Name: VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: 학습하세요 VMXm 빔라인에서 단일 결정 저온결정학을 위한 10μm 미만 단백질 미세 결정 샘플 준비 및 장착 프로토콜. 글로우 방전 처리, 자동 플런지 동결, 정밀 블로팅을 통해 배경 소음을 최소화하고 신호 대 잡음비를 향상시키는 방법을 배우세요.

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저자는 제레미 키운, 존 그리미스, 제프 서튼과 데이브 스튜어트, 옥스포드와 레이첼 볼턴, 친절하게 빔 라인의 시운전을 가능하게뿐만 아니라 VMXm 빔 라인에 대한 샘플 준비 방법의 개발 및 데모를위한 미세 결정 샘플을 제공하는 사우샘프턴 대학 감사합니다. 저자는 또한 이 원고를 출판할 기회와 지원에 대해 iNEXT-Discovery(프로젝트 번호 871037)에게 감사를 표하고 싶습니다.

1. 장비 설정
참고 : 여기에 설명 된 방법은 하나의 블로팅 팔과 플런지 동결 악기를 사용합니다. 일부 악기에는 두 개의 블로팅 암이 장착되어 있으며 제조업체의 지침에 따라 기기를 조정하여 단 한 개의 블로팅 팔만 사용할 것을 권장합니다.
<ol><li>가벼운 현미경이 플런지 동결 기기 근처에 위치하여 현미경과 플런지 냉동고가 모두 사용자의 손이 닿지 않도록 하십시오.</li>
	<li>제조업체의 지침에 따라 자동 플런지 냉동고를 설정하고 식힙니다. 참고: 샘플 챔버 온도는 결정이 커서 재배된 온도로 설정해야 합니다. 샘플 챔버에 얼룩진 용지를 놓지 마십시오. 주의: 액체 에탄은 매우 인화성 폭발성이며 잠재적인 스파크 소스에서 멀리 떨어진 통풍이 잘 되는 지역에서만 사용해야 합니다.</li>
	<li>그리드 박스에 적절히 라벨을 부착하고 액체 질소를 사용하여 작은 분해로 냉각하십시오.</li>
	<li>조심스럽게 그리드, 탄소 필름 측면을 위로 배치, 빛 배출에 적합한 캐리어에 (예 : 파라 필름에 싸여 유리 현미경 슬라이드등).</li>
	<li>15mA의 전류를 이용하여 0.39mBar에서 25s에 대한 글로우 방전 극저온 그리드. 그리드를 사용하기 직전에 글로우 방전. 빛이 배출된 격자를 페트리 접시에 넣을 때까지 보관하십시오. 광선 배출 후 30분 경과하면 광선 배출을 반복합니다. 참고: 플런지 냉동고가 준비되고 그리드가 준비되면 주의가 샘플로 바뀔 수 있습니다.</li>
</ol>2. 초기 블로팅 매개 변수 결정
<ol><li>샘플 챔버의 상대 습도를 90%로 설정하고 블로팅 시간을 5s로 설정하고 플런지 냉동고가 블로팅이 완료된 후 자동으로 시료를 급락하도록 설정되어 있는지 확인합니다. 참고: 이러한 시작 매개 변수는 라이카 GP 플런지 냉동고에 가장 적합하며, 블로팅 힘과 같은 다른 매개 변수는 FEI Vitrobot에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 우리의 경험에서 크리스탈 무결성은 단일 블로팅 팔의 사용에 의해 유지 될 가능성이 높습니다.</li>
	<li>잘 열리면 결정화 트레이를 밀봉할 수 있도록 작은 테이프 스트립을 자르고 한쪽 끝에 접어 밀봉의 개구부를 용이하게 하고 조심스럽게 한쪽에 배치할 수 있는 탭을 만듭니다.</li>
	<li>저수지를 포함하여 결정화 위에 씰을 잘 열어 잘라냅니다. 신속하게 작동하면 낙하시 액체 부피를 유지하기 위해 드롭을 포함하는 결정에 2-5 μL의 저수지 용액을 적용하십시오.</li>
	<li>테이프 탭을 사용하여 우물을 다시 밀봉하고 결정화 드롭이 건조되지 않도록 하십시오.</li>
	<li>순간적으로 테이프를 결정화 위에 잘 열어 두는 동안, 저수지 용액의 10 μL을 0.5mL 튜브로 전송하여 나중에 단계로 사용하십시오.</li>
	<li>우물을 다시 밀봉합니다.</li>
	<li>플런지 동결 기구의 블로팅 암에 미리 잘라낸 블로팅 용지 한 조각을 놓습니다.</li>
	<li>급락 에 단일 광선 배출 그리드를 배치 하여 집게를 동결하고 탄소 측이 블로팅 팔에서 멀리 직면하도록 기기에 적재합니다.</li>
	<li>블로팅 챔버 내의 상대 습도가 90%인지 확인합니다.</li>
	<li>스포프를 회전하여 탄소 필름 측이 블로팅 암을 향하도록 합니다.</li>
	<li>2.5 μL 파이펫을 사용하여 0.5mL 튜브에서 냉동TEM 그리드의 비지지성(빛나는 구리) 측에 2μL의 저수지 용액을 적용합니다.</li>
	<li>탄소 지지측이 블로팅 암에서 멀리 향하도록 그리드를 회전시키고 공정을 반복하여 그리드의 탄소 필름 지지측에 액체를 조심스럽게 가두십시오. 탄소 필름을 손상시키지 않도록 파이펫 팁으로 탄소 필름을 만지지 마십시오. 액체는 광선 배출 중에 증착된 충전으로 인해 그리드 전체에 퍼져야합니다.</li>
	<li>그리드를 관찰하면서 블로팅 프로세스를 시작합니다. 보기 범위는 이를 위해 라이카 GP2에서 확인할 수 있습니다.</li>
	<li>이 기간 동안 그리드의 탄소 표면에서 액체가 유입되는지 여부를 관찰하면, 이것은 액체가 그리드를 통해 사악할 때 그리드의 대부분의 액체 볼루스가 평평해지는 것으로 시작됩니다. 각 그리드 사각형의 액체가 더 감소함에 따라 그리드 표면을 가로질러 '터지는' 파도를 관찰할 수 있습니다. 이 효과가 관찰되면 터지는 효과 결말의 2-3 s 이내에 블로팅을 중지할 수 있습니다. 버릴 수 있는 테스트 그리드를 급락할 필요는 없습니다.</li>
	<li>소위 '터지는' 효과가 관찰되지 않으면, 2.11-2.14단계를 반복하며, 매 번 블로팅 암이 그리드에서 후퇴하기 직전에 터지는 효과가 관찰될 때까지 블로팅 시간을 1-2로 연장한다. 3단계에 대해 이 시간을 유의하십시오. 참고: 이 터지는 효과가 생기자마자 블로팅이 멈추는 것이 중요하며, 공정 중에 크리스탈이 과도하게 블로팅으로 인해 탈수되지 않도록 하는 것이 중요합니다. 결정이 일관된 용액의 적용을 받을 수 있도록 하여 결정화 위험을 줄이므로 샘플의 백 블로팅 및 희석을 위해 저장소에서 결정화 용액을 사용합니다.</li>
