의 전임상 검증 사이의 연속성을 유지합니다.
- 기업적 재사용: 다양한 식물-병원체 연구에서 반복적으로 사용할 수 있는 저비용의 적응형 플랫폼을 제공합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 식물-병원체 연구에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 감염 분석의 표준화, 재현성 및 확장성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 초기 단계 데이터 품질을 개선함으로써 더 나은 추진/중단(go/no-go) 결정과 자본 효율성을 가능하게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 유전적 또는 화학적 리드 물질의 위험 조정 우선순위 선정 및 진전을 지원합니다.
구현 시 고려 사항
- 식물 병리학 및 표현형 분석에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- 박스 및 챔버 조립과 제어된 성장 조건을 위한 기본적인 실험실 인프라가 필요합니다.
- 접종 및 표현형 분석 프로토콜에 대한 팀 간 표준화가 요구됩니다.
- 메쉬 및 챔버 수정을 통해 다양한 식물 종과 병원균 시스템에 적용 가능합니다.
- 최적의 감염 일관성을 위해 신선하고 생존 가능한 포자의 가용성에 의존합니다.
바이오제약 FAQ
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:42
Making a Standard Inoculation Box with a Removable Top Lid Mounted with a Mesh
1:17
Making an Inoculation Chamber and Inoculating Plants in Flats
3:13
Inoculate Plants with Smaller Inoculation Boxes
3:42
Inoculate Detached Leaves in Petri Dishes
4:37
Results: Assessment of Inoculation Evenness
5:19
Conclusion
