Name: 유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 13 s
Description: 학습하세요 Cre-의존성 AAV를 이용한 희소 표지와 공초점 현미경을 활용한 망막 신경세포 수목화의 고해상도 타임랩스 이미징 방법. 이 기술은 생체 내 신경 형태발생 연구에 필수적입니다.

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매디슨 그레이가 내가 아무 것도 가지고 있지 않았을 때 나에게 손을 줘서 고맙다. 이 연구는 NSERC 디스커버리 그랜트 (RGPIN-2016-06128), 신경 과학의 슬론 펠로우십 및 캐나다 연구 위원장 Tier 2 (J.L.L.L)의 지원을 받았습니다. S. Ing-Esteves는 Vision Science Research Program과 NSERC Postgraduate Scholarships-Doctoral의 지원을 받았습니다.

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이 비디오는 기존의 유전 도구를 사용하여 공초점 라이브 이미징으로 망막 뉴런을 개발하는 수상 돌기 역학을 이미지화하는 실험 파이프 라인을 보여줍니다. 또한 신생아 마우스에 막 표적화된 형광 단백질을 코딩하는 Cre 의존성 AAVs의 안구 내 주사가 입증되었다. 유전적으로 표적화된 집단의 단일 세포는 4-5 dpi만큼 일찍 밝게 표지된다. 망막 플랫-마운트는 라이브 셀 공초점 이미징을 수행하기 위해 표준 이미징 챔버를 위해 준비되었다. 이 방법은 단일 셀과 미세한 투영에 대한 고해상도 타임랩스 비디오를 생성합니다. 작은 프로젝션은 ImageJ, Vaa3D 및 ShuTu를 포함한 오픈 소스 소프트웨어와 Imaris 및 MBF Bioscience에서 제공하는 라이센스 소프트웨어를 통해 제공되는 디컨볼루션 및 후처리 알고리즘을 사용하여 해결되고 정량화됩니다. 이 파이프라인은 모듈식이므로 각 프로토콜 섹션은 연구 목적에 맞게 변경할 수 있습니다. 이들 모듈화 요소는 아래에서 논의되며, 1) Cre-line 선택, 2) 형광 단백질 및 바...