</ol>3. 크리스탈 수확
<ol><li>결정화 플레이트를 광 현미경 아래에 놓고 대상을 시야 내에 잘 배치합니다.</li>
	<li>플런지 냉동고 집게에 신선한 광채 배출 그리드를 놓고 플런지 냉동고에 집게를 장착하고, 탄소 필름 면은 블로팅 암에서 멀리 향합니다.</li>
	<li>스포프를 회전하여 탄소 필름 측이 블로팅 암을 향하도록 합니다.</li>
	<li>2.5 μL 파이펫을 사용하여 0.5mL 튜브에서 극저온TEM 그리드의 비지지측에 2μL의 저수지 용액을 적용하고 그리드를 회전하여 탄소필름 지지측이 플런지 냉동고의 샘플 포트를 향하고 있다.</li>
	<li>임시 씰을 다시 껍질을 벗기고 파이펫을 2 μL로 설정하고 결정화 방울을 반복적으로 흡계하여 미세 결정을 중단합니다(방울에 기포를 도입하지 않는 것이 중요합니다). 참고: 어떤 표면 피부 또는 우물의 기지에서 결정이 방출되는지 확인하기 위하여 빛 현미경의 밑에 이 과정을 관찰하는 것이 중요합니다. 결정이 붙어 있고 포부로 작성되지 않으면 파이펫 팁 또는 침술 바늘과 같은 다른 결정화 도구를 사용하여 결정을 부드럽게 제거하는 데 사용할 수 있습니다. 결정의 크기와 광 현미경의 필드 깊이에 따라, 때로는 현미경, 피펫 팁을 입력 하는 결정을 사용 하 여 볼 수 있다.</li>
	<li>흡량제 미세 결정 슬러리의 2 μL을 플런지 냉동고에 옮기고 모든 샘플을 극저온TEM 그리드의 탄소 측에 적용합니다.</li>
	<li>2단계에서 결정된 시간 동안 블롯은 즉시 플런지 동결을 시작합니다. 블로팅하는 동안 그리드 전체에서 터지는 파 효과의 발생을 관찰하고 이것이 그리드 를 가로 질러 완전히 발생했는지 여부를 기록하십시오. 결정의 존재는 초기 블로팅 시간에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 1-2 초까지 후속 그리드에 대해 조정해야 할 수도 있습니다.</li>
	<li>신속하게 작동하여 액체 에탄에서 액체 질소에 침지된 그리드 박스로 그리드를 전송합니다. 잔류 에탄은 액체 질소에 들어갈 때 그리드에 불투명한 흰색 고체로 전환 할 수 있습니다. 이를 줄이려면 액체 에탄에서 그리드를 꾸준히 제거한 다음 액체 질소 저장소로 신속하게 전달합니다.</li>
	<li>그리드 박스에 4개의 그리드가 배치되면 나사로 상자 뚜껑을 고정하고 액체 질소의 거품 분해로 전송하여 스캐닝 전자 현미경(SEM)을 이용한 추가 샘플 평가를 허용하거나 적절한 저장 용기를 사용하여 액체 질소 저장 분해로 전송합니다.</li>
</ol>4. 빛 현미경 검사법에 의한 샘플 밀도 평가
주의: 이 방법은 파괴적입니다. 하나 또는 두 개의 결정화 물방울과 같은 시료의 가용성이 제한된 경우 이 단계를 건너 뛰는 것이 좋습니다. 급락 동결 시료(step 3.7) 후 그리드를 가로지르는 결정분포를 평가할 수 있다.
<ol><li>플런지-냉동고 집게에 건조하고 실온 극저온 그리드를 장착하고, 시야에 그리드를 장착하여 가벼운 현미경에 집게를 배치합니다. 전체 그리드와 개별 그리드 사각형을 해결할 수 있도록 적절한 배율및 포커스를 설정합니다.</li>
	<li>3.1-3.7 단계를 따르십시오.</li>
	<li>그리드 박스(3.8단계)로 그리드를 전송하는 대신 플런지-냉동고를 재설정하여 액체 에탄에서 급락한 그리드를 철회합니다. 주의: 그리드와 샘플은 실온으로 따뜻해지며 추가 회절 실험에는 사용할 수 없습니다.</li>
	<li>플런지 동결 기기에서 집게를 제거합니다.</li>
	<li>집게 내에서 그리드를 유지하는 동안, 빛 현미경 아래에 그리드를 배치 - 초점은 이미 대략 설정됩니다.</li>
	<li>미세 한 초점을 수행하고 그리드에 걸쳐 결정의 밀도를 평가합니다. 좋은 그리드는 각 그리드 정사각형 내의 그리드 바에서 떨어져 몇 가지 격리 된 결정을 포함하고 결정의 응집은 최소화됩니다.</li>
	<li>그리드 내의 결정 밀도가 몇 개의 격리된 결정만으로 결정의 뭉치를 초래하는 경우, 수정 슬러리를 저수지 용액으로 희석시키고 3단계를 반복합니다. 희석이 결정의 용해를 초래하지 않도록 샘플을 희석 할 때주의하십시오.</li>
	<li>0.5-1 μL의 소량을 사용하여 단계에서 결정을 희석시.</li>
</ol>5. 전자 현미경 검사에 의한 샘플 평가
참고: 극저온 그리드에 대한 미세 결정 제제는 극저온 조건 하에서 스캐닝 전자 현미경 검사법(SEM)으로 가장 잘 평가되며, 극저온 스테이지가 장착된 SEM으로 달성할 수 있습니다. VMXm에서는 쿼럼 PP3006 에어록과 저온스테이지가 있는 JEOL JSM-IT100 SEM(텅스텐 소스)이 활용됩니다. VMXm28,29에서샘플을 볼 때 최소한의 방사선 손상을 보장하기 위해 다음 설정이 사용됩니다: 5 kV 가속 전압; 40의 스팟 크기 (JEOL JSM-IT100에 임의 단위); 10mm 작동 거리. 이미지는 이차 전자 검출기를 사용하여 기록되며, 샘플 정렬및 0.8 μs의 거주 시간을 집중하는 데 사용되며 단결정의 고해상도 이미지는 16 μs의 거주 시간을 사용하여 캡처됩니다. 현미경이 제조업체 지침에 따라 정렬되는 SEM에 샘플을 로드하기 전에 중요합니다. 동일한 매개 변수로 준비된 나머지 그리드는 X 선 회절 실험을 위해 예약되어 있는 동안 단일 그리드만 SEM에 로드됩니다.
<ol><li>제조업체의 지시에 따라 시료 극저온 스테이지를 -180°C로 냉각하여 SEM을 준비한다. cryoTEM 그리드를 사용 가능한 특정 시스템에 로드하는 지침을 따르십시오.</li>
