Name: 성인 마우스 맛 줄기 세포에서 파생 된 언어 오르가노이드의 생성 및 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: 배우세요 성인 마우스 CVP에서 맛 줄기 세포를 분리하여 언어 오르가노이드를 생성하는 방법을. FACS로 Lgr5-EGFP 양성 세포를 선별하고 3D 배양하여 맛 수용체 세포 분화를 연구할 수 있습니다.

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저자는 WNR 조건부 미디어와 귀중한 토론을 제공하는 피터 뎀시와 모니카 브라운 (콜로라도 안슈츠 의료 캠퍼스 오르가노이드 및 조직 모델링 공유 자원의 대학)에게 감사드립니다. 우리는 또한 콜로라도 암 센터 세포 기술과 흐름 세포 측정 공유 자원, 특히 드미트리 바투린, 세포 분류 전문 지식을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 NIH /NIDCD R01 DC012383에 의해 지원되었습니다. DC012383-S1, DC012383-S2, NIH/NCI R21 CA236480 ~ LAB, R21DC016131 및 R21DC016131-02S1 ~ DG, F32 DC015958 - EJG.

모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 AAALAC 공인 시설에서 수행되었으며, 콜로라도 안슈츠 의료 캠퍼스의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 LGR5EGFP-IRES-CreERT2 마우스는 잭슨 연구소, 주식 번호 008875.
참고 : 프로토콜의 원활하고 시기 적절한 진행을 보장하기 전에 다음 단계를 완료해야합니다 : 37 °C로 수조를 설정, 원심분리기를 4°C로 설정하고, 10 mg/mL 디스파스, 콜라게나아제 및 엘라스타제 스톡 솔루션(재료 표참조)에서 분사 및 해리 효소 용액을 만들고, 매트릭스 젤을 -20°C 냉동고에서 제거(~750 μL)에서 제거하고, 얼음에서 바이크에 의해 해동하여 적어도 3-4 h, 희석되지 않은 FBS의 프리 코트 마이크로 센심 분리기 튜브는 적어도 30 분 동안 실온에서 부드럽게 흔들어서 (조직 수집을위한 2 mL 튜브 2 개, 해리 된 세포를위한 2 개의 1.5 mL 튜브, 셀렉터에서 단일 세포를 수집하기위한 1.5 mL 튜브; 사용하기 전에 초과 FBS를 제거하십시오).
1. CVP 상형의 격리
참고: 전체 48웰 플레이트에 대해 충분한 LGR5+ 셀을 얻으려면 동일한 튜브에 3개의 Lgr5-EGFP CVP를 수집하고 동시에 처리합니다. 중요한 것은, 별도의 튜브에서 적어도 하나의 야생 형 쓰레기종의 CVP를 수확하고 처리하고 FACS 매개 변수를 설정하는 게이팅 컨트롤로 활용 (대표 결과참조).
<ol><li>IACUC 규정에 따라 CO2 질식으로 마우스를 안락사시키고, 양자 투석절제술, 자궁 경부 탈구, 참수 또는 황산과 같은 승인된 보조 방법을 따릅니다.</li>
	<li>큰 멸균 해부 가위를 사용하여 뺨을 자르고 턱을 부러뜨리세요. 혀를 들어 올리고 언어 프레이틀룸을 잘라 혀를 구강 바닥에서 분리합니다. 혀를 잘라 Ca2 + Mg 2+멸균 얼음 차가운 덜벡코의 인산완충식 식염수 (dPBS)에서 수집합니다.</li>
	<li>면도날(도1A,파선 선)으로인터몰라 눈명성의 전방만 절단하여 전방 혀를 제거하고 버립니다. 섬세한 작업 닦아 서 두 어 후혀에서 머리카락과 여분의 액체를 제거 합니다.</li>
	<li>1 mL 주사기를 200-300 μL의 주사 효소 용액 (최종 농도: 2 mg / mL 유형-I 콜라게나아제 및 5 mg / mL Dispase II Ca2 +/ Mg2+함유 dPBS, 10 mg/mL 스톡 용액으로부터 희석하고 CVP에 단면까지 인터몰러 저명(도1B,검은 화살)바로 위에 30 G x 1/2 바늘을 삽입합니다(도1B, 블랙 박스). 상피와 기본 조직 (라미나 프로프리아, 근육)사이 CVP의 아래와 측면 가장자리에 효소 용액을 주입하십시오. 주사가 수행됨에 따라 혀에서 주사를 천천히 지속적으로 철회하십시오.</li>
	<li>멸균 Ca2+/Mg 2+-무료 dPBS에서 혀를 33 분 동안 실온에서 배양하십시오.</li>
	<li>상피 양자간 에서 작은 상처를 만들고 여분의 미세 해부 가위를 사용하여 CVP에 단면만 하고, 미세 한 포셉으로 들어 올려 상피를 부드럽게 벗깁니다. 트렌치 상피가 기본 결합 조직이 없는 후 FBS로 미리 코팅된 빈 2mL 미세 원심 분리기 튜브에 놓습니다. CVP 상피(도1C,D)를분리하기 전이나 후에 상피 트리밍을 수행합니다.</li>
</ol>2. CVP 상형절의 해리
참고: CVP 상피 및 도금의 해리는 도 2에서그래픽으로 표시됩니다.
<ol><li>해리 효소 칵테일(최종 농도: 2 mg/mL 타입-I 콜라게나아제, 2 mg/mL 엘라스타제, 5 mg/mL 엘라스타제, 5 mg/mL Dispase II ca2+/Mg2+-함유 dPBS, 10 mg/mL 스톡 솔루션에서 희석) 껍질을 벗긴 CVP epithelia(CVP epithelia 당 20)를 포함하는 튜브에 추가하십시오. 37°C 수조에서 45분 동안 배양합니다. 15분마다 소용돌이가 잠깐. 참고: 37°C 수조에서 0.25% 트라이핀-EDTA를 선도하여 효소 칵테일 인큐베이션을 마지막 15분 동안 섭취합니다.</li>
	<li>인큐베이션을 따라, 소용돌이 (3 펄스)는 1 분 동안 유리 파스퇴르 파이펫으로 세리라세이터. 조직 조각이 정착한 후, 분리된 세포의 첫 번째 수집을 포함하는 피펫을 새로운 FBS 코팅 1.5 mL 미세 원심 분리튜브로 결합형에 대응하는. 2.3 단계에서 설명된 바와 같이 나머지 조직 조각을 더 처리한다. 아래.<ol>
<li>펠릿 세포에 370 x g 및 4 °C에서 5 분 동안 상체를 회전합니다.</li>
		<li>생성된 상체를 제거하고 형광 활성화 셀 정렬(FACS) 버퍼(1mM EDTA, 25mM HEPES(pH 7.0) 및 Ca2+/Mg2+-무료 PBS(CVP당 50μL)의 1% FBS에서 세포 펠릿을 재연한다. 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2.2.1 단계 및 2.2.2 단계를 수행하는 동안, 사전 따뜻하게 0.25 % 트립신-EDTA (CVP 당 200 μL)를 원래 2 mL 마이크로 센트 심분리기 튜브에 추가하여 나머지 조직 조각을 2.2 단계에서 분리하고 30 분 동안 37 °C 수로 배양합니다. 10분마다 소용돌이가 잠깐.</li>
	<li>인큐베이션에 따라 조직 조각(3펄스)을 함유한 튜브를 소용돌이로 처리한 다음 유리 파스퇴르 파이펫으로 1분 동안 삼중화합니다. 조직 조각이 정착한 후, 2.2.2 단계에서 세포를 포함하는 1.5 mL 미세 원심 분리기 튜브로 피펫. 나머지 조직 조각을 포함하는 튜브를 폐기하십시오.<ol>
<li>370 x g및 4°C에서 5분 동안 해리된 세포로 튜브를 스핀하여 펠릿 세포로 돌보세요.</li>
		<li>FACS 버퍼에서 상체를 제거하고 세포 펠릿을 다시 중단하십시오(CVP당 100 μL). 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 μm 나일론 메쉬 필터를 통과하고 FACS 전에 세포 혼합물에 DAPI(λ방출 = 450 nm)를 추가합니다. 녹색 형광 단백질 채널을 사용하여 FACS를 통해 Lgr5-GFP+ 세포를 분리합니다 (λ여기 = 488 nm; λ방출 = 530 nm). 100 μm 노즐을 사용하여 Ca 2+ /Mg2+무료 dPBS의 300 μL을 포함하는 신선한 FBS 코팅 1.5 mL 마이크로 센세이스분리기튜브로 세포를 정렬합니다. 도금 될 때까지 얼음에 세포를 놓습니다.</li>