망막 뉴런의 덴드라이트는 신경 회로 내에서 기능에 영향을 미치는 복잡하지만 구체적인 패턴을 형성합니다. 척추동물 망막에서 다양한 유형의 망막 신경절 세포(RGCs)와 아마크린 세포 인터뉴런은 arbor 크기, 위치, 가지 길이 및 밀도가 다른 독특한 수지상 형태를 띠고 있습니다1. 산후 발달 동안, RGCs와 amacrine 세포는 광수용체 신호를 전달하는 양극성 세포 입력을 수신하는 내부 플렉시폼 층 (IPL)이라고 불리는 뉴로필로 풍성한 수지상 과정을 확장합니다2. 병아리 또는 제브라피쉬 유충에서 형광으로 표지된 망막 개체군의 타임랩스 영상에 의해 포착된 바와 같이, 수상 돌기 형태형성은 매우 역동적이다3,4,5. 며칠 내에 수지상 arbors는 IPL의 좁은 하위 계층으로 확장, 리모델링 및 확대되어 일부 파트너와 시냅스합니다. arbors는 개발에 걸쳐 다른 구조적 역학을 나타내며, 지점 추가, 철회 및 안정화의 상대적 비율의 변화와 함께 나타납니다. Amacrine 및 RGC 수상 돌기는 또한 유형 별 수목을 반영 할 수있는 다른 성장 및 리모델링 동작을 나타냅니다. 그러나 이러한 연구는 광범위한 amacrine 또는 RGC 개체군을 추적하고 형태학의 한 측면 인 층류 타겟팅에 중점을 두었습니다.
망막 아형에서 관찰되는 광대한 형태학적 다양성을 생성하는 메커니즘은 잘 이해되지 않는다. 이 그룹의 목적은 수지상 역학을 포착하고 마우스에서 정의 된 망막 아형의 아형을 리모델링하는 방법을 개발하는 것이 었습니다. 수상 돌기 패터닝의 세포 유형 별 메커니즘을 식별하려면 관심있는 세포의 수상 돌기 행동을 시각화하고 측정하는 방법이 필요합니다. 마우스 망막의 유기형 배양은 공초점 또는 다중 광자 현미경을 사용하는 살아있는 세포 이미징 연구에 매우 적합합니다. 개발 중인 망막은 해부되어 평평한 외래편에 장착되며, 이 외식재는 기록 챔버에서 몇 시간 동안 영상화되거나 회로에 제한된 영향을 미치는 며칠 동안 배양될 수 있습니다6,7. 살아있는 망막 뉴런은 전극에 의한 염료 충전, 전기천공, 형광 단백질을 코딩하는 친유성 염료 또는 플라스미드로 코팅된 입자의 생체목록 전달(예를 들어, 진건) 및 유전적으로 코딩된 세포 표지7,8,9,10을 포함하는 다양한 기술에 의해 표지될 수 있다. . 그러나, 이러한 접근법은 특정 망막 아류형의 수상 돌기 역학을 이미징하는 데 비효율적이다. 예를 들어, 염료 충전 방법은 처리량이 낮으며 관심있는 세포를 안정적으로 타겟팅하기 위해 전기 생리학 장치 및 추가 유전자 표지가 필요합니다. 더욱이, 소마의 강한 형광 신호는 근처의 덴드라이트를 흐리게 할 수 있다.
생체 목록 유전자 전달 방법은 동시에 수십 개의 세포를 표지 할 수 있지만 고압 입자 전달 및 분리 된 망막의 하룻밤 배양과 관련된 단계는 세포 생리학 및 수지상 증식을 손상시킬 수 있습니다. 이 논문은 최근의 유전 도구를 사용하여 다음과 같은 실험 기준을 고려할 때 세포 유형 및 구조적 분해능으로 초기 수상 돌기 역학을 포착 할 수 있다고 제안합니다. 첫째, 발달하는 arbors를 지배하는 미세한 가지와 filopodia를 해결하기 위해이 방법은 전체 arbor의 과정을 채우는 밝고 형광 단백질로 뉴런을 표지해야합니다. 형광 표지는 이미징 기간 동안 광표백으로 인해 퇴색해서는 안됩니다. 다양한 형광 단백질 변이체가 생성되고 밝기 및 광안정성에 기초한 생체내/생체외 영상화11에 대한 적합성에 대해 비교되었다. 둘째, 형광 단백질 (XFPs)은 수상 돌기 형태 형성의 초기 단계에 의해 충분히 높은 수준으로 발현되어야하므로 좁은 발달 창을 놓치지 않아야합니다. 마우스 망막의 정적 시간대 분석에서 수상 돌기 발달은 출생 후 첫 주 동안 발생하며 성장, 리모델링 및 안정화 단계를 포함합니다10,12,13,14,15. 셋째, 상기 방법은 선택적 표지 또는 관심있는 뉴런 하위집단의 표지 가능성 증가로 이어져야 한다. 넷째, 표적 하위집단의 표지는 전체 뉴런 아버가 확인되고 추적될 수 있도록 충분히 희박해야 한다. RGC 및 amacrine 아류형은 성숙한 형태학적 특성 및 IPL 계층화 패턴16,17,18,19,20에 의해 구별될 수 있지만, 과제는 미성숙 구조를 기반으로 개발 중에 아형을 식별하는 것이다. 이 작업은 개발 중에 특정 망막 세포 유형을 표지하는 트랜스제닉 도구의 확장에 의해 촉진됩니다.
형광 단백질 또는 Cre의 세포 및 시간적 발현이 유전자 조절 요소에 의해 결정되는 형질전환 및 녹-인 마우스 라인은 망막 세포 유형13,21,22,23을 연구하는데 널리 사용된다. 수상 돌기 발달의 아형 특이적 패턴에 대한 주요 관찰은 정적 시점 10,14,24,25에서 트랜스제닉 마우스 망막에 대한 연구에서 나왔다. 특히 Cre-Lox 시스템은 다양한 재조합효소 의존성 리포터, 센서 및 광유전학적 활성화제를 사용하여 아형의 절묘한 유전자 조작 및 모니터링을 가능하게 한다. 이러한 도구는 망막 회로 어셈블리의 기초가되는 아형 특정 분자 프로그램 및 기능적 특성의 발견으로 이어졌습니다.26,27,28,29,30. 그러나, 그들은 아직 마우스 망막에서 아형 특이적 수상 돌기 역학을 연구하는 데 활용되지 않았습니다. 저밀도 표지는 Cre 마우스 라인을 전기천공 또는 재조합 AAVs에 의해 도입된 전이유전자와 조합함으로써 달성될 수 있다. 이용 가능한 경우, 타목시펜-유도성 Cre 라인 또는 교차 유전자 전략이 또한 사용될 수 있다. 마지막으로, 세포는 최소 침습적 방식으로 표지되어야 하고, 조직을 손상시키거나 수상 돌기 형태형성에 필요한 세포 기능을 방해하지 않도록 획득 파라미터를 사용하여 영상화되어야 한다.