	<li>SEM에 적재된 시료를 사용하여 전자 빔을 켜고 시료를 정렬하고 높은 배율(0.8 μs 거주 시간)을 사용하여 초점을 설정합니다.</li>
	<li>먼저, 낮은 배율(x45)에서 보기에서 그리드 전체와 함께 초기 평가를 수행합니다. 이 배율에 이미지를 기록합니다.</li>
	<li>개별 그리드 제곱을 면밀히 검사할 수 있도록 배율을 높이고 개별 결정은 매우 명확하게 관찰할 수 있어야 합니다.</li>
	<li>그리드 주위를 이동하여 진행 하기 전에 다음 요구 사항을 충족하는 지 확인 의 스틸 이미지 (16 μs 거주 시간)를 캡처합니다.<ol>
<li>그리드가 평평하고 탄소 지원 필름이 대체로 손상되지 않도록 합니다.</li>
		<li>크리스탈을 둘러싼 유리화 액체의 좁은 후광이 있는 수많은 단일 결정이 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>탄소 지지 필름의 구멍이 표시되는지 확인합니다.</li>
		<li>어둡고 매끄러운 외관에 의해 정의된 유리화 된 액체의 큰 영역이 없는지 확인하십시오.</li>
		<li>육각형 얼음이 거의 없거나 전혀 없는지 또는 그리드 에 걸쳐 표면 얼음이 흩어져 있는지 확인합니다.</li>
		<li>결정이 지지필름에 고르게 분포되어 있고 겹치지 않도록 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>이 시점에서 여러 결정의 치수를 정확하게 측정하여 나중에 회절 실험 중에 정확한 X선 빔 크기 상관 관계를 허용합니다.</li>
	<li>SEM에서 안정적으로 검색되고 극저온 온도에서 유지관리할 수 있는 샘플은 나중에 X선 회절 실험에 사용할 수 있습니다. 이것이 불가능한 경우 이러한 샘플을 폐기하십시오. 참고: 전체 그리드와 개별 마이크로결정(각각 약 x45 및 x700 배율)을 이미징하는 동안 동일한 매개 변수를 사용하여 준비된 그리드로 빔라인으로 진행할지 또는 3단계에서 일부 파라미터가 조정해야 하는지 여부에 대한 평가가 이루어져야 합니다. 그리드는 5.5 단계에서 설명된 테스트를 충족해야 합니다. 그리드가 이러한 기준을 충족하지 못하면 5단계를 반복하기 전에 3단계에서 추가 최적화가 필요합니다.</li>
</ol>6. VMXm에서 회절 실험을 위한 그리드 준비
<ol><li>액체 질소를 사용하여 대형 발포 제와르(도 4B)에서 샘플 로더(도4B)로샘플 카트리지(뚜껑 포함)에 적재된 VMXm 샘플 홀더(도4A)(최대5개)의 필수 수를 냉각-이는 액체 질소의 대량을 요구할 수 있다. 액체 질소 수준은 샘플 로더의 샘플 위치 바로 위에 있어야 합니다.</li>
	<li>circlips 및 도구를 준비합니다.</li>
	<li>클리핑 도구, 집게 및 VMXm 샘플 집게를 포함한 도구를 샘플 로더의 구멍에 배치하여 식힙니다. 그것은 dewar 위에 스포트라이트를 배치하는 것이 유용 할 수 있습니다.</li>
	<li>마이크로크리스탈로드 그리드가 포함된 그리드 박스를 샘플 로더의 그리드 박스 오목으로 신속하게 전송하고 뚜껑을 풀어 느슨하고 회전할 수 있도록 (제거하지 않음).</li>
	<li>액체 질소하에서 큰 집게로 샘플 카트리지에서 뚜껑을 제거하고 샘플 로더 아래에 놓습니다.</li>
	<li>VMXm 샘플 집게를 사용하여 샘플 홀더를 샘플 로더에 들어 올려 홀더가 위쪽으로 향하여 그리드를 수락할 수 있도록 합니다. 올바른 위치에 있는 경우 샘플 로더의 작은 핀이 샘플 홀더 중간에 있는 작은 구멍과 결합합니다.</li>
	<li>냉각된 미세 집게를 사용하여 그리드 박스에서 그리드를 조심스럽게 들어 올리고 샘플 홀더의 그리드 개구부에 가깝게 전송합니다. 그리드를 회전하여 평평하게 배치되도록 합니다(지원 필름 측이 어떤 방식으로 향하고 있는지는 중요하지 않습니다).</li>
	<li>그리드가 그리드 개구부 위로 가능한 한 가까이 되도록 집게를 부드럽게 낮추고 그리드를 개구부로 놓습니다. 그리드가 제대로 앉지 않으면 미세 한 집게를 사용하여 그리드를 제자리에 고정하거나 더 큰 집게로 샘플 홀더를 부드럽게 누릅니다.</li>
	<li>미리 냉각된 순환 도구를 그리드 개구부그리드 위에 신속하게 배치하고 버튼을 눌러 서클립을 앉힙니다. circlip이 제대로 앉아 있는지 확인하기 위해 버튼의 우울증 2개를 적용하는 것이 도움이 될 수 있습니다.</li>
	<li>액체 질소를 위로 올려 레벨이 샘플 홀더 위에 ~ 1.5 cm 가되도록합니다. VMXm 샘플 집게를 사용하여 로드된 샘플 홀더를 샘플 로더의 작은 핀 위로 들어 올려 샘플 카트리지로 다시 들어올립니다. 샘플 카트리지의 샘플 홀더의 위치 번호를 기록합니다.</li>
	<li>모든 샘플이 로드될 때까지 샘플 홀더에 그리드를 계속 로드합니다.</li>
	<li>샘플이 내부에 남아 있는 경우 그리드 박스를 저장소 분해로 반환하고 데워에서 샘플 로더를 제거하여 더 많은 공간을 만듭니다.</li>
	<li>카트리지의 카트리지 뚜껑을 교체하여 카트리지 상단의 핀이 뚜껑의 구멍과 결합되도록 합니다.</li>
	<li>시원하고 액체 질소로 VMXm 에어록 드워드를 채우고 로드 된 샘플 카트리지를 포함하는 거품 분해 옆에 놓습니다.</li>
	<li>VMXm 카트리지 도구를 사용하여 카트리지 측면의 능선에 공구를 조심스럽게 참여시키고 카트리지를 에어록 데워로 신속하게 들어올립니다.</li>
	<li>액체 질소 수준이 카트리지를 덮는지 확인합니다.</li>
	<li>에어록 디워드에 뚜껑을 놓고 로드된 샘플 카트리지가 있는 VMXm 엔드스테이션으로 진행합니다. 참고: 샘플 카트리지를 VMXm 엔드스테이션에 로드하면 빔라인 직원이 수행됩니다.</li>
</ol>

