인간 만능 줄기 세포에서 망막 오가노이드의 지시 유도

이것은 망막 질환에 대한 모델이며 생체 내 망막을 모방합니다. 어느 정도까지는 동물 실험을 대체 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 망막 오가노이드에서 광수용체 전구체의 품질과 양에 최적화되어 있으며, 광수용체는 여러 비가역적 실명 상태의 핵심입니다.

피더가 없는 조건에서 인간 배아 줄기 세포 또는 hESC를 배양하는 것으로 시작합니다. 그렇게 하려면 6웰 플레이트의 한 웰을 시약 A 밀리리터당 100마이크로그램 1밀리리터로 코팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다. 백만 hESC의 분취량을 해동하고 200xg에서 5분 동안 원심분리합니다.

상청액을 제거한 후, 2 밀리리터의 시약 B와 함께 이전에 코팅 된 플레이트에 세포를 시드합니다. 약 4 일에 약 80 % confluency에 도달 한 후 세포를 계대 히십시오. 컨플루언스에 도달하면 예열 된 DPBS로 세포를 세척하고 500 마이크로 리터의 새로 준비된 시약으로 옮깁니다. 그런 다음 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 3.5분 동안 배양합니다.

플레이트의 측면과 바닥을 몇 초 동안 튕겨서 세포를 분리하고, 준비된 배지 중 500 마이크로리터를 첨가한다. 분리된 세포를 새로운 1.5밀리리터 튜브에 수확하고 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅합니다. 세포 계수를 위해 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 900 마이크로리터의 DPBS에 추가합니다.

남은 세포 현탁액 900 마이크로리터를 배지 1로 희석하여 10 밀리리터당 4회 파워 셀을 달성한다. 100마이크로리터의 희석된 세포 현탁액을 비부착성 V-바닥, 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 저속 셰이커에서 접시를 5분 동안 가볍게 돌리고 둘째 날까지 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 배양합니다.

둘째 날에는 96웰 플레이트의 각 웰에 20마이크로리터의 1% 시약 A를 추가하고 중앙에 두 번 피펫팅하여 죽은 세포를 분산시킵니다. 6일째까지 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 배양하기 전에 접시 바닥을 청소합니다. 여섯째 날에, 58 마이크로리터의 배지를 60 마이크로리터의 신선한 배지 1로 교체하고, 배양을 계속한다.

12일째에 15밀리리터 원추형 튜브의 96웰 플레이트에서 세포 펠릿을 수확하고 펠릿이 실온에서 5분 동안 자연적으로 침전되도록 합니다. 펠릿이 침전되면 유기체를 방해하지 않고 상청액을 제거하고 세포 응집체를 시약 A와 함께 배지 2 18ml가 들어있는 10cm 현탁액 접시에 옮깁니다. 18일째에, 접시에서 반투명 시신경 소포의 생성을 확인하고, 생성된 오가노이드를 미세수술용 칼을 사용하여 절단하였다.

절단 된 모든 펠릿을 접시 중앙에 모으십시오. 그런 다음 세포를 15 밀리리터 원추형 팔콘 튜브로 수확합니다. 세포가 침전되면 상청액을 부드럽게 제거하고 접시 당 3 개씩 18ml의 배지가있는 2 개의 10cm 페트리 접시에 펠릿을 재현 탁합니다.

세포 응집을 피하기 위해 접시를 인큐베이터로 부드럽게 옮깁니다. 세포를 계속 배양하고 매주 배지를 바꿉니다. 45일 후 120일까지 CRX 발현을 분석한다.

이 대표적인 분석에서는 인간 망막 생성의 다양한 단계가 표시됩니다. 여섯째 날, 오가노이드는 직경이 약 600마이크로미터인 밝은 림 내부에 조밀한 연결의 집합체로 나타났습니다. 12 일째에, 시신경 소포 유사 구조의 초기 생성이 일어났다.

적절한 소포-유사 구조가 없는 유기체는 18일에 페트리 접시에서 배양하기 전에 폐기되었다. 배양 30일째에는 소포와 같은 구조가 더 분명해졌고 열등한 RO를 쉽게 구별하고 제거할 수 있었습니다. 45일째부터 오가노이드는 CRX, RCVRN 및 OTX2와 같은 광수용체 전구체의 다양한 마커를 발현했습니다.

우수한 망막 오가노이드를 절단함으로써 분화 효율이 크게 향상되고 96개의 플레이트에서 100개 이상의 우수한 오가노이드를 수확할 수 있습니다.