</ol>3. Lgr5-EGFP 세포의 도금
<ol><li>유동 세포계로부터 수신된 LGR5+ 셀 서스펜션의 부피를 결정한다.</li>
	<li>선별기에서 얻은 셀 수에 따라 μL당 셀 수를 계산합니다. 그런 다음, 도금에 필요한 세포의 원하는 수를 결정하는 데 필요한 부피(우리는 48웰 플레이트의 우물당 200개의 세포를 사용) 및 중단된 세포의 총 부피를 새로운 미세원심분리기 튜브로 이송한다.</li>
	<li>370 x g및 4°C에서 5분 동안 튜브를 펠릿 세포로 회전시십시오(펠릿이 보이지 않을 수 있음). 상체를 제거하고 얼음에 튜브를 배치합니다.</li>
	<li>매트릭스 젤의 적절한 양으로 셀 펠릿을 부드럽게 재연 (48 웰 플레이트에 대한 우물 당 15 μL); 파이펫을 부드럽게 위아래로 사용하여 매트릭스 젤에 세포를 철저히 분배합니다. 각 웰의 중앙에 매트릭스 젤/셀 혼합물 15 μL을 놓습니다. 매트릭스 젤이 젤링되는 것을 방지하기 위해 도금 중에 50mL 원문 튜브에 미세 원심 분리기 튜브를 보관하십시오. 3개의 우물마다 위아래로 파이프를 사용하여 도금 전반에 걸쳐 매트릭스 젤/셀 혼합물을 계속 섞어 우물 전체에 걸쳐 세포의 균일한 분포를 보장합니다.</li>
	<li>플레이트를 인큐베이터(37°C, 5% CO2,~95% 습도)에 10분 간 배치하여 매트릭스 겔링을 허용합니다. 그런 다음 실온 WENRAS + Y27632 용지 300 μL을 각 웰에 추가하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다.</li>
</ol>4. 오르가노이드 유지 보수
참고: 오르가노이드는 재조합 EGF및 Wnt3a, 노긴 및 R-spondin23을포함하는 50% 조절된 매체를 포함하는 기존의 오르가노이드 미디어(WENR)에서 재배된다. 약물 A8301 및 SB202190은 성장을 최적화하기 위해 배양 기간의 첫 6일 동안 첨가(WENRAS 미디어)(그림 5),다음 분화(WENR media)20을촉진하기 위해 제거된다. Y27632는 생존을 촉진하기 위해 문화의 첫 2 일 동안 추가됩니다. 문화 권면에 대한 미디어 조건은 그림 4에표시됩니다.
<ol><li>도금 후 이틀 후, 1mL 파이펫을 사용하여 각 우물에서 WENRAS + Y27632 미디어를 제거하여 교차 오염을 보장합니다. 매트릭스 젤을 방해하지 않도록 웰의 측면에 WENRAS 미디어의 300 μL을 추가합니다. 접시를 인큐베이터에 반환합니다.</li>
	<li>문화 단계에 적합한 미디어를 사용하여 2일마다 미디어를변경합니다(그림 4). 오르가노이드가 수확 할 준비가된 12 일까지 오르가노이드를 유지하십시오.</li>
</ol>5. RNA 처리
<ol><li>RNA를 위한 수확 오르가노이드<ol>
<li>매트릭스 젤을 폴리머로 정합하기 위해 30 분 동안 얼음에 48 웰 플레이트를 놓습니다.</li>
		<li>1mL 파이펫을 사용하여 오르가노이드 미디어를 당깁니다. 그런 다음, 미디어가 우물로 돌아오면 파이펫 끝을 사용하여 매트릭스 젤을 긁어 내고 더 분해하십시오. 내용물들을 1.5mL 마이크로센심분리기 튜브로 전송하여 3개의 우물의 내용기를 하나의 튜브에 모은다. 실온에서 300 x g에서 5 분 동안 튜브를 원심 분리합니다.</li>
		<li>어떤 오르가노이드를 제거하지 않고 가능한 한 많은 미디어 상체를 제거; 그런 다음 실온에서 300 x g에서 5 분 동안 튜브를 다시 회전시하십시오.</li>
		<li>나머지 매체를 제거하고 350 μL 리시스 버퍼 + β-mercaptoethanol (βME) (1mL 용해 완충제 당 10 μL βME)에서 오르가노이드를 재연한다. 즉각적인 RNA 추출을 위해 샘플을 얼음 에 놓거나 -80 °C에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>정량적 RT-PCR 분석<ol>
<li>분광광계를 통해 RNA 양을 측정합니다. cDNA 합성 키트를 사용하여 RNA를 역전사한다.</li>
		<li>200 nM 사전 검증 된 전방 및 역 프라이머(표 1)및 형광 PCR 마스터 믹스와 5 ng RNA에 상응하는 cDNA를 혼합합니다. qRT-PCR 반응을 40사이클에서 실행: 15s에 대한 95°C, 60°C는 60s에 대해 실행한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 면역 화학
<ol><li>오간노이드 수확 및 고정<ol>
<li>매트릭스 젤을 풀기 위해 30 분 동안 얼음에 48 웰 플레이트를 놓습니다.</li>
		<li>오가노이드 미디어를 제거하고 각 우물에 400 μL의 얼음 차가운 PBS를 추가합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 각 우물에 400 μL의 얼음 차가운 세포 회수 솔루션을 추가합니다. 4°C에서 30분간 부드럽게 흔들어 주세요.</li>
		<li>PBS에서 1mL 파이펫 팁을 1% BSA로 코팅하고, 웰의 내용물들을 부드럽게 피펫하여 매트릭스 젤을 분해합니다. 내장을 얼음 위에 놓인 1.5mL 마이크로센트심리분리기 튜브로 옮기.</li>
		<li>각각 300 μL PBS + 1% BSA로 잘 헹구고 나머지 오르가노이드를 해당 튜브로 옮기습니다. 각 튜브에서 세포 회수 솔루션/PBS + BSA를 제거합니다. 400 μL의 얼음 차가운 PBS를 추가한 다음 또 다른 얼음 차가운 PBS 헹구기로 반복합니다.</li>
		<li>PBS를 제거하고 300 μL 얼음 감기 4 % PFA (0.1 M PB)로 20 분 동안 오르가노이드를 수정하여 실온에서 배양하십시오. PFA를 제거하고 400 μL 얼음 차가운 PBS로 오르가노이드를 헹구세요.</li>
		<li>PBS 제거; 그런 다음 400 μL PBS + 1 % BSA를 추가하십시오. 4 °C에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>면역형광 염색<ol>
<li>500 μL PBS + 1 % BSA에서 내장 오르가노이드를 헹구십시오. 이어서, 블로킹 용액(일반 염소 또는 당나귀 세럼 5%, 소세럼 알부민 1%, 1x PBS pH 7.3에서 0.3% Triton X 100)에서 오르가노이드를 2시간 동안 실내 온도에서 부드럽게 흔들어 놓는다.</li>
		<li>1 차적인 항체 용액 (차단 용액에서 희석 된 1 차 적인 항체)를 추가하고 4 ° C에서 3 박 동안 부드럽게 흔들어.</li>
		<li>500 μL PBS + 0.2 % 트리톤으로 1 시간 동안 4 배 의 오르가노이드를 세척하여 실온에서 부드럽게 흔들십시오. 4°C에서 빛으로부터 보호되는 이차 항체 용액(차단 용액에서 희석된 이차 항체)과 암석 오르가노이드를 하룻밤 사이에 추가합니다.</li>
		<li>500 μL PBS + 0.2 % 트리톤으로 1 시간 동안 3 배 의 오르가노이드를 세척하여 빛으로부터 보호하고 실온에서 부드럽게 흔들십시오. DAPI와 인큐베이션은 0.1 M PB에서 0.10,000을 20분 동안 희석하여 실온에서 흔들리고 덮습니다.</li>
		<li>오가노이드를 0.1M PB로 20분 동안 3배 씻어 내고, 부드럽게 흔들리고 실온에서 덮습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>반전 된 공초점 현미경 검사법을 위한 오르가노이드의 슬라이드 장착. 참고: 슬라이드 장착 프로세스의 단계별 사진은 그림 7에표시됩니다.<ol>