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</ol>

선언할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 cryoTEM 샘플 준비의 도구가 마이크로 포커스 빔라인에서 X 선 회절 실험을 위한 미세 결정의 제조에 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다. 표준 빔 라인 계측은 핀 장착 샘플을 중심으로 하고 마이크로 결정에 대한 이러한 마운트에 샘플 지원을 제공하기 위한 노력이 이루어지고 있지만, 가장 높은 신호 대 잡음을 달성하면서 시료로 로드하기가 어려운 경우가많습니다(그림 1C,D). 이러한 샘플의 대부분은 또한 샘플이 유리체인지 확인하기 위해 극저온 보호 조건의 최적화를 요구할 수 있습니다. 플런지 동결 방법은 효율적인 극저온(도1A,B)에서시료를 냉각시키고 여분의 액체를 제거하고 플래시를 냉각하는 반복 가능한 방법을 제공한다. 그런 다음 그리드를 트위저 기반 핀 마운트가 있는 표준 빔라인에 장착할 수 있지만 VMXm 샘플 홀더는 전도성 냉각을 통해 진공 환경에서 그리드를 수용하고 유리 전이 온도 이하로 유지하도록 특별히 설계되었습니다. VMXm의 샘플 환경은 샘플이 배경의 나머지 소스인 낮은 배경 데이터 수집을 가능하게 하며, 10μm 미만의 치수와 결정과 일치시키는 데 사용할 수 있는 마이크로빔을 제공합니다. 이 샘플 준비 방법은 또한 전자의 약한 침투로 인해 거의 과잉 액체 및 유리체 시료에 대한 요구 사항이있는 전자 회절을위한 나노 결정을 준비하는 데 사용할 수 있습니다. cryoTEM 그리드는 깨지기 쉽지만, 루프에서 크리스탈을 수확하는 경험이 있는 사람들은 그리드 처리에 빠르게 적응할 것입니다. 소량의 경험을 통해 프로토콜의 블로팅, 동결 및 로딩 단계에서 그리드가 손실되는 것은 거의 없습니다. 최적화 단계는, 그러나, 이 성공과 신중한 준비에 중요한 결정은 결정을 분실하거나 결정 무결성을 감소의 기회를 줄일 수 있습니다.
CryoTEM 그리드는 수백 개의 결정을 포함할 수 있는 비교적 큰 단일 마운트를 제공하므로 작은 회절 데이터만 기록할 수 있는 처리량을 개선합니다. 단일 그리드는 또한 단백질 구조를 결정하기에 충분한 결정을 제공할 수 있습니다, 특히 높은 대칭의 결정에서. 하나 또는 두 개의 단일 결정화 방울만 미세 결정을 생성한 경우, 결정화 조건의 시험 블로팅만으로도 미세 결정이 만연할 때 사용되는 시간이 초기 양호한 품질의 샘플을 생성하는 데 필요한 시간과 최대한 가깝습니다. 카본 필름 지지대는 X선에 보이지 않으며 특정 형태에 맞게 사용할 수 있는 다른 구멍 간격으로 사용할 수 있습니다. 우리는 2 μm 간격에서 2 μm 구멍이있는 지원 필름을 가장 일반적으로 활용하지만 간격이 큰 작은 구멍은 2 μm보다 작은 결정에 더 적합 할 수 있습니다. 4 μm 간격을 가진 1 μm 구멍이있는 것과 다른 모양의 구멍이있는 지원 필름과 같은 다른 지원 필름을 사용할 수 있으며, 모두 블로팅 시간에 영향을 미칩니다. 그리드 사각 메쉬 크기는 200(인치당 200제곱)으로 구리 그리드 바 사이에 충분한 공간(~100 μm)을 제공하여 X선 빔이 구리와 강하게 상호 작용하지 않도록 하면서 도정이 장착된 탄소필름에 충분한 구조적 지원을 제공한다. 액체 에탄의 사용은 냉동 보호제에 대한 필요성을 부정, 이는 차례로 냉동 보호 조건의 최적화에 사용 되었을 샘플 볼륨에 대한 요구 사항을 감소.
공정 중에 최적화해야 할 주요 매개 변수는 블로팅 시간과 샘플 희석입니다. 블로팅 시간은 급락 동결전에 그리드 전체에 걸쳐 '터지는'효과를 관찰할 만큼 충분히 길어야 합니다. 오버 블로팅은 결정의 탈수를 초래할 수 있지만, 샘플 챔버 내의 습도조절은 이 효과를 최소화하는 데 사용된다. 90%의 상대 습도가 사용되는 것이 제안되지만 일부 샘플은 습도를 최적화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 습도는 천천히 물로 포화 될 수있는 블로팅 용지의 블로팅 효율에 영향을 미칠 수 있습니다. 또한, 시료 챔버 내의 습도 제어는결정(30)의회절 품질을 향상시키는 데 사용될 수 있다. 회절 품질이 저하되지 않도록 회절 무결성을 확인하기 전에 습도의 작은 변화(<5%)가 이루어지는 것이 좋습니다.
귀중하지 않은 시료의 최적화는 SEM 대신 광 현미경을 사용하여 수행될 수 있다. 파괴적이지만 그리드 전체의 결정 밀도를 평가하고 샘플을 희석하거나 그리드 전체에 걸쳐 결정을 더 잘 분산시키기 위해 집중되어야 하는지 여부를 결정하는 데 유용합니다. 이 단계는 사용 가능한 결정의 많은 수와 특히 고농축 샘플이있을 때 가장 유용합니다. 결정의 함께 응집하는 것을 피해야한다(도 3),데이터 수집동안동시에 두 결정이 동시에 조명되는 경우 중요한 문제가되지 않지만, 따라서 신호 - 투 - 잡음을 감소, 덩어리를 둘러싼 액체의 큰 볼륨이있을 가능성이있을 것이다(도 5). 광 현미경을 사용하여 전 세계적으로 액체의 큰 과잉을 관찰할 수 있지만, 마이크로 결정을 둘러싼 액체의 부피와 결정적 얼음의 존재에 대한 평가는 극저온 진공 전달 시스템 및 스테이지가 장착된 전자 현미경을 통해서만 이루어질 수 있습니다. 때로는 그리드에 결정을 적용한 후 블로팅이 발생하기 전에 낮은 점도 솔루션의 결정이 그리드의 한 가장자리를 따라 정착할 수 있습니다. 에틸렌 글리콜의 최종 농도를 50% 까지 추가하면 액적을 통해 결정의 움직임을 늦출 수 있으며, 그리드 전반에 걸쳐 미세 결정의 더 나은 분포를 보장하고 블로팅 시간을 증가시켜 블로팅에 대한 더 큰 제어를 제공한다는 것을 발견했습니다(그림3D).
고분자량 PEG와 같은 점성 침전제가 함유된 일부 결정화 솔루션은 블로우에 도전적일 수 있으며, 점점 더 긴 블로팅 시간(>10s)이 필요합니다. 이러한 경우, 그리드의 지지막 측에 대한 액액을 함유하는 결정의 부피뿐만 아니라 그리드 의 뒷면에 증착된 액체의 부피를 감소시키는 데 도움이 될 수 있다. 블로팅 용지 또는 유리 섬유의 2층을 사용하는 것과 같은 전략은 또한 이러한 어려운경우(31)에블로팅을 돕는 데 도움이 될 수 있다.
이 파이프라인은 용해성 단백질 결정에 적합하지만 LCP의 멤브레인 단백질과 같은 매우 점도있는 배지에서 형성하는 파이프라인은 이 프로토콜이 적합하지 않은 다른 과제를 제시합니다. 그러나 LCP에 위상 변경을 유도하여 시료의 점도를 줄이는 것을 포함하는 마이크로에드용 극저온TEM 그리드에 대한 LCP 결정을 준비하기 위한 전략이 부상하고 있습니다. 이렇게 하면 샘플이 이 문서에 설명된 것과 유사한 방식으로 그리드에 적용할 수 있습니다. 마지막으로, 시료는 과도한 비결정재료(32,33,34)를제거하기 위해 집중된 이온 빔으로 분쇄될 수 있다.
전반적으로, 이 파이프라인은 일반적으로 VMXm에 도착하는 샘플에서 시료 가용성, 결정의 농도 및 결정화 용액의 점도에 따라 잘 분산되고 유리화된 샘플을 갖춘 최적화된 그리드를 제공하기 위해 1-2h(장비 설정 시간 포함)를 사용합니다. 이러한 방법은 이미 시료를 둘러싼 최소한의 액체가28,35인마이크로결정상 방사선 손상을 탐구하는 X선 회절 실험을 위한 미세결정 의제조를위해 성공적으로 채택되었다. 프로토콜은 이미 최적화된 시료뿐만 아니라 모든 수용성 미세 결정 샘플에 적용될 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 미세 결정 물질을 생산하는 결정화 실험은 전통적으로 더 큰 결정을 얻기위한 목적으로 최적화의 대상이 될 것이지만, 이러한 샘플 준비 방법 및 VMXm의 기능은 추가 최적화없이 이러한 샘플에서 적절한 데이터를 수집 할 수 있습니다. 또는, 이러한 미세 결정 샘플이 제대로 확산되는 경우, 이 샘플 준비 방법을 사용하여 VMXm에서 수집된 데이터는 여전히 결정화 조건의 추가 최적화를 위한 유용한 가이드역할을 할 수 있다. 글로우 배출 및 급락 동결을 포함한 그리드 를 준비하는 도구는 이제 극저온TEM 실험을 위한 연구 기관에서 널리 사용되고 있으며, 많은 사용자가 VMXm에서 빔타임에 앞서 샘플을 준비할 수 있도록 할 수 있습니다.

