Name: 급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 49 s
Description: 학습하세요 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 이용한 급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학 분석 방법을. 이 기술은 조직 구조를 보존하며 세포 간 연결과 기능적 상호작용을 고해상도로 연구할 수 있어 당뇨병 등 췌장 관련 질환의 이해에 기여합니다.

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이 연구에서 발표 된 연구는 슬로베니아 연구 기관 (연구 핵심 자금 조달 번호)에 의해 재정적으로 지원되었습니다. P3-0396 및 I0-0029 및 연구 프로젝트 번호. J3-9289, N3-0048 및 N3-0133) 및 오스트리아 과학 기금 / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (양자 보조금 I3562--B27 및 I4319--B30). 우수한 기술 지원을 위해 Maruša Rošer, Maša Čater 및 Rudi Mlakar에게 감사드립니다.

저자들은 상업적 또는 재정적 이익이없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.

포유류 췌장은 큰 외분비 및 내분비선입니다. 외분비 부분은 전체 췌장 부피의 96-99 %를 차지하며 acini와 덕트로 구성됩니다. 내분비 부분은 전체 췌장 부피의 나머지 1-4 %를 차지하는 랑게르한의 많은 섬으로 구성됩니다1. 외분비 부분은 음식에서 에너지가 풍부한 폴리머를 분해하는 주요 소화 효소뿐만 아니라 다른 위장 분비물과 결합하여 효소의 작용에 적합한 환경을 제공하는 중탄산염이 풍부한 유체를 분비합니다. 내분비 부분은 식후 분배, 저장 및 에너지가 풍부한 영양소의 식간 방출을 조절하는 호르몬을 분비합니다. 외분비 조직은 상대적으로 저개발되고 내분비는 출생시 비교적 잘 발달되어 있지만, 전자는 이유식 2,3,4시 후자를 빠르게 자랍니다. 췌장 기능에 대한 초기 연구는 현대 생리학의 탄생을 표시했으며,이 분야의 주요 방법론 적 발전은 주요 과학적 파쇄기5로 이어졌습니다. 췌장과 함께 일하는 것은 땀샘의 복잡한 구조로 인해 기술적으로 도전적이지만 공중 보건에 큰 위협이되는 췌장암, 췌장염 및 당뇨병과 같은 질병으로 인해 큰 동기가되고 새로운 치료 접근법이 필요합니다.
분리된 췌도6, 아시니7,8 및 덕트 단편은 세포주 및 일차 분산된 내분비, 아시나, 및 덕트 세포(9,10)와 비교하여 그들의 장점 때문에 수십 년 동안 금 표준 방법으로 개발되고 사용되었다. 분리된 세포 집단의 현저하게 개선된 기능에도 불구하고, 이러한 방법들은 여전히 상당한 기계적 및 효소적 스트레스를 수반하고, 세포를 주변 조직으로부터 분리시키고, 따라서 파라크린 상호작용 및 기계적 지지가 부족하며, 가장 중요한 것은 정상 생리학에 대한 현저한 변화를 수반한다11,12,13 . 급성 마우스 췌장 조직 슬라이스는 2001년에 개발되어 세포간 접촉, 파라크린 상호작용, 중간엽 및 조직 구조를 보존한 뇌, 뇌하수체 및 부신 절편과 유사한 실험 플랫폼을 개발해야 할 필요성이 인식되었으며, 그 당시의 췌도 연구에서 황금 표준 방법의 가장 중요한 단점 중 일부도 없이 분리된 섬(12)을 개발했으며, 14. 이러한 단점 중에는 최외곽층의 손상, 핵심 섬 영역의 접근성 부족, 세포 정체성 및 생리학에 중요한 영향을 미칠 수있는 재배의 필요성12,15이 있습니다. 또한, 조직 슬라이스 방법은 섬을 분리하는 것이 불가능하거나 전통적인 격리 16,17,18,19,20,21에 의해 췌도 수율이 매우 낮은 경우 심하게 변형 된 섬 구조를 가진 동물 모델에 대한 연구를 가능하게합니다.