<li>현미경 슬라이드에 무독성 모델링 점토의 ~ 1mm 두께 22 x 22mm 정사각형 둘레를 만듭니다.</li>
		<li>마이크로센티심분리기 튜브에서 0.1 M PB를 제거하고, 선택 된 100 μL 장착 매체에서 유기체를 부드럽게 재중단; 그런 다음 점토 광장의 중심으로 이동합니다.</li>
		<li>마운팅 매체가 거의 맨 위에 오를 때까지 점토 사각형을 채웁니다. 그런 다음 22 x 22mm 정사각형 커버슬립을 점토 위에 놓고 커버슬립의 측면에 단단히 눌러 밀봉합니다. 제조업체의 지침에 따라 치료하여 (여기, 1-2 일 동안 실온) 4 °C에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+renewal+in+gustation%3A+new+insights+into+taste+bud+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development.</a> Development. 142, 3620-3629 (2015).</li>
<li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+coding+of+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li>
<li>Finger, T. E., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFinger%2C+TE+%22The+neurobiology+of+taste+and+smell%22">The neurobiology of taste and smell</a>. , John Wiley-Liss and Sons Inc. New York, US. 287-314 (2000).</li>
<li>Barlow, L. A., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+and+regenerating+a+sense+of+taste%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Developing and regenerating a sense of taste.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).</li>
<li>Yee, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lgr5-EGFP+marks+taste+bud+stem%2Fprogenitor+cells+in+posterior+tongue%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue.</a> Stem Cells. 31 (5), Dayton, Ohio. 992-1000 (2013).</li>
<li>Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog-expressing+basal+cells+are+general+post-mitotic+precursors+of+functional+taste+receptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).</li>
<li>Deshpande, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-related+alterations+of+taste+function+in+patients+with+head+and+neck+cancer%3A+a+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Treatment+Options+in+Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review.</a> Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12(2018).</li>
<li>Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemosensory+changes+from+cancer+treatment+and+their+effects+on+patients%27+food+behavior%3A+A+scoping+review%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review.</a> Nutrients. 11 (10), 2285(2019).</li>
<li>Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-induced+taste+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Safety%22%5BJournal%5D)">Drug-induced taste disorders.</a> Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).</li>
<li>Kumari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+taste+organs+and+sensory+function+after+severe+loss+from+Hedgehog%2FSmoothened+inhibition+with+cancer+drug+sonidegib%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).</li>
<li>Ermilov, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+taste+organs+is+strictly+dependent+on+epithelial+hedgehog%2Fgli+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling.</a> PLoS Genetics. 12 (11), 1006442(2016).</li>
<li>Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionated+head+and+neck+irradiation+impacts+taste+progenitors%2C+differentiated+taste+cells%2C+and+Wnt%2F%CE%B2-catenin+signaling+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/β-catenin signaling in adult mice.</a> Scientific Reports. 9, 17934(2019).</li>
<li>Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+taste+bud+cell+loss+after+head+and+neck+irradiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).</li>
<li>Ohla, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognizing+taste%3A+Coding+patterns+along+the+neural+axis+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals.</a> Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).</li>