거대 분자 결정학 (MX)에 의한 생물학적 분자의 고해상도 구조의 결정에 대한 주요 장벽은 절름발이 크기로 잘 확산 결정의 생산 남아있다. 재조합 단백질 유전자 구조 설계에서 부터 초기 결정2를생성할 수 있는 화학 칵테일검색에 이르기까지 이러한 목표를 달성하기 위한 많은 전략이 있다. 후자의 경우, 결정화래퍼가 구조 결정 연구3에충분한 회절 품질과 크기로 결정을 얻기 위해 초기 안타를 최적화해야 하는 경우가 많다. 이러한 옵션에도 불구하고, 일부 표적 분자는 큰 생성하지 않을 수 있습니다 (>10 μm), 잘 diffracting 결정과 그 결과로 결정화는 자신의 미세 결정과 이러한 샘플이 존재하는 도전으로 인내해야합니다. 여기에는 결정을 적절히 장착하고 냉동을 보호하며 본질적으로 약한 회절과 향상된 방사선 민감도를 관리합니다. 미세 결정은 더 큰 결정 보다는 더 적은 단위 세포 및 분자에서 형성되고, 이와 같이, 회절은 더 큰 결정에 비해 동일한 정도로 증폭되지 않으며, 본질적으로 약한 회절 강도의 결과로. 배경 신호가 이러한 반사를 가리는 것이 중요하며, 특히 약한 반사 강도를 잃을 수 있는 높은 해상도에서4. 또한, 미세 결정은 방사선 손상에 더 민감하며 액체 질소 온도5에서회절을 기록했음에도 불구하고 단일 결정으로부터 완전한 데이터를 수집할 수 없을 수 있으므로 매우 많은 수의 결정으로부터 데이터를 수집하여 단일 완전한 데이터 집합6을생성할 필요가 있다.
X선 무료 전자 레이저(XFEL)의 가용성증가와 연쇄 결정예법(SFX)7의 진화는 작은 미세 결정으로부터 데이터를 수집하는 경로를 제공했습니다. 그러나, 이들은 실험이 실온으로 제한되고 일반적으로 샘플 소비가 높고 (수백 개의 마이크로리터)가 높고 여전히 추가최적화가필요할 수 있는 상당한 양의 하드웨어 및 소프트웨어 전문 지식이 필요한 맞춤형 샘플 전달 방법입니다. 따라서 제한된 양의 미세 결정만 만들 수 있는 프로젝트는 SFX에 적합하지 않습니다.
한편, 최근 수십 년 동안 싱크로트론 빔라인 기술은 더 작고 안정적인 빔9를 생산하는 데 발전해 왔으며, 그 결과 더 작은 결정10,11에서데이터 수집을 허용했습니다. 다이아몬드 광원의 NSLS-II 및 I24의 FMX와 같은 마이크로 포커스 빔라인은 최대 치수 ~3 μm12의 결정에서 새로운 구조를 결정하고 ~ 1μm13을측정하는 작은 결정에서도 사용 가능한 데이터를 수집하는 능력을 입증할 수 있었다. 빔라인은 우수하고 고해상도의 축 보기 광학, 샘플 회전을 위한 최소한의 혼란 구, X선 빔과 일치하는 정확하게 정렬된 회전 축으로 정확하게 구성되어야 합니다. X선 빔 프로파일을 결정 부피와 밀접하게 일치시키고 크리스탈 <5 μm14의과제인 X선 빔에 수정이 정확하게 정렬되도록 하는 것이 중요합니다. 빔라인에서 이러한 실험 조건을 충족하는 것은 미세 결정에서 최상의 품질의 데이터를 기록하는 데 필수적입니다.
마이크로 결정에서 데이터 수집의 나머지 와 아마도 가장 중요한 측면은 X 선 빔에 크리스탈의 프리젠 테이션입니다. 마이크로 크리스탈은 종종 10 μm15,16의작은 조리개를 가진 낮은 X 선 산란 재료, 폴리이미드에서 제조 된 마이크로 메쉬 샘플 마운트에 장착되었습니다. 폴리이미드 메쉬는 마그네틱 SPINE 베이스로 설정된 표준 핀에 장착되어 대부분의 MX빔라인(17)과호환됩니다. 메쉬 마운트는 표준 루프 스타일 마운트를 사용하여 100 μm 크리스탈을 장착하는 것과 동일한 절차를 따르는 결정화 낙하에서 크리스탈을 어획하는 데 사용됩니다. 결정이 메쉬 를 통해 분배될 수 있지만, 수확하는 동안 메쉬와 핀에 의해 상대적으로 많은 양의 액체를 운반할 수 있다는 것이 주요 단점이다(도1C,D). 결정 자체보다 몇 배 더 클 수 있는 이 액체의 양은 X선으로 비춰질 때 배경 소음에 기여할 것입니다. 이 배경 분산은 액정이 플래시 냉각 중에 결정성 얼음을 형성하면 더욱 강해질 수 있으며, 얼음 회절 의 해상도 내에서 이미 약한 강도의 신호 대 잡음 비율이 감소합니다. 따라서, 가능한 모든 신호를 기록할 수 있도록 시료에서 여분의 액체를 제거하는 것이 중요합니다. 이러한 과제는 LCP가 강한 배경 분산을 생성하고 또한 결정(18)주변에서 제거하기 어려운 지질 입방상(LCP) 내에 형성된 막 단백질 결정의 경우 더욱 크다.
다이아몬드 광원의 새로운 다목적 매크로 분자 결정 마이크로 포커스 (VMXm) 빔라인은 잠재적으로 크기미크론 미만을 측정 크리스탈에서 데이터를 수집하는 조건을 제공합니다. 빔라인은 0.3 μm x 0.5 μm(VxH)1,60nm 이하의 혼동구가 있는 고니오미터 및 바쿠오 샘플 환경을 측정한 빔 프로파일을 제공하도록 설계되었습니다. VMXm 엔드스테이션의 이러한 설계 특징은샘플(14)에의해 생성된 가장 큰 남은 배경소스와 함께 데이터 수집 중에 빔라인 장치에 의한 배경 X선 노이즈생성을 최소화한다.
VMXm 빔라인을 위해 설계된 특정 샘플 준비 방법은 이러한 배경을 줄이고 회절 데이터의 신호-잡음을 더욱 개선하여 <10 μm을 측정하는 미결정에서 기록할 수 있는 데이터의 품질을 극대화할 수 있는 기회를 제공합니다. 마이크로 결정에서 낮은 배경 회절에 대해 여기에 설명된 많은 요구 사항은 극저온 투과 전자 현미경 검사법(cryoTEM)19 및 마이크로결정 전자 회절(microED)20에도일반적이다. 그 결과, 이미 cryoTEM 샘플의 준비를 위해 개발된 많은 도구는 마이크로 결정의 준비를 위해 일부 적응과 함께 적합합니다. 단일 입자 극저온TEM을 위한 시료의 제조에서, 조사 중인 입자는 전자가 견본을 통해 전송할 수 있도록 유리체 얼음의 매우 얇은 층(일반적으로 <100 nm)에 내장되어 있습니다. 얇은 균일층은 과량의 액체를 멀리 블롯하여 얻어져 시료의 신속한 냉각(~104 Ks-1)21을 통해 ~93 K22에보유된 액체 에탄으로 급락함으로써 달성된다. 대조적으로, 액체 질소는 MX 견본 준비에 일상적으로 사용되는, 에탄 보다는 보다 보다 덜 효율적인 극저온이고 견본21내의 결정적인 얼음 형성을 위한 더 중대한 성향이 있습니다. 회절을 저하시키고 배경 소음을 생성할 수 있는 결정성 얼음의 형성은 일반적으로 저온보호화합물(23)의사용을 통해 완화된다. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 400 및 메틸-2,4-펜탄디올(MPD), 당, 오일 또는 포화염과 같은 저분자 폴리머는 저농도24에서결정화 용액의 알리쿼트에 첨가될 수 있으며, 가장 적절한 크라고프로치제를 선택하는 데 '한 가지 크기'의 용액이 없습니다. . 상기 결정은 또한 수확 및 냉동 보호 공정 중에 여러 번조작하여 결정손상을 초래할 수 있으며, 액정 에탄을 활용할 수 있는 기회는 이 단계의 생략을 허용하고 결정의 무결성을 보호하는 데 도움이 된다.
액상 에탄은 시료의 얇음으로 인해 미세결정(<10 μm)에 효과적인 저저온이지만, 특히 결정성 얼음 형성을 방지하는 대안이 있는데, 특히 엄격하게 통제된 습한환경(26)을사용함으로써 결정의 수분 함량을 감소시키는 것을 포함하여, 또는결정(27)의 루프와 표면 모두에서 과도한 액체의 담합을 통해 결정성 얼음 형성을 방지하는 대안이 있다. 그러나, 이들은 다시 견본의 더 중대한 조작을 요구합니다. 냉동고TEM과 같이 액체 에탄으로 자동 블로팅 및 급락 동결을 사용하면 과도한 결정화 용액을 제거하고 조작을 최소화하면서 제어된 방식으로 냉각 마이크로 결정을 플래시하는 수단을 제공합니다.
여기서, VMXm 빔라인의 사용자와 다른 마이크로포커스 빔라인에서 높은 신호-잡음 회절 데이터를 수집할 뿐만 아니라 마이크로에드 실험을 위한 수용성 단백질 결정 및 세제 기반 막 단백질 결정 시료를 준비하는 사람들에게도 유용할 수 있는 프로토콜을 제시한다. 샘플을 준비하고 평가하는 모든 시설은 VMXm에서 사용할 수 있지만, 많은 구조 생물학 실험실은 점점 더 냉동TEM 샘플 준비를 위해 장착되어 있습니다. 그 결과, 일부 사용자는 VMXm에서 빔타임을 위해 샘플을 준비하기 위해 자신의 시설을 사용할 수 있다고 예상합니다.