또한이 슬라이스는 당뇨병과 췌장염의 발달 과정에서 형태 학적 변화를 연구하는 데 더 적합합니다 (예 : 전체 조직에 대한 더 나은 개요를 가능하게하고 지역 차이를 연구하는 것과 호환되기 때문입니다). 중요하게도, 내분비 부분에 대한 초기 초점에도 불구하고, 조직 슬라이스 방법은 본질적으로 외분비 성분 9,22,23의 연구를 가능하게 한다. 도입 후 첫 10 년 동안이 방법은 베타 14,24,25,26,27,28,29 및 알파 30,31 세포의 전기 생리학 연구뿐만 아니라 췌장의 형태 학적 및 기능적 성숙을 조사하기 위해 사용되었습니다 2,3 . 10년 후인 2013년에, 이 방법은 CLSM을 사용하여 포도당 32에 대한 그들의 반응, 그들의 기능적 연결 패턴(33), 형광 칼슘 염료와 막 전위 염료(34)를 조합함으로써 막 전위와 세포내 칼슘 사이의 관계를 특성화하기 위해 CLSM을 사용하는 췌도 세포의 살아있는 세포 칼슘 이미징에 성공적으로 적응되었다. 같은 해 후반에, 이 방법은 또한 acinar 세포22,35에서 칼슘 역학을 평가하기 위해 사용되었다. 그 후 몇 년 동안, 췌장 조직 조각은 다수의 상이한 연구에 사용되어 왔으며 돼지 및 인간 조직9,36,37,38,39,40,41에 성공적으로 적응되었다. 그러나, 종합하면, 칼슘 이미징-마우스 췌장 조직 절편에서 일반적으로 및 특히 섬에서-이 그룹에 의해 여전히 대부분 수행된다. 이것의 주된 이유 중 하나는 기술적으로 까다로운 조직 조각 준비, 공초점 현미경의 필요성 및 다소 복잡한 데이터 분석의 조합에 있습니다. 본 논문의 주요 목표는이 강력한 방법을 다른 잠재적 인 사용자가보다 쉽게 접근 할 수있게하는 것입니다.
조직 슬라이스 준비 및 구조 및 분비 연구를위한 슬라이스 사용에 대해 자세히 다루는 우수한 방법론 적 기사가 이미 있지만 공초점 칼슘 이미징 9,42,43에는 적용되지 않습니다. 따라서이 백서에서는 슬라이스를 준비하는 동안 몇 가지 추가 팁과 트릭, 성공적인 염료 로딩, 이미지 획득에 중요한 단계 및 기본 칼슘 데이터 분석의 주요 단계에 중점을 둡니다. 따라서, 이러한 기여는 상기 언급된 방법에 대한 대안이라기보다는 상호보완적인 것으로 간주되어야 한다. 유사하게, 마우스 췌장 조직 조각에서의 칼슘 영상화는 특정 질문에 답하기 위해 사용되는 실험적 접근법으로 간주되어야 하며, 따라서 분리된 덕트 또는 아시니, 단리된 섬, 오가노이드, 눈의 전방 챔버에 이식된 섬과 같은 췌장 생리학에서 다른 칼슘 이미징 접근법에 대한 절대적인 대안이라기보다는 상보적이며, 및 생체내 기록 11,44,45,46,47,48. 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 이미징의 약속은 아마도 연막세포(49) 및 대식세포(50)와 같은 췌도 중간엽 세포뿐만 아니라 덕트 세포(23)에서의 칼슘 역학의 최근 성공적인 기록에 의해 가장 잘 설명될 것이다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td><td>KERN & SOHN GmbH</td><td>ALJ 160-4A</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 Leica TCS SP5 II 직립 설정</td><td>Leica</td><td>5100001578</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경 Leica TCS SP5 AOBS 탠덤 II 설정</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>코르크 패드 15 cm x 15 cm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Merck KGaA, 다름슈타트, 독일</td><td>CLS430790</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; 뚜껑이 있는 원형 얼음 양동이, 4 L</td><td>Fischer Scientific, 레스터셔, 영국</td><td>432124</td><td></td></tr><tr><td>양날 면도날</td><td>Personna, 미국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Fine Forceps</td><td>FST, 독일</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>0030 121.023</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer 플라스크 200 mL</td><td>IsoLab, 독일</td><td>027.01.100</td><td></td></tr><tr><td>파인 가위 - ToughCut</td><td>FST, 독일</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>플랫 오비탈 쉐이커&nbsp; IKA KS 260 기본</td><td>IKA</td><td>Ident. 