급성 마우스 췌장 조직 조각에서 칼슘 역학의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 검사

살아있는 세포 칼슘 영상과 함께, 급성 췌장 조직 슬라이스 기술은 장기간에 걸쳐 높은 해상도로 세포 간 파동 및 다세포 기능 연결성에 대한 연구를 가능하게합니다. 이 기술의 주요 장점은 조직이 빠르고, 조직 구조를 보존하며, 조직의 높은 수율을 유지하면서 제한된 효소 및 기계적 스트레스를 감소시킨다는 것입니다. 질병 진행 중 기능적 및 형태 학적 변화를 감지함으로써이 기술은 당뇨병과 같은 췌장 관련 질병에 대한 우리의 이해를 돕습니다.

이 조직 슬라이스 기술은 세포 간 접촉, 파라크린 상호 작용 및 조직 구조의 보존에 중점을두고 뇌, 뇌하수체 및 부신 조직에 적용 할 수 있습니다. 마우스 췌장에 아가로스를 주사 할 준비를하려면 섭씨 40 도의 액체 아가로오스로 다섯 밀리리터 주사기를 채우고 주사기에 30 게이지 바늘을 장착하십시오. 바늘을 뚜껑으로 조심스럽게 덮은 후 주사기 바늘 끝을 물 표면 아래에 아가로오스 전체 부피와 함께 섭씨 40도 수조에 놓습니다.

기압과 실온에서 분당 1.5 밀리리터로 지속적으로 얼음 위에 카르보겐으로 세포 외 용액 한 병을 버블링하여 산소화와 7.4의 pH를 보장합니다. 아가로스 주사를 수행하기 위해 안락사성인 마우스를 스테레오 현미경 하에 놓고 개복술을 통해 마우스 복부에 접근한다. 내장을 왼쪽으로 부드럽게 움직여 일반적인 담관을 노출시키고 포셉을 사용하여 덕트의 십이지장 끝을 약간 들어 올려 Vater의 유두를 찾습니다.

지혈제를 사용하여 십이지장 유두에서 담관을 고정시켜 덕트에서 십이지장으로 아가로오스가 누출되는 것을 방지하고 작은 날카로운 포셉을 사용하여 일반적인 담관 아래에 도달하여 덕트를 췌장 조직에 부착하는 막을 부수십시오. 덕트에서 가능한 한 많은 지방과 결합 조직을 제거한 후 덕트를 한 쌍의 더 큰 포셉의 팁에 수직으로 놓고 주사기 플런저를 단단히 누르고 점성이있는 액체 아가로스를 일반 담관의 근위 끝에 20 ~ 30 초 동안 주입하십시오. 조직이 희끄무레하고 약간 흩어지면 주사기를 제거하고 거품이 난 얼음처럼 차가운 세포 외 용액 20 밀리리터를 췌장에 천천히 부어 조직을 식히고 아가로스를 경화시킵니다.

췌장 조직 조각을 얻기 위해 포셉과 미세한 거친 절단 가위를 사용하여 아가로스 주입 된 췌장을 얼음처럼 차가운 세포 외 용액 40 밀리리터가 들어있는 100 밀리미터 페트리 접시에 부드럽게 옮깁니다. 접시를 소용돌이 치며 조직을 헹구고 췌장을 얼음처럼 차가운 세포 외 용액의 두 번째 접시로 옮깁니다. 포셉과 가위를 사용하여 희끄무레하고 잘 주입 된 췌장 섹션을 최대 여섯 개의 0.1 ~ 0.2 입방 센티미터 조각으로 자르고 조직 조각에서 남아있는 결합 및 지방 조직을 제거하십시오.

청소 된 블록을 섭씨 40도 액체 아가로스 약 5 밀리리터가 들어있는 35 밀리미터의 끈적 거리지 않는 바닥 페트리 접시에 넣고 즉시 페트리 접시를 얼음 위에 놓습니다. 아가로스가 굳어지면 페트리 접시를 100 밀리미터 페트리 접시의 뚜껑 위에 거꾸로 잡고 면도날의 절반을 사용하여 페트리 접시의 횡벽과 아가로스 사이의 여백으로 조심스럽게 잘라 접시에서 아가로스를 제거하십시오. 면도날을 사용하여 각각 하나의 조직 블록을 포함하는 개별 큐브를 해방 된 아가로스에서 자르고 시아 노 아크릴레이트 접착제를 사용하여 블록을 비브라 톰의 샘플 플레이트에 부착하십시오.

비브라톰의 절단실을 150 밀리리터의 얼음처럼 차가운 세포외 용액으로 채우고 지속적으로 카르보겐으로 버블링합니다. 스크류는 샘플 플레이트를 진동기에 고정하고 새 면도날을 장착합니다. 챔버를 얼음으로 둘러싸고 여섯 밀리몰 포도당으로 보충 된 세포 외 용액으로 만든 두 개의 10 밀리리터 부피의 얼음 조각을 추가하십시오.

슬라이서를 초당 0.05 ~ 1 밀리미터, 70 헤르츠로 설정 한 다음 슬라이싱을 시작하여 20 ~ 100 평방 밀리미터 표면적을 가진 140 미크론 두께의 아가로스 슬라이스를 얻습니다. 미세한 페인트 브러시를 사용하여 각 조각을 6 밀리몰 포도당으로 보충 된 40 밀리미터의 HEPES 버퍼로 채워진 100 밀리미터 페트리 접시로 조심스럽게 옮깁니다. 칼슘 염료 제조를 위해, 50 마이크로그램의 세포 투과성 칼슘 지시약염 염료, 7.5 마이크로리터의 DMSO 및 2.5 마이크로리터의 폴록사머 및 6.667 밀리리터의 HBS를 15 밀리리터 스크류 캡 튜브에 용해시킨다.