<table><tbody><tr><td>자동 Cryo-EM 플런지 동결 기기</td><td>Leica 또는 ThermoFisher</td><td>광원</td>이 있는 다양한 <td></td></tr><tr><td>벤치탑 광학 현미경</td><td>다양한</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>블레이드/메스</td><td>Fisher Scientific</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>CryoTEM 구리 200 메쉬 그리드(탄소 지지 필름 포함) 2 &micro; m 구멍</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C16nCu20-50</td><td></td></tr><tr><td>CryoTEM 그리드 보관 상자</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3727</td><td></td></tr><tr><td>ddH2O</td><td>해당 없음</td><td>해당 없음</td><td></td></tr><tr><td>에탄 가스 공급</td><td>해당 없음</td><td></td><td></td></tr> 에<tr><td>틸렌 글리콜</td><td>Acros 유기물</td><td>146750010</td><td></td></tr><tr><td>유리 현미경 슬라이드</td><td>FisherBrand</td><td>12383118</td><td></td></tr><tr><td>유리 페트리 접시</td><td>FisherBrand</td><td>455732</td><td></td></tr><tr><td>글로우 방전 장치</td><td>Pelco</td><td>91000S</td><td></td></tr><tr><td>실험실 포장 필름 (파라 필름)</td><td>Bemis</td><td>HS234526B</td><td></td></tr><tr><td>크고 작은, 미세한 집게</td><td>Agar Scientific</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소 공급</td><td>n / a</td><td>n / a</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>다양한</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>피펫팅 장치</td><td></td><td></td>: 결정화 플레이트를 위한 다양한 밀봉 <td></td></tr><tr><td>테이프.</td><td>분자 차원</td><td>MD6-01</td><td></td></tr><tr><td>중소형 / 중형 액체 질소 듀어</td><td>Spearlab</td><td>다양한</td><td></td></tr><tr><td>스프링 서클립 클리핑 도구</td><td>Subangstrom</td><td>SCT08</td><td></td></tr><tr><td>Whatmann No.1 프리 컷 여과지</td><td>Leica</td><td>16706440</td><td></td></tr></tbody></table>

vmxm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

단일 결정 극저온 결정예촬영을 위한 미세결정(<10 μm)의 장착은 사소한 도전과제를 제시합니다. 다이아몬드 광원1의VMXm 빔라인과 같이 서브미크론에서 미크론에 초점을 맞춘 빔 라인 광학, 빔 안정성 및 가변 빔 크기의 개발과 함께 미세 결정의 데이터 품질 개선이 입증되었습니다. 샘플 환경 개선 및 샘플 준비를 통해 데이터 품질의 추가 개선이 이루어질 것입니다. 마이크로 결정은 본질적으로 약한 회절을 생성하므로 신호 대 노이즈를 개선하는 것은 고품질의 X 선 회절 데이터를 수집하는 데 핵심이며 주로 배경 소음의 감소에서 비롯됩니다. 회절 실험에서 X선 배경 잡음의 주요 소스는 시료 전후의 공기 경로와의 상호 작용, 시료를 둘러싼 과잉 결정화 솔루션, 결정적 얼음의 존재 및 다른 빔 라인 계측 또는 X 선 창으로부터 산란하는 것입니다. VMXm 빔라인은 이러한 모든 소음 원을 줄이기 위한 계측 및 샘플 준비 프로토콜로 구성됩니다.
첫째, VMXm의 진공 시료 환경은 X선 소스와 샘플 사이의 공기 경로를 제거합니다. 다음으로, VMXm의 거대 분자 결정학을 위한 샘플 준비 프로토콜은 극저온TEM에서 적응한 다수의 공정과 도구를 활용합니다. 여기에는 구멍이 뚫린 탄소 지원 필름이 있는 구리 그리드, 액체 에탄을 사용하는 자동화된 블로팅 및 플런지 냉각 로봇이 포함됩니다. 이러한 도구를 사용하면 저소음 지지대에서 최소한의 주변 액체를 사용하여 단일 cryoTEM 그리드에서 수백 개의 미결정 사항을 준비할 수 있습니다. 또한 크리스탈을 둘러싼 남은 액체에서 결정얼음형성을 최소화합니다. X선 회절 실험을 위해 VMXm 빔라인에 샘플을 장착하기 전에 가시광선을 사용하여 용해성 단백질 미세 결정의 품질을 준비하고 평가하는 과정을 제시합니다. 우리는 또한 좋은 품질의 샘플뿐만 아니라 그렇게 할 수있는 추가 최적화 및 전략이 필요한 샘플을 제공합니다.