번호: 0002980200</td><td></td></tr><tr><td>Glass lab bottle 1000 mL</td><td>IsoLab, Germany</td><td>091.01.901</td><td></td></tr><tr><td>Hartman Hemostat, curved</td><td>FST, Germany</td><td>13003-10</td><td></td></tr><tr><td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td><td>Leica</td><td>15507701</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinder 25 mL</td><td>IsoLab, Germany</td><td>015.01.025</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator Control box SM-7, 키패드 SM-7</td><td>Luigs & 노이만</td><td>&nbsp; 200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td><td></td></tr><tr><td>전자 레인지 owen</td><td>Gorenje, 슬로베니아</td><td>MO20MW</td><td></td></tr><tr><td>삼투압계 Gonotec 010</td><td>Gonotec, 베를린, 독일</td><td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td><td></td></tr><tr><td>페인트 브러시</td><td>Faber-Castell, No.2</td><td></td><td>모든 얇고 부드러운 원형 페인트 브러시 No.2, 바람직하게는 검은 색</td></tr><tr><td>종이 타월</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perifusion 펌프</td><td>Ismatec</td><td>ISM 827</td><td>Reglo 아날로그 MS - 4/8</td></tr><tr><td>페트리 접시 100/20 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 35/10 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 35 x 10 mm Nunclon Delta</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>153066</td><td>NON-STICKY for agarose blocks</td></tr><tr><td>pH meter inoLab pH Level 1</td><td>WTW, Weilheim, Germany</td><td>E163694</td><td></td></tr><tr><td>피펫 1000 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3121 000.120</td><td></td></tr><tr><td>피펫 50 mL</td><td>Eppendorf</td><td>3121 000.066</td><td></td></tr><tr><td>푸시 핀 23 mm</td><td>Deli, Ningbo, China</td><td>E0021</td><td></td></tr><tr><td>Screw cap tube, 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Semken Forceps</td><td>FST, Germany</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer 플라스크용 안정화 링</td><td>IsoLab, 독일</td><td>027.11.048</td><td></td></tr><tr><td>실체현미경 Nikon SMZ 745</td><td>Nikon, Melville, NY USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>주사기 Injekt Solo 5</td><td>mL Braun, Melsungen, Germany</td><td>4606051V</td><td></td></tr><tr><td>주사기 바늘 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2")</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>4656300</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절기</td><td>Luigs & Neumann</td><td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td><td>슬라이스 미니 챔버, 온도 조절기 TC 