여기에 제시된 방법은 살아있는 마우스 망막 외식편에서 수상 돌기 역학을 조사하기 위해 트랜스제닉 도구 및 공초점 현미경을 적용하는 방법이다. Cre 트랜스제닉 마우스 라인은 Cre 재조합시 형광 단백질을 발현하는 AAV 벡터와 결합되었으며, 이는 관심있는 망막 세포의 희소 표지를 허용한다. 상업적으로 이용가능한 AAVs는 유리체내 주사에 의해 신생아 망막으로 전달된다. 이 논문은 AAV가 4dpi만큼 상당히 높고 세포 유형 별 형광 발현을 생성하여 출생 후 시점에 액세스 할 수 있음을 보여줍니다. 이러한 접근법을 예시하기 위해, 콜린성 "스타버스트" 아마크린 인터뉴런은 콜린 아세틸트랜스퍼라제 (ChAT)-내부 리보솜 진입 부위 (IRES)-Cre 전이유전자를 발현하는 신생아 마우스에 Brainbow AAV를 전달함으로써 표지되었으며, 이는 산후 망막31,32에서 활성화된다. 스타버스트 아마크린 세포는 군집된 프로토카데린33,34에 의해 매개되는 수상 돌기 자기 회피에 의해 형성되는 고정관념 및 방사형 아버 형태를 개발한다. 이 논문은 Brainbow AAVs31에 사용되는 파네 실화를 겪는 CAAX 모티프를 추가하여 XFPs에 의해 원형질막에 스타 버스트 수상 돌기 및 필로 포디아의 해상도가 크게 향상되었음을 보여줍니다. 마지막으로, 타임랩스 이미징 및 후처리 프로토콜은 수상 돌기 재구성 및 형태 정량화에 적합한 고품질 이미지를 생성하는 것으로 결정되었습니다. 이 프로토콜은 수상 돌기 형태 형성을 조절하는 요인을 확인하고 손상되지 않은 망막에서 여러 세포 행동을 포착하는 데 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Addgene 바이러스 준비 #45185-AAV9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Addgene 바이러스 준비 #45186-AAV9</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissection tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellulose filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-070</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 fine uncps</td><td>FST</td><td>11252-20</td><td>망막 미세 박리를 위해 두 개의 Dumont #5 집게 필요</td></tr><tr><td>Dumont 집게</td><td>VWR</td><td>82027-426</td><td></td></tr><tr><td>미세 가위</td><td>FST</td><td>14058-09</td><td></td></tr><tr><td>혼합 셀룰로오스 에스테르 막 (MCE) 여과지, 친수성, 0.45 &마이크로; m pore size</td><td>Millipore</td><td>HABG01 300</td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish, 50 &times; 15 mm</td><td>VWR</td><td>470313-352</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 일회용 전송 피펫</td><td>VWR</td><td>470225-034</td><td></td></tr><tr><td>라운드 팁 페인트 브러시, 크기 3/0</td><td>일반 미술 용품점</td><td></td><td>레티날 플랫 마운팅 수술용 가위 FST를 위해 두 개의 크기 3/0 페인트 브러시 (또는 그 이하)가 필요합니다</td></tr><tr><td>.</td><td></td><td>14007-14</td><td></td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위 - 2.5 mm 커팅 엣지</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>live-imaging incubation system</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chamber 폴리에틸렌 튜빙, PE-160 10'Warner</td> <td>Instruments</td><td>64-0755</td><td></td></tr><tr><td>듀얼 채널 히터 컨트롤러, 모델 TC-344C</td><td>Warner Instruments</td><td>64-2401</td><td></td></tr><tr><td>HC FLUOTAR L 25x/0.95 W VISIR 디핑 대물</td>렌즈 <td>Leica</td><td>15506374</td><td></td></tr><tr><td>히터 컨트롤러 케이블</td><td>Warner Instruments</td><td>CC-28</td><td></td></tr><tr><td>슬라이스 지지대가 있는 대형 욕조 배양 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-27L</td><td></td></tr><tr><td>MPII 미니 연동 펌프</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2027</td><td></td></tr><tr><td>PM-6D 자기 가열 플랫폼(인큐베이션 챔버 