<li>Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+taste%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The cell biology of taste.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).</li>
<li>Breslin, P. A., Spector, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+taste+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Mammalian taste perception.</a> Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).</li>
<li>Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+stem%2Fprogenitor+cell+cycle+using+murine+circumvallate+papilla+taste+bud+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid.</a> Scientific Reports. 5, 17185(2015).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5-+or+Lgr6-expressing+taste+stem%2Fprogenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li>
<li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 945, Clifton, N.J. 319-328 (2013).</li>
<li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7, 4004(2017).</li>
<li>Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide-induced+inflammatory+cytokine+expression+in+taste+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Senses%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids.</a> Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).</li>
<li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-spondin+substitutes+for+neuronal+input+for+taste+cell+regeneration+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118(2021).</li>
<li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li>
<li>Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStaats%2C+J+%22Immunophenotyping%3A+Methods+and+Protocols%22">Immunophenotyping: Methods and Protocols</a>. , Springer. New York, US. 81-104 (2019).</li>
<li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amine-reactive+dyes+for+dead+cell+discrimination+in+fixed+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 9, Unit-9.34 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li>
<li>Ekert, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommended+guidelines+for+developing%2C+qualifying%2C+and+implementing+complex+in+vitro+models+%28CIVMs%29+for+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discovery%3A+Advancing+Life+Sciences+R+%26+D%22%5BJournal%5D)">Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 25 (10), 1174-1190 (2020).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+development+and+disease+with+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Castillo-Azofeifa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sonic+hedgehog+from+both+nerves+and+epithelium+is+a+key+trophic+factor+for+taste+bud+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance.</a> Development. 144 (17), Cambridge, England. 3054-3065 (2017).</li>
<li>Vintschgau, M. v, Hönigschmied, J. Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVintschgau%2C+Mv+%22Archiv+f%C3%BCr+die+gesamte+Physiologie+des+Menschen+und+der+Tiere%22">Archiv für die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere</a>. 14, 443-448 (1877).</li>
<li>Liu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+Shh+signaling+centers+participate+in+fungiform+papilla+and+taste+bud+formation+and+maintenance%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance.</a> Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).</li>
<li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li>
<li>Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-derived+kidney+organoids%3A+engineering+the+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Molecular+Life+Sciences%3A+CMLS%22%5BJournal%5D)">Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature.</a> Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).</li>
</ol>