07</td></tr><tr><td>perifusion 시스템용 튜빙</td><td>Ismatec</td><td>SC0310</td><td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td></tr><tr><td>초음파 수조 스튜디오 GT-7810A</td><td>Globaltronics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td><td>Leica, Nussloch, Germany</td><td>14047235613</td><td></td></tr><tr><td>Volumetric 플라스크 1000 mL</td><td>IsoLab, 독일</td><td>013.01.910</td><td></td></tr><tr><td>Vortex 믹서 Neolab 7-2020</td><td>Neolab</td><td>&nbsp; 7-2020</td><td></td></tr><tr><td>수조 Thermo Haake 노천탕 순환기</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Z527912</td><td></td></tr><tr><td>Material/Reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td><td>Sigma Aldrich, 독일</td><td>C5080-500G</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-포도</td>당 <td>Sigma Aldrich, 독일</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>D4540-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DL-젖산</td><td>시그마 알드리치, 독일</td><td>L1250-500ML</td><td></td></tr><tr><td>둘베코 s 인산염 완충 식염</td>수 <td>Merck KGaA, 다름슈타트, 독일</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>기압에서 95% O<2 및 5% COsub>2를 포함하는 가스 혼합물</td> 접착제 Wekem sekundenkleber WK-110 Wekem GmbH, Bergkamen, Germany WK 110-020 HEPES Sigma Aldrich, Germany H3375-250G L-(+)-<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 아스코르브산</td><td>Sigma Aldrich, 독일</td><td>A9,290-2</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 생존력/세포 독성 키트, 포유류 세포용</td><td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물 - MgCl2.2H2O</td><td>Sigma Aldrich, 독일</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td>Sigma Aldrich, 독일</td><td>I5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td><td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td><td>O6807</td><td>세포 투과성 Ca2+ 지시자(여기/방출: 495/523 nm)</td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (DMSO의 20% 용액)</td><td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td><td>P3000MP</td><td>폴락사머: 비이온성 삼중블록 공중합체</td></tr><tr><td>염화칼륨 - KCl</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque GTG agarose</td><td>Lonza, Rockland, 미국</td><td>50111</td><td></td></tr><tr><td>중탄산나트륨 - NaHCO3</td><td>Honeywell, Germany</td><td>31437-500G</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 - NaCl</td><td>Honeywell, 독일</td><td>31434-1KG</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨 - NaOH</td><td>Sigma Aldrich, 독일</td><td>30620</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 - NaH2PO4</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>S0751-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate</td><td>Sigma Aldrich, Germany</td><td>15990-100G</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FIJI</td><td></td><td></td><td>FIJI는 오픈 소스 프로젝트입니다</td></tr><tr>.