히터)</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>PM-6D</td><td></td></tr><tr><td>펌프 헤드 튜빙 피스 MPII 미니 연동 펌프용</td><td>하버드 장치</td><td>55-4148</td><td></td></tr><tr><td>샘플 앵커 (하프)</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-0260</td><td>샘플 앵커는 인큐베이션 챔버와 호환되어야 합니다</td></tr>. <tr><td>Sloflo 인라인 솔루션 히터</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>SF-28</td><td></td></tr><tr><td>Neonatal Injections</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 &마이크로; L 마이크로리터 주사기 시리즈 700, 탈착 가능한 바늘</td><td>Hamilton Company</td><td>80314</td><td></td></tr><tr><td>30 G 피하 주사 바늘 (0.5 인치)</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>4 인치 얇은 유리 모세관, 필라멘트 없음 (1.0 mm 외경/0.75 mm)&nbsp;</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 99.8% (이중 증류수 [ddH2O]로 70%로 희석)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V001229&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>AAV9.hEF1a.lox.TagBFP. lox.eYFP.lox.WPRE.hGH-InvBYF</td><td>펜 벡터 코어</td><td>AV-9-PV2453</td><td>애드진 플라스미드 #45185&nbsp;</td></tr><tr><td>AAV9.hEF1a.lox.mCherry.lox.mTFP 1.lox. WPRE.hGH-InvCheTF</td><td>Penn Vector Core</td><td>AV-9-PV2454</td><td>Addgene Plasmid #45186</td></tr><tr><td>ChAT-IRES-Cre knock-in 형질전환 마우스 라인</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>6410</td><td></td></tr><tr><td>Fast Green FCF 염료 함량 &ge; 85 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7252-25G</td><td></td></tr><tr><td>화염/갈색 마이크로피펫 풀러, 모델 P-97</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>녹색 문신 페이스트</td><td>Ketchum MFG Co</td><td>329A</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수, pH 7.4, 액체, 멸균 여과, 세포 배양에 적합</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>806552</td><td></td></tr><tr><td>Pneumatic PicoPump</td><td>WPI World Precision Instruments</td><td>PV-820</td><td></td></tr><tr><td>Oxygenated artifial cerebrospinal fluid (aCSF) 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘 이수화물 (CaCl2&middot; 2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen (5% CO2, 95% O2)</td><td>AirGas</td><td>X02OX95C2003102공급</td><td>업체는 지역에 따라 다를 수 있습니다</td></tr>. D<tr><td>-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, Free Acid</td><td>Bio Basic</td><td>HB0264</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid solution, 1 N</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물(MgCl2&middot; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>pH-Test strips (6.0-7.7)</td><td>VWR</td><td>BDH35317.604</td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>Bio Basic</td><td>DB0483</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성(NaH2PO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>RDD007</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health (NIH)</td><td>오픈 소스</td><td></td></tr></tbody></table>