이 프로토콜의 목적은 회절 신호를 개선하기 위해 최소한의 배경 분산으로 X 선 회절 실험을 가능하게하는 결정을 둘러싼 최소한의 액체로 유리화 된 미세 결정을 달성하는 것입니다. 최소한의 배경 분산을 위해 극저온TEM 그리드에 제조된 미세결정의 예 SEM 이미지가 도 1A, B 및 도 2에도시된다. 균일하게 분포된 단일 결정그리드는 좋은 신호 대 노이즈로 그리드를 가장 효율적으로 사용할 수 있습니다. 그러나, 이것은 일반적으로 그리드 전체에 걸쳐 가능하지 않으며 일부 영역은 어느 정도의 응집력을 표시할 수있다(그림 2A,B). 이러한 응집에도 불구하고 이러한 예제는 여전히 낮은 배경 회절(그림5)을제공하는 단일 격리 결정의 유용한 수를 표시합니다. 여전히 낮은 배경 분산을 유지하는 블로팅 수준은 다를 수 있습니다. 탄소 지지필름의 구멍이 선명하게 보이지만 결정이 수분을 유지하여 수분을 공급하는 등 강한 블로팅이목표(도 2C,D)이다. 그러나, 좋은 품질의 그리드는 여전히 구멍의 위치를 식별 할 수 있어야하지만 지원 필름의 구멍 내에서 일부 액체를 표시 할 수 있습니다(그림 2A, B). 중요한 것은, 이러한 모든 예는 블로팅과 급락 동결 사이의 수분을 유지하기 위해 크리스탈을 둘러싼 액체의 유리화 후광과 단일, 절연 된 결정을 표시합니다.
많은 시료는 추가최적화(도 3)를요구할 수 있으며, 이는 블로팅 시간의 변화 또는 미세 결정의 농도의 변화를 포함할 수 있다. 결정으로 과부하된 그리드는 블로팅 효율이 감소하고 단일 회절이미지(그림 3A, B)에여러 격자가 기록될 수 있습니다. 8% PEG 4000 및 15% 에틸렌 글리콜(도3C)을포함하는 트립신의 경우보다 더 점성 결정화 조건이 더 길어질수록 더 길어질 수 있다(&gt;10s). 반대로, 점도가 매우 낮은 결정화 조건은 블로팅이 발생하기 전에 침전을 유발하는 중력으로 인한 분포 문제로 인해 발생할 수 있으며, 모든 미세 결정이 그리드의 한쪽을 따라 침전되는결과(도3D).
시료의 최적 준비는 VMXm의 전체 기능을 악용하여 고신호-잡음(그림5)으로가능한 한 높은 해상도로 고품질의 X선 회절 데이터를 수집할 수 있습니다. 이러한 샘플은 바쿠오 샘플 환경과 호환되어 회절 이미지에서 평균 배경 수가 매우 낮거나 0이라는 장점이 있습니다. 동결 보호제없이 액체 에탄을 사용하면 얼음 고리(그림 5)가없는 경우 결정이 구리 그리드 바 에 가깝게 놓여 있지만 X 선 빔은 ~ 2.1 Å 및 ~ 1.8 Å에서 구리 분말 회절 링의 결과로 바를 볼 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig01.jpg"> 그림 1: 마이크로 메쉬 마운트 및 cyoTEM 그리드에 미세 결정 장착비교. 2.5 μm을 가로질러 2.5 μm을 측정하는 바이러스 다각형의 급락 냉동 마이크로결정의 스캐닝 전자 현미경 그래프(A, B)5 kV 가속 전압, 39 (임의 단위)의 현물 크기 및 16 μs의 거주 시간. 그리드는 여분의액체(A)로부터자유롭고,결정(B)을둘러싼 액체의 좁은 후광이 관찰된다. 액체 질소에서 플래시 냉각 전에 마이크로 메쉬(20 μm 조리개)에 장착된 동일한 샘플은 빔라인 I24페이스온(C)및측(D)에서축 관측 시스템을 사용하여 관찰된다. 광학왜곡(C)을볼 때 마이크로메시를 가로지르는 액체 두께의 정도를 나타내며, 마이크로메쉬 사이드온(D)을볼 때 더욱 선명하다. C와 D의 빨간색 대상은 X선 빔 위치와 크기를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig02.jpg"> 그림 2: 양질의 샘플의 예. 단일 ~100 μm 그리드 정사각형에서 관찰된 폴리헤드라크리스탈(A). 일부 결정은 약간 뭉쳐 주변 액체의 일부 연결을 보여 주지만, 크리스탈을 둘러싼 작은 액체 후광이있는 많은 격리 된 단일 결정이 있습니다. 약간 더 큰 인슐린 결정(B)측정 ~5 x 5 μm 또한 일부 응집 을 표시 하지만 다시 잘 고립 된 개별 결정. 바늘 결정은 매우 좁은 치수를 가질 수 있으며 이러한 바늘 모양리소지임 결정(C)과같은 마이크로 빔이 필요합니다. 이 결정 (밝은 회색 후광)을 둘러싼 좁은 액체 밴드를 볼 수 있습니다. 최대 수십 개의 미크론까지 큰 미세 결정은 이러한 ~7 μm 단백질제 K결정(D)과같은 극저온TEM 그리드에 잘 장착될 수 있다. 둘 다(C)및(D)와(A)에서낮은 정도에서 탄소 지지필름의 구멍이 선명하게 보이며 액체가 거의 없음을 입증한다. 예를 들어 B에서는 빈 구멍이 관찰되지 않지만 구멍의 위치를 식별할 수 있으며, 이는 액체가 지지필름의 구멍만 채우고 있음을 나타낸다. 이러한 모든 예에서, 구멍이 밝은 회색 모양을 가지고 그리드 사각형 (둥근 내부 사각형)의 가장자리 주위에 액체의 후광을 볼 수 있습니다. 이것은 잘 준비된 그리드의 일반적인 기능입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig03.jpg"> 그림 3: 추가 최적화가 필요한 샘플의 예입니다. 마이크로결정(A, B)로과부하된 그리드는 시료가 지지필름의 구멍을 차단하여 블로팅 효율을 감소시키고, 결정 사이의 표면 장력이 높을수록 더 많은 액체가 남아 있기 때문에 배경 분산을 증가시킬 수 있다. 신호 대 노이즈의 저하뿐만 아니라 정보 손실이 발생하므로 여러 격자가 기록될 가능성이 높습니다. 충분히 길지 않은 블로팅 시간을 사용하거나 점성이 높은 결정화 용액을 사용하면 지나치게젖은 시료(C)가 발생할 수 있으며, 또한 낮은 신호 대 노이즈를 생성할 수 있습니다. 소 인슐린(D)에대한 것과 같은 침전제가없는 결정화 조건은 점도가 매우 낮습니다. 이것은 매우 짧은 블로팅 시간을 초래하지만, 중력의 영향으로 인해 블로팅 전후 및 블로팅 중에 그리드를 가로 질러 결정의 움직임을 초래할 수 있습니다. 이것은 일반적으로 하나의 가장자리(D)를따라 결정의 높은 농도와 크게 빈 그리드결과. 결정 흐름을 줄이고 결정의 분포를 개선하기 위해 그리드에 적용하기 직전에 결정 슬러리에 에틸렌 글리콜과 같은 점성제를 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 이것은 또한 블로팅 시간을 길게 할 수 있으므로 블로팅을 쉽게 관찰 할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig04.jpg"> 그림 4: VMXm에서 샘플 로딩을위한 도구. 맞춤형 도구 세트는 VMXm 샘플홀더(A)를로드하도록 설계되었습니다. 샘플로더(B)는작동 하는 동안 단일 VMXm 샘플 홀더, 그리드 박스 및 공구 저장에 대 한 공간을 가지고 있습니다. 또한 액체 질소의 표면 바로 아래에서 작업할 수 있도록 설계되었으며 샘플카트리지가 아래에 맞도록 허용합니다(B). VMXm 엔드스테이션의 에어록 질소 가스 박스에 맞는 에어록드와르(C)는실험실에서 빔라인 실험 오두막으로 로드된 샘플 카트리지를 채취하는 데 사용됩니다. 오프라인 SEM에서 샘플을 보기 위해, VMXm 샘플 홀더로 구성된 맞춤형셔틀(D)이빔라인에서 사용되는 샘플 홀더에서 평가를 가능하게 하기 위해 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig05.jpg"> 그림 5: VMXm에서 미세 결정에서 실시하는 예. 플런지 동결 방법을 이용하여 극저온TEM 그리드에 장착된 ~3 μm 바이러스 다이발 크리스탈의 VMXm에서 필라투스 3 6M 검출기를 사용하여 기록된 단일 회절 영상. 회절은 1.7Å 를 넘어 관찰되며 1.74 Å에서 반사(파란색 사각형)가 인셋되어 낮은 배경 분산을 나타내며, 0카운트가 있는 픽셀 수가 많다. 에틸렌 글리콜의 최종 농도50% v/v를 결정 슬러리에 첨가한 후 그리드에 적용하였다. VMXm 샘플 위치의 낮은 배경 특성은 광선 센터 근처에서도 파란색 파선 아래에 플롯된 강도에 의해 표시된 대로 이미지 전체의 일정한 배경에 의해 입증됩니다. 플롯된 강도는 배경이 3개 미만으로 남아 있음을 보여줍니다. 2개의 희미한 고리는 2.15 Å 및 1.86 Å에서 관찰되며, 이는 극저온TEM 그리드의 구리의 분말 회절에 의해 생성된다. 검출 가능한 얼음 고리가 없으므로 블롯팅의 효과를 입증한 다음 액체 에탄으로 냉각됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

데이터의 신호 대 잡음 비율은 마이크로 결정에서 X 선 회절 측정을 수행하는 데 가장 중요한 고려 사항 중 하나입니다. VMXm 빔라인은 이러한 실험을 위한 저소음 환경과 마이크로빔을 제공합니다. 여기서는 VMXm 및 기타 마이크로포커스 대식분자 결정학 빔라인에 대한 미세 결정의 장착 및 냉각을 위한 샘플 준비 방법을 설명합니다.