<td>LASAF</td><td>Leica microsystems, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>, Mathworks,</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Python</td>, <td>Python Software Foundation</td><td></td>, <td>Python은 오픈 소스 프로젝트입니다.</td></tr></tbody></table>

급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

급성 마우스 췌장 조직 슬라이스는 전형적인 시험관내 연구에서 기술된 단리된 섬, 아시니, 덕트 또는 분산된 세포보다 훨씬 적은 제제-유도된 변화를 수반하는 보존된 세포간 통신 및 조직 구조를 갖는 독특한 계내 제제이다. 공초점 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)에서 급성 췌장 조직 조각과 라이브 세포 칼슘 이미징을 결합함으로써 칼슘 신호는 단일 세포 또는 심지어 세포 내 분해능으로 많은 수의 내분비 및 외분비 세포에서 동시에 연구 될 수 있습니다. 민감도는 변화의 검출을 허용하고 세포 간 파동 및 기능적 연결성에 대한 연구뿐만 아니라 다른 세포와의 췌도 및 파라크린 관계 내에서 국소화에 대한 세포의 생리적 반응의 의존성에 대한 연구를 가능하게합니다. 마지막으로, 동물 복지의 관점에서 볼 때, 한 번에 많은 수의 세포로부터의 신호를 기록하면 실험에 필요한 동물의 수가 줄어들어 3R 대체, 감소 및 정제 원칙에 기여합니다.

췌장 덕트에 아가로스 용액을 주입하는 것은 췌장 조직 슬라이스 준비에서 가장 중요한 단계입니다. 성공적인 주사는 도 3A의 왼쪽에서 볼 수 있듯이 췌장 조직의 미백에 의해 인식 될 수 있으며, 불완전하게 주입 된 췌장 부분은 도 3A의 오른쪽에 제시됩니다. 랑게르한스의 섬은 육안 또는 입체 현미경으로 인식 할 수 있으며, 이는 아가로스 블록에 후속 임베딩을 위해 췌장의 적절한 부분을 절단하는 데 도움이됩니다 (그림 3B). 갓 자른 마우스 췌장 조직 슬라이스에서, 랑게르한스의 섬은 입체현미경 하에서 흰 반점(그림 3C) 또는 광현미경 하에서 갈색을 띤 구조로서 주위의 외분비 조직 및 중간엽과 쉽게 구별될 수 있다(도 3D). 췌장 조직 슬라이스는 슬라이스 후 적어도 12 h 동안 별개의 유형의 실험에 사용될 수 있다. 입체현미경, 광현미경 및 칼슘 영상화 동안의 세포의 기능적 반응에 의한 총체적 형태학적 평가 이외에도, 췌장 조직 절편의 생존력을 평가할 수 있다(도 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> 그림 4: 조직 슬라이스 내 세포의 생존력. 세포의 생존력은 라이브/데드 분석으로 결정하였다. 살아있는 세포는 Calcein AM (녹색으로 표시)으로 염색되는 반면, 죽은 세포는 에티듐 호모다이머-1 (빨간색으로 표시)으로 염색됩니다. 노란색 선은 아래쪽과 오른쪽에 표시되는 Z 스택의 X-Y 횡단면의 위치를 나타냅니다. Z-스택의 전체 깊이는 88μm입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
칼슘 이미징 실험의 경우, 형광 칼슘 표시기는 몇 층의 세포를 관통해야합니다. 도 5A는 개별 췌도 및 acinar 세포가 인식될 수 있는 췌장 조직 슬라이스 내로의 세포 투과성Ca2+ 지시자 염료의 성공적인 로딩을 제시한다. 대조적으로, 도 5B-D의 절편은 염료의 실패한 침투 (도 5B), 췌도 세포의 부족 (도 5C), 및 표면에 많은 괴사 조직 (도 5D)으로 인해 최적이 아니다. 이러한 슬라이스는 폐기되거나, 더 잘 절단되거나 염색된 추가 섬이 있는지 확인하거나(문제 해결을 위해 표 1 참조), 외분비 세포의 반응을 기록하는 데 사용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> 도 5: 사용 가능한 및 사용할 수 없는 제제의 예 . (A) 랑게르한스의 섬에서 잘 염색된 세포뿐만 아니라 덕트 세포 및 주변 아시나 조직으로 췌장 조직 조각의 성공적인 제조의 예. (b) 잘 염색되지 않은 조직 슬라이스의 예. (C) 구조적 단종을 가진 랑게르한스 섬의 예. (D) 많은 죽은 세포와 많은 파편을 포함하는 랑게르한스 섬의 예. 오른쪽의 "광선 오버, 광선 아래" 조회 테이블은 녹색으로 0 강도를, 파란색으로 채도를 표시합니다. 배율 막대 = 100μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