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여기에 보고된 효율적이고 쉽게 반복가능한 방법으로 성인 마우스 맛 줄기 세포에서 유래한 언어 오르가노이드를 배양, 유지 및 가공할 수 있다. EGFP마우스는 8~20주 된 Lgr5-EGFP 마우스3개의 CVP를 사용하여 실험용으로 ~10,000GFP+ 세포를 얻기에 충분하여 48웰 플레이트당 200개의 세포밀도로 도금된 50개의 우물을 초래하는 것으로 나타났다. CVP 트렌치 에피테리아의 제거는 갓 만든 디스파스 II와 타입-I 콜라게나제 용액으로 언어 상피를 주입하고 33분 배양에 의해 최적화됩니다. 그러나, 짧은 잠복기, 오래된 효소 알리따트, 다른 제비, 또는 다른 제조 업체에서 효소를 사용 하 여 불완전 한 트렌치 제거 귀 착될 수 있습니다. 반대로, 더 긴 잠복기는 조직의 과잉 소화를 일으키는 원인이 되고, 맛 조직 무결성의 손실의 결과로. 필링 후 CVP 트렌치에 대한 추가 농축은 CVP를 둘러싼 상피를 트리밍하여 이루어졌습니다.
해...

설치류에서, 언어 미각은 앞쪽으로 분포된 곰팡이 형태의 유두, 양측 단풍 유두 후방, 혀1의후방 에 있는 단일 둘레 유두(CVP)에 보관된다. 각 미각은 50-100의 단명, 빠르게 갱신하는 미각 수용체 세포(TrC)로 구성되어 있으며, 여기에는 I형 I 신경교식 지지 세포, 달콤하고 쓴 맛, 감칠맛을 감지하는 II형 세포, 신맛을 감지하는 III 세포유형 2,3,4. 마우스 CVP에서, 기저 라미나를 따라 LGR5+ 줄기 세포는 모든 TRC 유형뿐만 아니라 비맛 상피 세포를생성5. 미각 계보를 갱신할 때, LGR5 딸 세포는 먼저 미토틱 미각 전구체 세포(type IV 세포)로 지정되어 미각을 입력하고 3가지 TRC 유형 중 하나로 분화할 수 있는6. TrC의 급속한 회전율은 방사선 및 특정 약물치료7,8,9,10,11,12,13을포함한 의료 치료에 의한 중단에 취약한 맛 시스템을 렌더링합니다. 따라서, 맛 줄기 세포 조절 및 TRC 분화의 맥락에서 맛 시스템을 연구하는 것은 맛 기능 장애를 완화하거나 방지하는 방법을 이해하는 데 필수적이다.
마우스는인간14, 15,16과유사하게 조직된 맛 체계를 갖기 때문에 맛 과학에서 생체 내 연구를 위한 전통적인 모델이다. 그러나, 마우스는 높은 처리량 연구 결과, 유지 보수 비용이 많이 들고 작업하는 데 시간이 많이 걸리기 때문에 이상적이지 않습니다. 이를 극복하기 위해, 체외 오르간 배양 방법은 최근 몇 년 동안 개발되었다. 미각 오르가노이드는 네이티브 CVP 조직에서 생성될 수 있으며, 오가노이드가 분리된 마우스 CVP 상피 배양ex ex vivo17로부터싹을 떼어낸 과정이다. 이 오르가노이드는 생체 내 맛 시스템과 일치하는 다층 상피를 표시합니다. ex vivo CVP 문화를 필요로하지 않는 오르가노이드를 생성하는 보다 효율적인 방법은 2014년Renetal.에 의해 개발되었다. 장 가구를 성장시키기 위해 처음 개발된 적응 방법 및 배양 배지는 마우스 CVP에서 단일 Lgr5-GFP+ 전구 세포를 분리하고 매트릭스젤(19)에서도금하였다. 이러한 단일 세포는 배양의 첫 6일 동안 증식하는 언어 오르가노이드를 생성하고, 8일째에 분화하기 시작하고, 배양 기간이 끝날 때까지 비미미피상피세포와 3가지 TRC 유형18,20을모두 함유하고 있다. 현재까지, 언어 오르가노이드 모델 시스템을 활용한 다중 연구가17,18,20,21,22를발표했다. 그러나 이러한 오르가노이드를 생성하는 데 사용되는 방법 및 문화 조건은 간행물마다 다릅니다(보충표 1). 따라서, 이러한 방법은 LGR5+ 성인 마우스 CVP의 선조로부터 유래된 언어 오르가노이드의 배양에 대한 상세한 표준화 된 프로토콜을 제시하기 위해 여기에 조정 및 최적화되었습니다.
언어 오르가노이드는 맛 세포 발달과 갱신을 주도하는 세포 생물학적 과정을 연구하기위한 독특한 모델을 제공합니다. 언어 오르가노이드의 응용 프로그램이 확장되고 더 많은 실험실이 체외 오르간 형 모델을 활용하는 방향으로 이동함에 따라, 현장은 재현성을 향상시키기 위해 표준화 된 프로토콜을 개발하고 채택하기 위해 노력하는 것이 중요합니다. 맛 과학 내의 표준 도구로 언어 오르가노이드를 확립하면 단일 줄기 세포가 성인 맛 시스템의 분화 된 세포를 생성하는 방법을 따로 애타게하는 높은 처리량 연구를 가능하게합니다. 추가적으로, 언어 오르가노이드는 맛 항상성에 잠재적인 충격을 위해 약물을 신속하게 검사하기 위하여 이용될 수 있었습니다, 그 때 동물 모형에서 더 철저하게 조사될 수 있었습니다. 이 접근은 궁극적으로 미래 약 수령인을 위한 삶의 질을 향상시키는 치료를 고안하기 위하여 노력을 강화할 것입니다.