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

수지상 arbors를 패턴화하는 메커니즘을 발견하려면 개발 중에 수상 돌기를 시각화, 이미지 및 분석하는 방법이 필요합니다. 마우스 망막은 신경 형태 형성 및 연결성의 세포 유형 특이적 메커니즘의 조사를 위한 강력한 모델 시스템이다. 망막 아형의 조직과 구성은 잘 정의되어 있으며, 유전 도구는 개발 중에 특정 유형에 접근 할 수 있습니다. 많은 망막 세포 유형은 또한 그들의 수상 돌기 및 / 또는 축삭을 좁은 층으로 제한하여 시간 경과 이미징을 용이하게합니다. 마우스 망막 외래 배양물은 공초점 또는 다중 광자 현미경을 사용한 살아있는 세포 이미징에 매우 적합하지만 시간적 및 구조적 해상도로 수상 돌기 역학을 이미징하는 데 최적화 된 방법은 부족합니다. 여기에 제시된 것은 Cre-Lox 시스템에 의해 표시된 특정 망막 집단의 발달을 희박하게 라벨링하고 이미지화하는 방법입니다. 여기에서 사용되는 상업적으로 입수가능한 아데노-관련 바이러스 (AAVs)는 Cre-의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현한다. 신생아 마우스에서 AAVs의 안구 내 전달은 주사 후 4-5 일 (dpi)에 의해 표적화 된 세포 유형의 형광 표지를 생성합니다. 막 형광 신호는 공초점 이미징으로 검출 할 수 있으며 미세 분지 구조와 역학을 해결합니다. 2-4 시간에 걸친 고품질 비디오는 산소화 된 인공 뇌척수액 (aCSF)이 관류하는 망막 플랫 마운트를 이미징하여 획득합니다. 또한 디컨볼루션 및 3차원(3D) 드리프트 보정을 위한 이미지 후처리 파이프라인도 제공됩니다. 이 프로토콜은 손상되지 않은 망막에서 여러 세포 행동을 포착하고 신경돌기 형태 형성을 조절하는 새로운 요인을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 망막에서 배운 많은 발달 전략은 중추 신경계의 다른 곳에서 신경 회로의 형성을 이해하는 데 관련이 있습니다.

위의 프로토콜을 사용하여 스타버스트 셀 수상 돌기를 개발하는 고해상도 3D 비디오를 획득, 디컨볼브 및 3D 드리프트에 맞게 수정했습니다. Z-평면 최대 프로젝션은 분석을 위한 2D 비디오를 만들기 위해 제작되었다(보충 비디오 1, 도 5A). 각 시점의 3D 디컨볼루션은 미세한 필로포디아 투영의 분해능을 증가시켰다(그림 5B,C). 미세한 필로포디아 돌출부는 망막 덴드라이트36을 개발하는 특징이며 이미징 중에 볼 수 있어야 합니다. AAV 형질감염은 세포 표지 밀도 및 형광 강도에서 가변성을 생성할 것이다. 따라서 표지 된 조직을 선별하여 형광 신호가 높은 세포를 선택하여 이미징하고 고품질 비디오를 제작하십시오. 희미하게 라벨이 붙은 세포를 감지하기 위해 레이저 파워를 증가시키는 것은 빠른 광표백을 유도하고 신호에 비해...

여기에서, 우리는 시간 경과 공초점 현미경에 의해 산후 마우스 망막 외식편에서 신경돌기 형태 형성을 조사하는 방법을 제시한다. 우리는 Cre 의존성 방식으로 막 표적화된 형광 단백질을 발현하는 재조합 아데노-관련 바이러스 벡터를 사용하는 망막 세포 유형의 희소 표지 및 획득 및 이들의 미세 공정에 대한 접근법을 기술한다.