세포 투과성Ca2+ 지시약 염료를 이용한 칼슘 이미징의 대표적인 결과는 도 6에 나타내었다. 도 6A에서, 랑게르한스의 섬, acinar 조직, 및 췌장관을 함유하는 췌장 조직 슬라이스의 고해상도 이미지가 제시된다. 더 나은 구별을 위해, 도 6A 에 제시된 췌장 조직 절편의 내분비, 외분비 및 덕트 부분은 도 6B에서 착색된다. 적절한 자극을 사용하여 상이한 췌도 세포, 또는 췌도 세포와 비췌도 세포(51)를 기능적으로 구별할 수 있다. 베타 세포는 전형적으로 [Ca2+]IC 의 일시적인 증가와 함께 글루코스에 의한 사각 펄스 자극에 반응하고, 이어서 지속된 고원 상에서 빠른 칼슘 진동에 반응할 것이다(도 6C, 상부 패널).
모든 베타 세포가 단 일의 큰 기능적 동기로 결합됨에 따라, 이러한 진동은 또한 확산 [Ca2+]IC 파 동32,34,52,53,54를 통해 서로 다른 세포들 사이에서 매우 잘 동기화된다(도 7C). 5-15분의 기간을 갖는 느린 [Ca2+]IC 진동은 빠른 진동의 기초가 될 수도 있고, 심지어 레폰스(55,56)의 우세한 유형일 수도 있다. 동일한 간단한 프로토콜은 특히 섬의 주변에서 다른 유형의 반응을 나타낼 수 있습니다 (그림 6C, 하단 패널). 이들 세포는 베타 세포와 동기화되지 않고 낮은 글루코스 조건에서 또는 활성의 감소와 함께 이미 존재하는 더 빠르고 불규칙한 진동으로 반응하기 때문에, 그러한 반응은 베타가 아닌 세포21,32,57,58을 매우 암시한다. 그러나, 이들의 결정적인 기능적 특성화는 추가적인 자극 단계 또는 대안적인 접근법을 갖는 더 복잡한 프로토콜을 필요로 하며, 이는 아래에서 논의된다. acinar 및 ductal 세포의 전형적인 반응은 각각 도 6D 및 도 6E에 제시된다. acinar 및 ductal cells 22,23,35에 대한 자세한 내용은 문헌을 참조하십시오.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> 도 6: 뚜렷한 유형의 췌장 세포에서 칼슘 역학의 대표적인 결과 . (A) 주변 조직을 가진 랑게르한스 섬의 고해상도 이미지. 스케일 바 = 100 μm. (B) 노란색으로 표시된 아시나 조직을 갖는 췌장 조직의 뚜렷한 부분, 적색으로 표시된 랑게르한스의 섬, 및 청색으로 표시된 덕트 트리의 세그먼트를 묘사한다. 스케일 바 = 100 μm. (C) 12 mM 글루코스로 자극하는 동안 베타 및 추정성 비베타 세포에서 칼슘 역학의 전형적인 흔적; 3 mM 글루코스는 비자극성 조건을 사용하였다. 비베타 세포의 보다 구체적인 차별을 위해 사용될 수 있는 프로토콜은 토론 섹션에 기재되어 있다. (d) 25 nM 아세틸콜린에 의해 자극된 아시나 세포의 칼슘 역학의 전형적인 흔적. (e) 1 mM 케노데옥시콜산에 의해 자극된 덕트 세포의 칼슘 역학의 전형적인 흔적. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
성공적인 칼슘 이미징 후, 데이터는 먼저 프로토콜 섹션에 설명된 대로 지수 및 선형 적합도의 조합에 의해 표백을 위해 내보내지고 수정됩니다. 표백 보정 전후의 시계열이 그림 7A에 나와 있습니다. 그 후, 반응의 활성화 및 비활성화 단계 뿐만 아니라 고원층에서의 몇몇 파라미터가 분석될 수 있다. 자극 후 [Ca2+]IC 증가의 발병 지연은 도 7B의 지연A 및 개별 세포들 사이의 지연에서의 이질성(지연A1)으로 표현되는 것으로 측정될 수 있다. 동일한 파라미터들(지연D 및 지연D1)이 비활성화 단계를 기술하는데 사용될 수 있다. 초기 과도 [Ca2+]IC 증가에 이어서, 췌도에서 대부분의 췌장 베타 세포에서 고원상은 비교적 규칙적인 고주파 [Ca2+]IC 진동을 특징으로 한다. 고원상은 고전적인 기능적 파라미터를 분석함으로써 설명될 수 있다. [Ca2+]IC 진동 지속 시간, 주파수 및 활성 시간의 백분율의 개략적인 프리젠테이션이 도 7C에 제시되어 있다. 획득률이 10Hz보다 높은 칼슘 이미징에서는 췌도를 가로질러 반복적으로 퍼지는 칼슘파를 명확하게 인식할 수 있습니다(그림 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> 그림 7: 시계열 데이터 분석 . (A) 광표백을 위한 시계열 데이터의 보정. (b) 자극 후 활성화 및 12 mM 글루코스로 자극의 중단 후 비활성화까지의 지연의 분석. 자극의 지속 시간은 이미지에서 밝은 회색, 음영 처리 막대로 표시됩니다. (C) 고원 위상의 여러 파라미터 분석: I) 절반 높이에서 결정된 진동의 지속기간, II) 인터-발진 간격에 의해 결정된 진동의 주파수. III) 진동의 주파수와 지속 시간의 곱으로서의 활성 시간. I-IV) 단일 세포가 진동의 절반 높이에 도달하는 시간의 지연 (Δt)에 의해 결정되는 랑게르한스 섬을 가로 질러 확산되는 진동의 주어진 파동에서 진동 사이의 지연. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 급성 췌장 조직 조각의 준비와 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사에서의 사용을 제시하여 많은 수의 살아있는 세포, 오랜 기간 동안 그리고 높은 시공간 분해능으로 칼슘 역학을 동시에 연구합니다.