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 당나귀 anti goat IgG</td><td>분자 프로브</td><td>A11056, RRID: AB_142628</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 염소 anti Rabbit IgG Molecular</td><td>Probes</td><td>A11010, RRID:AB_2534077</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 염소 anti Guinea pig IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11075, RRID:AB_2534119</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 당나귀 안티 토끼 IgG</td><td>분자 프로브</td><td>A31573, RRID : AB_2536183</td><td>1 : 2000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 염소 안티 쥐 IgG</td><td>분자 프로브</td><td>A21247, RRID : AB_141778</td><td>1 : 2000</td></tr><tr><td>DAPI (FACS의 경우)</td> <td>Thermo Fischer</td><td>62247</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (면역 조직 화학의 경우)</td><td>Invitrogen</td><td>D3571, RRID : AB_2307445</td><td>1 : 10000</td></tr><tr><td>염소 안티 CAR4</td><td>R& D 시스템</td><td>AF2414, RRID:AB_2070332</td><td>1:50</td></tr><tr><td>기니피그 안티-KRT13</td><td>Acris 항체</td><td>BP5076, RRID:AB_979608</td><td>1:250</td></tr><tr><td>토끼 안티-GUSTDUCIN</td><td>산타크루즈 생명공학 Inc.</td><td>sc-395, RRID:AB_673678</td><td>1:250</td></tr><tr><td>토끼 안티-NTPDASE2</td><td>CHUQ</td><td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td><td>1:300</td></tr><tr><td>쥐 안티-KRT8</td><td>DSHB</td><td>TROMA-IS, RRID:</td><td>AB_531826 1:100</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2D 로커</td><td>Benchmark Scientific Inc.</td><td>BR2000</td><td></td></tr><tr><td>3D 로테이터</td><td>실험실 라인 기기</td><td>4630</td><td></td></tr><tr><td>빅 디지트 타이머/스톱워치</td><td>Fisher Scientific</td><td>S407992</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>CO2 탱크</td><td>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>FormaTM 시리즈 3 Water Jackeed CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>4110</td><td>184 L, 광택 스테인리스 Steel</td></tr><tr><td>Incucyte</td><td>Sartorius</td><td>모델: S3</td><td>암 센터 세포 기술 공유 리소스, 콜로라도 대학교 Anschutz Medical Campus</td></tr><tr><td>MoFlo XDP100</td><td>Cytomation Inc</td><td>모델: S13211997</td><td>&nbsp; Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td></tr><tr><td>Orbital Shaker</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>Excella E1</td><td></td></tr><tr><td>Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4376600</td><td></td></tr><tr><td>냉장 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>분광광도계</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 실체 현미경</td><td>Zeiss</td><td>Stemi SV6</td><td></td></tr><tr><td>Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad</td><td>580BR</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>정밀</td><td>51220073</td><td></td></tr><tr><td>Media</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83 01</td><td>Sigma</td><td>SML0788-5MG</td><td>재고 농도 10 mM, 최종 농도 500 nM</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>재고 농도 50X, 최종 농도 1X</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>재고 농도 1000X, 최종 농도 1X</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>재고 농도 100X, 최종 농도 1X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>재고 농도 100X, 최종 농도 1X</td></tr><tr><td>쥐 EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09-1MG</td><td>재고 농도 500 &micro; g/mL, 최종 농도 50 ng/mL</td></tr><tr><td>Murine Noggin</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>재고 농도 50 &마이크로; g/mL, 최종 농도 25ng/mL</td></tr><tr><td>N-acetyl-L-cysteine</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td>재고 농도 0.5 M, 최종 농도 1 mM</td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>Sigma</td><td>N0636-100g</td><td>재고 농도 1 M, 최종 농도 1 mM</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>재고 농도 100X, 최종 농도 1X</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-pm-1</td><td>재고 농도 500X, 최종 농도 1X</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>R& D Systems</td><td>1264</td><td>재고 농도 10 mM, 최종 농도 0.4 & 마이크로; M</td></tr><tr>WRN Dempsey Lab에서 받은<td>컨디셔닝 배지</td><td></td><td></td><td>(AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). L-WRN(ATCC&reg; CRL-3276&거래;) 세포</td></tr><tr><td>Y27632 dihydochloride 10ug</td><td>APExBIO</td><td>A3008-10</td><td>재고 농도 10 mM, 최종 농도 10 &micro; M</td></tr><tr><td>Other</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 ml TB 주사기</td><td>BD 주사기</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올, 최소 98%</td><td>Sigma</td><td>M3148-25ML</td><td>&beta;-메르캅토에탄올</td></tr><tr><td>2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>USA Scientific</td><td>1420-2700</td><td></td></tr><tr><td>48웰 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>150687</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4 인치 파스퇴르 피펫</td><td>Fisherbrand</td><td>12-678-8A</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청의 알부민 (BSA)</td> <td>Sigma Life Science</td><td>A9647-100G</td><td></td></tr><tr><td>버퍼 RLT 용해 버퍼</td><td>QIAGEN</td><td>1015750</td><td></td></tr><tr><td>세포 회수 솔루션</td><td>Corning</td><td>354253</td><td></td></tr><tr><td>Cohan-Vannas 스프링 가위</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>15000-02</td><td></td></tr><tr><td>클로스트리듐 히스톨리티쿰의 콜라겐분해효소, 유형 I</td><td>시그마 생명 과학</td><td>C0130-1G</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RGF BME, 유형 2, Pathclear</td><td>R& D 시스템</td><td>3533-005-02</td><td>Matrigel</td></tr><tr><td>Dispase II (중성 프로테아제, 등급 II)</td><td>Sigma-Aldrich (Roche)</td><td>4942078001</td><td></td></tr><tr><td>일회용 필터</td><td>Sysmex</td><td>04-0042-2316</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 pH 7.4 (1X) (Ca2+ & Mg2+ free)</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Ca2+를 함유한 인산염 완충 식염수 mg2+&nbsp;</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8662-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 집게</td><td>미세 과학 도구</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td><td>Promega</td><td>V4231</td><td></td></tr><tr><td>엘라스타제 동결건조</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002292</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 솔루션</td><td>시그마 생명 과학</td><td>H3537-100ML</td><td></td></tr><tr><td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA 합성 키트</td><td>Bio-Rad</td><td>1706691</td><td></td></tr><tr><td>모델링 클레이, 그레이</td><td>사전트 아트</td><td>22-4084</td><td></td></tr><tr><td>니들</td><td>BD 주사기</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>노멀 당나귀 세럼</td><td>잭슨 ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>노멀 염소 세럼</td><td>잭슨 ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>시그마-알드리치</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>PowerSYBR Green PCR 마스터 믹스</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Micro Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74004</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr> 인<tr><td>산나트륨 이염기성 무수</td><td>Fisher Chemical</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 무수</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 현미경 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위 - 샤프</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14002-14</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Life Science</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>VWR 마이크로 커버 유리</td><td>VWR</td><td>48366067</td><td>22x22mm</td></tr></tbody></table>