피펫을 사용하여 튜브를 초음파 욕조 챔버에 잠그고 볼텍싱하기 전에 20 초 동안 용액을 완전히 혼합하고 각각 30 초 동안 볼텍싱하십시오. 그런 다음 생성 된 칼슘 지시약 염료 용액 3.333 밀리리터를 라벨링 할 조직 10 조각 당 하나의 5 밀리리터 페트리 접시에 분취한다. 염료 로딩의 경우, 얇은 부드러운 페인트 브러시를 사용하여 최대 10 개의 조직 조각을 염료 용액의 각 접시로 옮기고 접시를 실온에서 50 분 동안 오비탈 쉐이커에 놓고 빛으로부터 보호 된 분당 40 회전을 수행하십시오.

인큐베이션이 끝나면 최대 20 개의 염색 된 조각을 염료가없는 HBS로 채워진 개별 60 밀리리터 페트리 접시에 옮깁니다. 공초점 현미경에 의한 칼슘 이미징의 경우 20배 또는 25배 배율을 선택하고 획득 모드를 타임랩스 이미징으로 설정하고, 핀홀을 100 내지 200 미크론으로 설정하고, 실험에 사용된 형광단에 대한 여기 및 방출을 한다. 기록 챔버 및 관류 시스템을 현미경의 온도 제어 단계에 장착하고 기록 챔버의 먼 가장자리에 입구와 출구를 배치하십시오.

유입 및 유출 속도를 분당 한 밀리리터에서 두 밀리리터로 설정합니다. profusion 시스템의 온도를 섭씨 37도까지 설정하고 비 자극 용액으로 증식을 시작하십시오. 조직의 칼슘 역학을 기록하기 위해 단일 조직 조각을 기록 챔버에 넣고 타우트 나일론 메쉬로 U 자형 백금 중량으로 조직을 고정시킵니다.

밝은 필드 옵션을 사용하여 관심 있는 구조를 찾고 라이브 이미징을 사용하여 연구된 구조물을 시야에 배치합니다. 신호 대 잡음비를 최적화하려면 레이저 전력을 최소한으로 유지하면서 레이저 전력, 검출기 증폭 및 라인 평균 비닝을 조정하십시오. 초점면을 절단면 아래 15미크론으로 조정하여 잠재적으로 손상된 셀에서 녹화되지 않도록 하고 이미지를 획득합니다.

샘플링 주파수를 하나 내지 두 헤르츠로 설정하여 개별 진동을 초기에 감지하고 고해상도 이미지를 녹화할 수 있습니다. 사용 가능한 경우 온라인 차트를 사용하여 준비 응답, 조명, 광표백 및 기계적 드리프트에 대한 즉각적인 피드백을 얻을 수 있습니다. 모든 이미지를 획득한 경우 나중에 분석할 수 있도록 데이터를 저장합니다.

여기에서 세포 투과성 칼슘 지시약염 염료가 췌장 조직 슬라이스에 성공적으로 로딩된 최적의 조직 절편의 예가 관찰될 수 있다. 대조적으로, 이러한 조직 조각은 실패한 염료 침투, 췌도 세포의 부족 또는 샘플 표면의 괴사 조직의 풍부로 인해 이미징에 최적이 아닙니다. 췌장 조직 슬라이스의 고해상도 이미지는 랑게르한스 섬, 아시나 조직 또는 췌장 덕트와 같은 췌장 조직의 별개의 영역을 묘사하는데 사용될 수 있다.

자극은 다른 췌도 세포 사이 또는 췌도와 비 췌도 세포 사이를 기능적으로 구별하는 데 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 베타 세포는 전형적으로 세포내 칼슘의 일시적인 증가를 나타내고, 이어서 지속된 고원에서 빠른 칼슘 진동을 나타냄으로써 사각 펄스 글루코스 자극에 반응한다. 대조적으로, 비 베타 세포는 더 빠르고 불규칙한 진동으로 반응합니다.

자극 후 세포내 칼슘 증가의 발병 지연뿐만 아니라 개별 세포들 사이의 이질성 및 지연도 또한 측정될 수 있다. 동일한 매개 변수를 사용하여 비활성화 단계를 설명할 수 있습니다. 여기에서 세포내 칼슘 진동 지속기간, 빈도 및 활성 시간의 백분율에 대한 개략적인 제시가 관찰될 수 있다.

10 헤르쯔 이상의 획득 속도로 이미징 할 때, 섬을 가로 질러 반복적으로 퍼지는 칼슘파가 명확하게 인식 될 수 있습니다. 일반적인 담관을 십이지장에 가능한 한 가깝게 고정시켜 실수로 췌장으로 들어가는 가지를 막는 것을 방지하십시오. 또한, 아가로스가 바늘에서 즉시 경화되기 때문에 주사 중에 플런저를 누르는 것을 멈추지 마십시오.

급성 마우스 췌장 조직 슬라이스 기술은 또한 이온 채널 전류를 연구하고 세포증에 접근하기 위해 패치 클램프 방법과 함께 사용될 수 있으며 면역 조직 화학 연구 및 비서 연구도 가능합니다.