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

표준 샘플 준비로 인해 미세 결정의 X선 회절 실험 중에 좋은 신호 대 노이즈를 달성하기가 어렵습니다. 이 프로토콜은 제어 된 방식으로 형성 된 결정의 배경 소스를 줄이는 것을 목표로합니다. 펀치 동결 로봇 과 극저온TEM 그리드의 사용은 마이크로 결정을 반복적으로 조작하여 주변 액체 볼륨을 줄이고 시료의 신속한 유리화를 제공하는 강력한 플랫폼을 제공합니다.그리드를 처리하는 데 필요한 손재주도 전통적인 크리스탈 수확에 필요한 것과 유사합니다. 또 다른 중요한 요소는 시료 사용량을 줄이는 핵심인 결정화 솔루션을 사용하여 초기 블로팅 파라미터를 결정하는 것입니다. 시작하려면 제조업체의 지침에 따라 자동 플런지 냉동고를 설정하고 식힙니다.사용하기 직전에 글로우는 15밀리암페어 전류와 0.39 밀리바 압력으로 25초 동안 극저온TEM 그리드를 배출한 다음, 광선 배출 그리드를 덮인 페트리 접시에 보관합니다. 샘플 챔버의 상대 습도를 90%로 설정하고 블로팅 시간을 5초로 설정합니다. 플롯팅이 완료된 후 플런지 냉동고가 자동으로 샘플을 급락하도록 설정되어 있는지 확인합니다.결정화의 씰을 잘 열고 저수지를 엽니다. 낙하의 부피를 유지하기 위해 수정 강하에 2~5마이크로리터의 마이크로리터를 빠르게 첨가합니다. 나중에 사용하기 위해 저수지 용액의 10 마이크로리터를 0.5 밀리리터 튜브로 옮기고 결정화 가루가 건조되는 것을 방지하기 위해 우물을 재밀봉한다.플런지 얼어붙은 집게를 사용하여 단일 글로우 방전 그리드를 선택하고 탄소 면이 블로팅 암에서 멀리 향하도록 계측기의 그리드를 로드합니다. 탄소 측이 블로팅 암에 직면하도록 그리드를 들고 있는 집게를 회전시다. 2.5 마이크로리터 파이펫을 사용하여 냉동TEM 그리드의 비지원 측에 두 개의 저수지 용액을 적용합니다.블로팅 암에서 멀리 향하는 탄소 면으로 그리드를 회전시키고 저장소 액체를 그리드의 탄소 필름 지지측에 조심스럽게 적용합니다. 블로팅 공정을 시작하고 그리드 의 표면을 가로 질러 터지는 파도가 보일 때까지 탄소 표면에서 가져온 액체를 관찰하십시오. 터지는 파도가 보이지 않으면 블로팅 암이 그리드에서 후퇴하기 전에 블로팅 시간을 1~2초 까지 늘립니다.결정화 플레이트를 광 현미경 아래에 놓고 대상을 시야 내에 잘 배치합니다. 플런지 냉동실에 신선한 광선 배출 그리드를 놓고 저수지 액체를 이전에 설명한 대로 그리드의 비지지측에 적용합니다. 플런지 냉동고의 샘플 포트를 향한 탄소 필름 지지측으로 그리드를 회전합니다.결정화 플레이트에서 임시 씰을 껍질을 벗기고 두 개의 마이크로리터에 설정된 파이펫을 사용하여 결정화 방울을 반복적으로 흡입합니다. 흡량제 마이크로크리스탈 슬러리의 2개의 마이크로리터를 플런지 냉동고로 옮기고 모든 샘플을 극저온TEM 그리드의 탄소 측에 적용한다. 블로팅을 시작하고 터지는 물결을 관찰한 다음 즉시 급락 동결을 시작합니다.액체 에탄에서 액체 질소에 침지된 그리드 박스로 그리드를 신속하게 전송합니다. 그리드를 얼린 후 플런지 냉동고를 재설정하여 액체 에탄에서 급락한 그리드를 철회합니다. 플런지 냉동고에서 그리드를 들고 있는 집게를 제거하고 그리드를 가벼운 현미경 아래에 놓습니다.미세 한 초점을 조정 하 고 그리드에 걸쳐 결정의 밀도 평가. SEM에서 극저온TEM 그리드를 로드한 후 샘플을 정렬하고 전자 빔을 켭니다. 처음에는 45X 배율로 전체 그리드를 평가하고 이미지를 기록한 다음 개별 결정이 명확하게 관찰될 때까지 개별 그리드 사각형을 자세히 검사하기 위해 배율을 높입니다.그리드 주위를 이동하고 스틸 이미지를 캡처하여 그리드가 평평하고 탄소 지원 필름이 대체로 손상되지 않도록 합니다. 크리스탈을 둘러싼 유리화 액체의 좁은 후광이 있는 수많은 단일 결정이 있는지 확인하고 구멍은 탄소 지지 필름에 표시됩니다. 그리드의 이미지를 관찰하고 캡처하는 동안 유리화 된 액체의 큰 영역이 없거나 육각형 얼음이나 표면 얼음이 그리드 에 흩어져 있지 않으며 결정이 겹치지 않고 지지 필름전체에 고르게 분포되어 있는지 확인하십시오.큰 발포 드워에서 샘플 카트리지에 적재된 필요한 수의 VMXm 샘플 홀더를 식힙니다. 샘플 로더의 샘플 위치 위에 액체 질소를 추가합니다. 마이크로크리스탈로딩 그리드가 포함된 그리드 박스를 샘플 로더의 그리드 박스 오목으로 신속하게 옮기고 뚜껑을 약간 풀고 뚜껑을 느슨하게 하고 회전할 수 있도록 뚜껑을 열짝 풀수 있습니다.그리드 상자에서 그리드를 들어 올리고 그리드를 회전하여 그리드를 샘플 홀더에 평평하게 놓습니다. 미리 냉각된 순환 도구를 그리드 개구부그리드 위에 신속하게 배치하고 버튼을 눌러 서클립을 설치합니다. 액체 질소를 샘플 홀더 위에 약 1.5센티미터 추가합니다.VMXm 샘플 집게를 사용하여 로드된 샘플 홀더를 조심스럽게 들어 올려 샘플 카트리지에 다시 넣습니다. 카트리지의 뚜껑을 교체하여 카트리지 상단의 핀이 뚜껑의 구멍과 결합되도록 합니다. 냉동TEM 그리드에 준비된 미세 결정의 스캐닝 전자 현미경 사진은 최소한의 배경 분산을 보였다.그리드는 여분의 액체로부터 자유로웠으며 크리스탈을 둘러싼 좁은 액체 후광이 관찰되었다. 다발성 결정은 덩어리뿐만 아니라 개별적으로 관찰되었다. 약간 더 큰 인슐린 결정은 또한 고립 된 결정과 함께 일부 응집을 보였다.매우 큰 미세 결정도 냉동TEM 그리드에 성공적으로 장착되었습니다. 탄소 지지 필름의 구멍이 선명하 게 표시되어 강한 블로팅을 나타냅니다. 많은 샘플은 미세 결정의 블로팅 시간과 농도의 변화로 인해 추가 최적화가 필요했습니다.결정으로 과부하된 그리드는 블로팅 효율을 줄이고 여러 격자를 단일 회절 이미지에 기록했습니다. 점성이 높은 결정화 솔루션의 짧은 블로팅 시간은 지나치게 젖은 시료를 초래할 수 있습니다. 점도 결정화 용액이 낮을 경우 짧은 블로팅 시간이 되면 그리드의 한쪽에서 미세 결정을 훔치는 결과를 초래합니다.최적의 시료 준비를 통해 VMXm의 모든 기능을 활용하여 높은 신호 대 잡음 비율로 가능한 최고 해상도의 고품질 X-ray 회절 데이터를 수집할 수 있습니다. 결정화 솔루션의 초기 블로팅을 결정하는 것은 최소한의 샘플을 사용하는 데 핵심적인 것입니다. 샘플이 매우 제한된 경우 밀도 평가를 건너뜁니다.궁극적으로 희석된 시료를 갖는 것이 좋습니다. 이 견본은 이제 마이크로 ED의 앞에 VMXm Beamline, 마이크로 결정 전자 회절, 또는 집중된 이온 빔 밀링에서 엑스레이 회절 실험을 위한 준비가 되었습니다.

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Research

연구

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여기서는 EMBL 그르노블의 HTX 연구소의 CrystalDirect 기술을 기반으로 단백질-투 구조, 신속한 리간드 단백질 복합 분석 및 대규모 단편 스크리닝을 위해 자동화된 거대 분자 결정도 파이프라인을 사용하는 방법을 설명합니다.

그르노블의 EMBL HTX 시설의 자동 결정화 파이프라인

당사는 Harwell의 Research Complex에 있는 결정화 시설을 사용하여 단백질의 결정화를 위한 프로토콜을 제시하고 Diamond의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 플레이트 내의 결정으로부터 후속 in situ X선 결정학 데이터 수집을 제시합니다. 시료 요구 사항, 결정화 프로토콜 및 데이터 수집 지침에 대해 설명합니다.

Harwell 및 Beamline VMXi의 결정화 시설을 사용한 결정화 및 현장 실온 데이터 수집, Diamond Light Source

학습하세요 VMXm 빔라인에서 단일 결정 저온결정학을 위한 10μm 미만 단백질 미세 결정 샘플 준비 및 장착 프로토콜. 글로우 방전 처리, 자동 플런지 동결, 정밀 블로팅을 통해 배경 소음을 최소화하고 신호 대 잡음비를 향상시키는 방법을 배우세요.

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

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