성인 마우스 맛 줄기 세포에서 파생 된 언어 오르가노이드의 생성 및 배양

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

맛의 감각은 빠르게 갱신 맛 수용체 세포 (TrC)로 구성된 혀의 미각에 의해 매개된다. 이 지속적인 회전율은 현지 선조 세포에 의해 구동되고 차례로 심각하게 삶의 질에 영향을 미치는 의료 치료의 무리에 의해 중단되기 쉬운 맛 기능을 렌더링합니다. 따라서 약물 치료의 맥락에서이 과정을 연구하는 것은 맛 선조 기능과 TRC 생산이 어떻게 영향을 받는지 이해하는 데 필수적입니다. 인간의 취향 조직의 윤리적 우려와 제한된 가용성을 감안할 때, 인간과 유사한 맛 시스템을 가진 마우스 모델은 일반적으로 사용됩니다. 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 높은 처리량 연구에 순종하지 않는 생체 내 방법과 비교하여 뮤린 언어 오르가노이드는 많은 복제및 적은 마우스로 실험을 신속하게 실행할 수 있습니다. 여기서, 이전에 발표된 프로토콜은 성인 마우스의 외면 유두(CVP)로부터 분리된 미각 전구 세포로부터 미각 오르가노이드를 생성하는 표준화된 방법이 제시되고 있다. CVP에서 미각 전구는 LGR5를 발현하고 LGR5EGFP-IRES-CreERT2 항성을 운반하는 마우스로부터 EGFP 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 통해 분리될 수 있다. 선별된 세포는 매트릭스 젤 계 3D 배양 시스템에 도금되어 12일 동안 배양된다. 오르가노이드는 증식을 통해 배양 기간의 첫 6일 동안 확장한 다음 분화 단계에 들어가 비미미맛 상피 세포와 함께 세 가지 맛 세포 유형을 모두 생성합니다. 오르가노이드는 RNA 발현 및 면역 조직화학 분석을 위한 성장 과정에서 12일째 또는 언제든지 성숙시 수확될 수 있다. 성인 줄기 세포에서 언어 오르가노이드의 생산을위한 문화 방법을 표준화하면 맛 기능 장애를 경험하는 환자를 돕기 위해 싸움에서 강력한 약물 선별 도구로 재현성을 향상시키고 언어 오르가노이드를 발전시킬 것입니다.

마우스는 1개의 CVP를 가지고 있으며, 혀에 후방으로 위치하며, LGR5+ 줄기 세포는 분리될 수 있다(도1A,블랙박스). CVP(도1B)전후의 효소 용액을 주입하면 결합 조직의 상피 및 소화가 약간 부어 오게 됩니다. 충분한 소화는 33 분 배양 후 달성되며, 이는 기본 조직에서 CVP 상피의 쉽게 분리 할 수 있습니다. CVP 상피를 벗기려고 할 때, 트렌치가 중단되거나 손상되지 않도록 CVP로부터 충분한 거리에서 절단해야한다(그림 1C). 또한 CVP를 손상시키지 않고 집게를 사용하여 상피를 잡을 수 있습니다. CVP를 둘러싼 상피를 트리밍하면 비표적 세포를 제거하고 조작되는 조직 질량을 감소시킴으로써 다음 단계의 효율을 증가시킵니다(도1D). 마이크로원심분리기...

이 프로토콜은 성인 마우스의 후미 유두로부터 분리된 맛 줄기 세포로부터 추출한 언어 오르가노이드를 배양하고 가공하는 방법을 제시한다.