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

살아있는 세포 칼슘 영상과 함께, 급성 췌장 조직 슬라이스 기술은 장기간에 걸쳐 높은 해상도로 세포 간 파동 및 다세포 기능 연결성에 대한 연구를 가능하게합니다. 이 기술의 주요 장점은 조직이 빠르고, 조직 구조를 보존하며, 조직의 높은 수율을 유지하면서 제한된 효소 및 기계적 스트레스를 감소시킨다는 것입니다. 질병 진행 중 기능적 및 형태 학적 변화를 감지함으로써이 기술은 당뇨병과 같은 췌장 관련 질병에 대한 우리의 이해를 돕습니다.이 조직 슬라이스 기술은 세포 간 접촉, 파라크린 상호 작용 및 조직 구조의 보존에 중점을두고 뇌, 뇌하수체 및 부신 조직에 적용 할 수 있습니다. 마우스 췌장에 아가로스를 주사 할 준비를하려면 섭씨 40 도의 액체 아가로오스로 다섯 밀리리터 주사기를 채우고 주사기에 30 게이지 바늘을 장착하십시오. 바늘을 뚜껑으로 조심스럽게 덮은 후 주사기 바늘 끝을 물 표면 아래에 아가로오스 전체 부피와 함께 섭씨 40도 수조에 놓습니다.기압과 실온에서 분당 1.5 밀리리터로 지속적으로 얼음 위에 카르보겐으로 세포 외 용액 한 병을 버블링하여 산소화와 7.4의 pH를 보장합니다. 아가로스 주사를 수행하기 위해 안락사성인 마우스를 스테레오 현미경 하에 놓고 개복술을 통해 마우스 복부에 접근한다. 내장을 왼쪽으로 부드럽게 움직여 일반적인 담관을 노출시키고 포셉을 사용하여 덕트의 십이지장 끝을 약간 들어 올려 Vater의 유두를 찾습니다.지혈제를 사용하여 십이지장 유두에서 담관을 고정시켜 덕트에서 십이지장으로 아가로오스가 누출되는 것을 방지하고 작은 날카로운 포셉을 사용하여 일반적인 담관 아래에 도달하여 덕트를 췌장 조직에 부착하는 막을 부수십시오. 덕트에서 가능한 한 많은 지방과 결합 조직을 제거한 후 덕트를 한 쌍의 더 큰 포셉의 팁에 수직으로 놓고 주사기 플런저를 단단히 누르고 점성이있는 액체 아가로스를 일반 담관의 근위 끝에 20 ~ 30 초 동안 주입하십시오. 조직이 희끄무레하고 약간 흩어지면 주사기를 제거하고 거품이 난 얼음처럼 차가운 세포 외 용액 20 밀리리터를 췌장에 천천히 부어 조직을 식히고 아가로스를 경화시킵니다.췌장 조직 조각을 얻기 위해 포셉과 미세한 거친 절단 가위를 사용하여 아가로스 주입 된 췌장을 얼음처럼 차가운 세포 외 용액 40 밀리리터가 들어있는 100 밀리미터 페트리 접시에 부드럽게 옮깁니다. 접시를 소용돌이 치며 조직을 헹구고 췌장을 얼음처럼 차가운 세포 외 용액의 두 번째 접시로 옮깁니다. 포셉과 가위를 사용하여 희끄무레하고 잘 주입 된 췌장 섹션을 최대 여섯 개의 0.1 ~ 0.2 입방 센티미터 조각으로 자르고 조직 조각에서 남아있는 결합 및 지방 조직을 제거하십시오.청소 된 블록을 섭씨 40도 액체 아가로스 약 5 밀리리터가 들어있는 35 밀리미터의 끈적 거리지 않는 바닥 페트리 접시에 넣고 즉시 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 아가로스가 굳어지면 페트리 접시를 100 밀리미터 페트리 접시의 뚜껑 위에 거꾸로 잡고 면도날의 절반을 사용하여 페트리 접시의 횡벽과 아가로스 사이의 여백으로 조심스럽게 잘라 접시에서 아가로스를 제거하십시오. 면도날을 사용하여 각각 하나의 조직 블록을 포함하는 개별 큐브를 해방 된 아가로스에서 자르고 시아 노 아크릴레이트 접착제를 사용하여 블록을 비브라 톰의 샘플 플레이트에 부착하십시오.비브라톰의 절단실을 150 밀리리터의 얼음처럼 차가운 세포외 용액으로 채우고 지속적으로 카르보겐으로 버블링합니다. 스크류는 샘플 플레이트를 진동기에 고정하고 새 면도날을 장착합니다. 챔버를 얼음으로 둘러싸고 여섯 밀리몰 포도당으로 보충 된 세포 외 용액으로 만든 두 개의 10 밀리리터 부피의 얼음 조각을 추가하십시오.슬라이서를 초당 0.05 ~ 1 밀리미터, 70 헤르츠로 설정 한 다음 슬라이싱을 시작하여 20 ~ 100 평방 밀리미터 표면적을 가진 140 미크론 두께의 아가로스 슬라이스를 얻습니다. 미세한 페인트 브러시를 사용하여 각 조각을 6 밀리몰 포도당으로 보충 된 40 밀리미터의 HEPES 버퍼로 채워진 100 밀리미터 페트리 접시로 조심스럽게 옮깁니다. 칼슘 염료 제조를 위해, 50 마이크로그램의 세포 투과성 칼슘 지시약염 염료, 7.5 마이크로리터의 DMSO 및 2.5 마이크로리터의 폴록사머 및 6.667 밀리리터의 HBS를 15 밀리리터 스크류 캡 튜브에 용해시킨다.피펫을 사용하여 튜브를 초음파 욕조 챔버에 잠그고 볼텍싱하기 전에 20 초 동안 용액을 완전히 혼합하고 각각 30 초 동안 볼텍싱하십시오. 