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

수지상 또는 축삭 아버의 단일 세포 표지 및 시각화는 신경 형태 형성을 연구하는 데 필요합니다. 최소 침습적 방식으로 발달하는 arbors를 라벨링함으로써, 망막 조직은 건강하게 유지되고 장기간의 공초점 라이브 이미징에 적합합니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 주사 후 나흘 이내에 다색 형광 단백질로 개별 arbors를 시각화 할 수 있다는 것입니다.이것은 신생아 arbor 형태학을 연구하는 것을 가능하게합니다. 이 주사 이미징 및 분석 프로토콜은 중추 신경계 전반에 걸친 신경 형태를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 적절한 Cre 선택 및 주입 위치는 관심있는 세포 집단을 표적으로 하기 위해 결정되어야 한다.먼저 Cre 마우스 라인을 선택하여 관심 있는 망막 세포 집단에 라벨을 붙인다. 형광 단백질을 코딩하는 재조합효소 의존성 AAV 바이러스를 얻는다. 미세 공정의 최적 표지를 위해, 원형질막을 표적화하는 변형된 형광 단백질을 발현하는 벡터를 선택하십시오.얼음 상의 AAV 분취량을 위해, 멸균 식염수 또는 PBS를 사용하여 하나 내지 네 개의 AAV 희석액을 준비한다. 주사제를 시각화하려면 AAV 희석액 15 마이크로리터마다 약 1 마이크로리터의 0.02%Fast Green FCF 염료 용액을 첨가하여 용액을 파란색으로 채색하십시오. 주사 부위를 70 % 에탄올로 멸균하십시오.마이크로사이린지를 사용하여 AAV 희석액으로 마이크로피펫을 백필한다. 스테레오 현미경으로 마이크로 피펫 팁을 30게이지 바늘로 부수어 팁의 밀봉을 풉니다. 신생아 마우스를 마취 한 후 30 게이지 바늘을 사용하여 문신 잉크로 발 패드를 문신하여 동물을 식별하십시오.DNA 분리 및 유전자형을 위한 꼬리 클리핑을 수집합니다. 70 % 에탄올로 눈 위에 놓인 피부를 면도합니다. 30게이지 바늘을 사용하여 융합된 눈꺼풀을 열고 손가락으로 가벼운 압력을 가하여 눈을 뜨게 합니다.각막 공막 접합부에서 각막을 통해 작은 구멍을 뚫습니다. 유리 마이크로 피펫을 구멍에 넣고 마이크로 인젝터 풋 페달을 두 번에서 네 번 눌러 AAV를 유리체내 공간에 주입하십시오. 마이크로피펫을 천천히 제거하고 동공에서 청색 염료를 시각화하여 AAV 주입을 확인하였다.텍스트 원고에 기재된 바와 같이 망막 aCSF를 준비한 후, 최소 15분 동안 카르보겐으로 버블링하여 망막 aCSF를 산소화한 다음, pH를 7.4로 조정한다. 직경 60mm의 페트리 접시를 얼음 쟁반에 넣고

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 비디오에서는 여러 가지 빛깔의 공촛점 시간 저속 이미징 및 타겟 세포 절제에 대한 기술이 제공됩니다. 시간 저속 영상은 관심의 여러 세포 유형의 동작을 모니터하는 데...

트렌스 제닉 Zebrafish의 여러 가지 빛깔의 시간 저속 영상 : 타겟의 연결을 세포 절제에 의해 활성화 떠올리 망막 줄기 세포

여기서 우리는 시각 피질의 뉴런과 glia의 형광 라벨에 대한 AAV 벡터의 intracranial 주사를 제시한다.