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Organoids는 약물 선별 및 생물학적 과정을 이해하는 데 사용되는 강력한 체외 기술입니다. 따라서 혀를 모델링하는 오르가노이드를 생성하는 것은 맛 세포 발달과 재생을 연구하는 데 매우 중요합니다. 전통적인 생체 내 맛 연구는 비싸고 시간이 많이 걸릴 수 있습니다.이 organoid 프로토콜은 더 높은 처리량 실험을 허용하면서 이러한 문제를 최소화하는 표준화되고 재현 가능한 대안을 제공합니다. 성인 마우스를 안락사 한 후, 큰 멸균 해부 가위를 사용하여 뺨을 자르고 턱을 부러 뜨리세요. 그런 다음 혀를 들어 올리고 언어 프레이틀럼을 잘라 혀를 구강 바닥에서 분리합니다.혀를 잘라 칼슘과 마그네슘으로 멸균 얼음 차가운 dPBS로 수집합니다. 해부 현미경으로, 면도날로 인터 말라지 의 앞쪽을 절단하여 전방 혀를 제거하고 버립니다. 그런 다음 섬세한 작업 와이프를 사용하여 후방 혀에서 머리카락과 과도한 액체를 제거합니다.다음으로, 1 밀리리터 주사기를 200~300마이크로리터의 주사 효소 용액으로 채우고, 주위 유두 또는 CVP의 전방까지 인터 말라저 에지우닝 바로 위에 30 게이지 반인치 바늘을 삽입한다. 상피와 기본 조직 사이의 CVP의 측면 가장자리 아래와 측면 가장자리에 효소 용액을 주입하십시오. 용액이 주입됨에 따라 주사기를 혀에서 천천히 그리고 지속적으로 철회하십시오.혀와 멸균 칼슘 마그네슘이 없는 dPBS를 실온에서 33분 간 배양합니다. 초미세 해부 가위를 사용하여, CVP의 양측 과 단지 전방에 작은 상처를. 그런 다음 미세 한 집게로 들어 올려 상피를 부드럽게 벗깁니다.트렌치 상피가 기본 결합 조직이 없는 후 FBS로 미리 코팅된 2밀리리터 미세 원심 분리튜브에 넣습니다. 해리 효소 칵테일을 껍질을 벗긴 CVP 상피를 포함하는 튜브에 넣고 15분마다 짧은 소용돌이로 45분 동안 섭씨 37도의 수조에 배양합니다. 마지막 15분 동안 수조에서 0.25%의 트립신-EDTA를 예식합니다.인큐베이션을 따라 1분 동안 유리 파스퇴르 파이펫으로 세트리어트튜브를 소용돌이시다. 조직 조각이 정착 한 후, 새로운 FBS 코팅 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 해리 된 세포의 첫 번째 컬렉션을 포함하는 상피. 370회 G와 섭씨 4도에서 5분간 상체를 회전하여 세포를 펠릿합니다.결과 상체를 제거한 다음 FACS 버퍼에서 셀 펠릿을 다시 중단하고 얼음 위에 보관하십시오. 원래 2 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 인간의 fungiform의 맛을 용의자 전지의 장기 문화를 분리하고 관리하기위한 재현성 프로토콜을 개발하기위한. 생검에 의해 얻은 인간 fungiform 용의자의 세포가 성공적으로 생존 능력의 손실없이 더보다 여덟 구절 (12 개월) 동안 문화를 유지했다.

인간 Fungiform의 맛 용의자 전지의 분리 및 문화

이 비디오에서는 쥐의 혀에서 상피 세포를 분리하는 방법에 대해 설명합니다. 이러한 세포는 세포 콜로니를 발생시키기 위해 추가로 배양될 수 있습니다.

쥐 혀 상피 세포의 분리 및 배양: 마우스 모델에서 혀 상피 세포를 분리하고 배양하는 절차

이 비디오에서는 쥐 혀에서 CVP(circumvallate papillae) 상피를 분리하는 방법을 설명합니다.

마우스 모델에서 CVP(Circumvallate Papillae) 상피의 분리: 마우스 혀에서 CVP 상피를 분리하는 효소 절차

줄기세포 유래 배양은 감염병을 모델링할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 여기에서는 성체 줄기 세포에서 유래한 마우스 및 인간 위 오가노이드의 배양에 대해 설명합니다. 오가노이드에는 위 병원균인 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori)가 미세주입됩니다.

감염증에 대한 모델로 Organoids : 헬리코박터 파이로리의 인간의 문화와 쥐 위장 Organoids 및 미세 주입

이 논문은 전체 및 그대로 미각 (내면의 신경 섬유 포함)을 일관되게 산출하고 미각과 주변 유두 내의 구조 사이의 관계를 유지하는 전체 곰팡이, 둘레 및 미각 미각의 조직 준비, 염색 및 분석을위한 방법을 설명합니다.

곰팡이, 둘레 및 미각 미각의 전체 마운트 염색, 시각화 및 분석

우리는 배아와 성인 마우스 혀의 상피 및 중간/ 결합 조직에서 대량의 고품질 단일 세포를 해리시키는 일반화 프로토콜을 개발했습니다.

배아의 날 12.5 및 8 주 된 마우스의 혀 상피 및 메센키메 / 결합 조직에서 세포 해리

Trowell 형 장기 배양 방법은 치아 발달을 제어하는 복잡한 신호 네트워크를 밝히고 최근에는 지속적으로 성장하는 마우스 앞니의 줄기 세포와 관련된 조절을 연구하는 데 사용되었습니다. 형광 리포터 동물 모델과 라이브 이미징 방법은 치과 줄기 세포와 특정 틈새 미세 환경에 대한 심층 분석을 용이하게합니다.

치아 줄기 세포의 조절 연구를 위한 트로웰형 장기 배양 사용

본 프로토콜은 성인용 마우스 입맛에서 파생된 구강 각질 세포의 격리 및 배양을 설명합니다. 면역스테인링을 이용한 평가 방법도 보고된다.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

이 프로토콜은 화학적 발암을 통해 유도된 정상, 전종양 및 편평 세포 암종 병변을 나타내는 쥐 구강-식도 3D 오가노이드를 생성하고 특성화하는 주요 단계를 설명합니다.

3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링

여기에서 우리는 전체 뇌 또는 telencephalic, tectal 또는 성인 zebrafish의 뇌의 소뇌 영역 중 하나에서 파생 neurosphere 분석을 사용하여 성인 신경을 검사 할 수있는 재생 가능한 방법을 제공한다. 또한, 우리는 제브라 피쉬 neurosphere를 유전자 발현을 조작하는 절차를 설명한다.

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

배우세요 성인 마우스 CVP에서 맛 줄기 세포를 분리하여 언어 오르가노이드를 생성하는 방법을. FACS로 Lgr5-EGFP 양성 세포를 선별하고 3D 배양하여 맛 수용체 세포 분화를 연구할 수 있습니다.

성인 마우스 맛 줄기 세포에서 파생 된 언어 오르가노이드의 생성 및 배양

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