그런 다음 생성 된 칼슘 지시약 염료 용액 3.333 밀리리터를 라벨링 할 조직 10 조각 당 하나의 5 밀리리터 페트리 접시에 분취한다. 염료 로딩의 경우, 얇은 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 최대 10 개의 조직 조각을 염료 용액의 각 접시로 옮기고 접시를 실온에서 50 분 동안 오비탈 쉐이커에 놓고 빛으로부터 보호 된 분당 40 회전을 수행하십시오.인큐베이션이 끝나면 최대 20 개의 염색 된 조각을 염료가없는 HBS로 채워진 개별 60 밀리리터 페트리 접시에 옮깁니다. 공초점 현미경에 의한 칼슘 이미징의 경우 20배 또는 25배 배율을 선택하고 획득 모드를 타임랩스 이미징으로 설정하고, 핀홀을 100 내지 200 미크론으로 설정하고, 실험에 사용된 형광단에 대한 여기 및 방출을 한다. 기록 챔버 및 관류 시스템을 현미경의 온도 제어 단계에 장착하고 기록 챔버의 먼 가장자리에 입구와 출구를 배치하십시오.유입 및 유출 속도를 분당 한 밀리리터에서 두 밀리리터로 설정합니다. profusion 시스템의 온도를 섭씨 37도까지 설정하고 비 자극 용액으로 증식을 시작하십시오. 조직의 칼슘 역학을 기록하기 위해 단일 조직 조각을 기록 챔버에 넣고 타우트 나일론 메쉬로 U 자형 백금 중량으로 조직을 고정시킵니다.밝은 필드 옵션을 사용하여 관심 있는 구조를 찾고 라이브 이미징을 사용하여 연구된 구조물을 시야에 배치합니다. 신호 대 잡음비를 최적화하려면 레이저 전력을 최소한으로 유지하면서 레이저 전력, 검출기 증폭 및 라인 평균 비닝을 조정하십시오. 초점면을 절단면 아래 15미크론으로 조정하여 잠재적으로 손상된 셀에서 녹화되지 않도록 하고 이미지를 획득합니다.샘플링 주파수를 하나 내지 두 헤르츠로 설정하여 개별 진동을 초기에 감지하고 고해상도 이미지를 녹화할 수 있습니다. 사용 가능한 경우 온라인 차트를 사용하여 준비 응답, 조명, 광표백 및 기계적 드리프트에 대한 즉각적인 피드백을 얻을 수 있습니다. 모든 이미지를 획득한 경우 나중에 분석할 수 있도록 데이터를 저장합니다.여기에서 세포 투과성 칼슘 지시약염 염료가 췌장 조직 슬라이스에 성공적으로 로딩된 최적의 조직 절편의 예가 관찰될 수 있다. 대조적으로, 이러한 조직 조각은 실패한 염료 침투, 췌도 세포의 부족 또는 샘플 표면의 괴사 조직의 풍부로 인해 이미징에 최적이 아닙니다. 췌장 조직 슬라이스의 고해상도 이미지는 랑게르한스 섬, 아시나 조직 또는 췌장 덕트와 같은 췌장 조직의 별개의 영역을 묘사하는데 사용될 수 있다.자극은 다른 췌도 세포 사이 또는 췌도와 비 췌도 세포 사이를 기능적으로 구별하는 데 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 베타 세포는 전형적으로 세포내 칼슘의 일시적인 증가를 나타내고, 이어서 지속된 고원에서 빠른 칼슘 진동을 나타냄으로써 사각 펄스 글루코스 자극에 반응한다. 대조적으로, 비 베타 세포는 더 빠르고 불규칙한 진동으로 반응합니다.자극 후 세포내 칼슘 증가의 발병 지연뿐만 아니라 개별 세포들 사이의 이질성 및 지연도 또한 측정될 수 있다. 동일한 매개 변수를 사용하여 비활성화 단계를 설명할 수 있습니다. 여기에서 세포내 칼슘 진동 지속기간, 빈도 및 활성 시간의 백분율에 대한 개략적인 제시가 관찰될 수 있다.10 헤르쯔 이상의 획득 속도로 이미징 할 때, 섬을 가로 질러 반복적으로 퍼지는 칼슘파가 명확하게 인식 될 수 있습니다. 일반적인 담관을 십이지장에 가능한 한 가깝게 고정시켜 실수로 췌장으로 들어가는 가지를 막는 것을 방지하십시오. 또한, 아가로스가 바늘에서 즉시 경화되기 때문에 주사 중에 플런저를 누르는 것을 멈추지 마십시오.급성 마우스 췌장 조직 슬라이스 기술은 또한 이온 채널 전류를 연구하고 세포증에 접근하기 위해 패치 클램프 방법과 함께 사용될 수 있으며 면역 조직 화학 연구 및 비서 연구도 가능합니다.

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연구

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Biology

생물학

이 비디오는 췌장섬 세포의 작은 하위 집단에서 세포질 칼슘 농도의 변화를 연구하기 위해 섬 세포를 실시간으로 이미징하는 기술을 설명합니다. 소세포 하위집단은 아드레날린(adrenaline) 및 그렐린(ghrelin)과 같은 마커 화합물에 대한 기능적 반응을 사용하여 확인할 수 있으며, 이는 섬세포의 특정 집단에서 세포질 칼슘의 변화를 유도합니다. 이것은 혈당과 섬 분비 출력 사이의 교차 담화에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

췌장 세포의 칼슘 역학 이미징: 췌장 섬의 세포질 칼슘 농도의 실시간 변화를 연구하는 기술

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