Adeno - 관련 바이러스성 벡터의 Intracranial 분사

우리는 마우스 forebrain의 neuronal 이주의 실시간 videoimaging을위한 프로토콜을 설명합니다. 급속도로 이루어질 - 표시 또는 이식 neuronal 전구체의 마이그레이션은 고정 및 마이그레이션 단계의 기간 및 속도 등의 세포 이주의 다른 단계를 공부하고 비교적 빠른 수집 간격과 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 급성 라이브 슬라이스에 기록 된 이주.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

출처: Ing-Esteves, S. &amp; Lefebvre, J. L. 유전적으로 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노 관련 바이러스 라벨링을 사용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징. J. Vis. Exp. (2021)이 비디오는 살아있는 쥐 망막 외식식물에서 수지상 역학을 시각화하기 위해 컨포칼 현미경을 사용하는 방법을 보여줍니다. 컨포칼 현미경으로 망막을 안정화하고, 별이 터진 무축삭 중간뉴런을 시각화하기 위해 에피형광 이미징을 수행하고, 무축삭 수지상 형태의 변화를 모니터링하기 위해 타임랩스 3D 이미지를 캡처하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 망막 외식에서 뉴런 수지상 역학의 타임랩스 컨포칼 이미징

망막 질환의 동물 모델에서 혈액-망막 장벽 투과성과 내부 제한 막 무결성을 조사하기 위해 여러 아데노 관련 바이러스(AAV) 변종을 망막 뉴런과 신경교세포를 라벨링하는 도구로 사용했습니다. 그런 다음 바이러스 매개 리포터 유전자 발현을 망막 장벽 투과성의 지표로 사용합니다.

도구로 아데노 관련 바이러스를 사용하여 질병 망막 장벽을 연구하는

이 비디오는 Thy1-GFP 형질전환 라인에서 생체 내 2광자 현미경을 사용하여 마우스 후비장 피질의 뉴런을 만성적으로 이미징할 수 있는 개두술 절차를 보여줍니다. 이 접근법은 mCherry 발현 아데노 관련 바이러스를 배측 해마에 주입하는 것과 결합됩니다. 이러한 기술을 통해 RSC에서 경험 의존적 구조적 가소성을 장기간 모니터링할 수 있습니다.

동시에 두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 마우스 Retrosplenial 코어 텍스에서 시냅틱 입력의 이미징 및 시냅스 대상

현재 프로토콜은 해마에 복부 테진 영역 (VTA) 글루타민트 프로젝션을 추적하기위한 간단한 방법을 보여줍니다. VTA 글루타민트 뉴런의 사진 자극은 VTA 글루타민단 단자가 생체 내에서 CA1 퍼티티 피라미드 발사 속도를 조절하는 방법을 보여주기 위해 CA1 레코딩과 결합되었습니다.

해마의 생체 내 해부학 및 기능적 추적

생체 내 이미징은 건강 및 질병 생물학 연구를위한 강력한 도구입니다. 이 프로토콜은 표준 2 광자 현미경으로 마우스 망막의 경공 영상을 설명합니다. 또한 망막의 여러 세포 코호트를 형광으로 표지하는 다양한 생체 내 이미징 방법을 보여줍니다.

경동공 이광자 마우스 망막의 생체 내 이미징

여기에서 우리는 깨어 있는 마우스에서 소교세포 역학과 신경 활동의 동시 이미징을 위해 아데노 관련 바이러스 주입과 두개골 창 이식을 결합한 프로토콜을 설명합니다.

깨어 있는 생쥐의 소교세포 역학 및 신경 활동의 동시 이미징

대뇌 피질이 발달하는 동안 뉴런과 신경교세포는 심실 내벽의 심실 영역에서 시작하여 뇌 표면으로 이동합니다. 이 과정에는 많은 유전자가 관여합니다. 이 프로토콜은 이동하는 뉴런과 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징 기술을 소개합니다.

배아 마우스 뇌 절편에서 이동하는 뉴런 및 신경교세포 전구세포의 타임랩스 이미징

학습하세요 Cre-의존성 AAV를 이용한 희소 표지와 공초점 현미경을 활용한 망막 신경세포 수목화의 고해상도 타임랩스 이미징 방법. 이 기술은 생체 내 신경 형태발생 연구에 필수적입니다.

유전자 표적화된 망막 세포 집단의 희소 아데노-연관 바이러스 표지를 이용한 뉴런 수목화의 타임랩스 이미징

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