Name: 수막 대장균에 감염된 호중구의 반응성 산소 종의 실시간 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: 학습하세요 수막 대장균에 감염된 호중구에서 반응성 산소 종을 실시간으로 정량화하는 방법을. 형광 프로브와 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 호중구의 살균 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

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이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(31670845, 31870832, 320008111)과 랴오닝성 우수교수(LJH2018-35)의 지원을 받았습니다.

이 연구에 적용 된 자원 봉사자의 말초 혈액은 중국 의과 대학 (#2020-2020-237-2)의 첫 번째 병원의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 시약 및 문화 매체의 준비
<ol><li>NH4Cl8.29g, KHCO31g, Na2EDTA 37.2 mg을 이중 증류수 1L에 첨가하여 적혈구 용해 완충제를 준비하고 pH를 7.2-7.4로 조절한다. 0.22 μm 필터를 사용하여 여과에 의해 박테리아를 제거합니다.</li>
	<li>RPMI 1640 배지에 5% 태아 소 혈청을 첨가하여 호중구에 대한 실험 배양 배지를 준비하고 4°C에 저장한다. 사용하기 전에 실온에 평형. 참고: 페놀 레드 없이 RPMI 1640 배지를 사용합니다.</li>
	<li>NaCl 8g, KCl 0.2g, Na2HPO 4 ·2H2O 및 0.2 g의 KH2PO4를1L 유리 플라스크에서 이중 증류수 1L에 추가하여 인산염 완충식 식염수(PBS)를 준비한다. pH를 7.2-7.4로 조정합니다. 121 °C에서 15 분 동안 오토 클레이브하십시오.</li>
	<li>디메틸 설플옥사이드(DMSO)의 10mL에서 0.5 g의 리팜피신 분말을 용해하여 50 mg/mL 리팜피신 용액을 산출하여 리팜피신 용액을 준비하십시오.</li>
	<li>NaCl 10g, 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, 한고 분말 15g을 이중 증류수 1L에 첨가하여 LB 한천 용액을 준비하고 혼합물을 오토클레이브합니다. 100 μg/mL 리팜피신이 들어있는 따뜻한 LB 한천 용액을 부어 페트리 접시를 부피의 절반으로 채웁니다. 냉각된 고체 플레이트를 4°C에 보관합니다.</li>
	<li>BHI 분말 37g을 이중 증류수 1L로 용해시켜 세균균에 적합한 뇌 심장 주입(BHI) 국물을 준비합니다. pH를 7.2로 조정하고 자동 복제합니다.</li>
	<li>DMSO 용매에서 형광 프로브 디하이드로에티듐(DHE)을 용해하여 10mM 스톡 용액을 산출한다. 사용하기 전에 부드럽게 섞으세요. 참고: 재고 솔루션을 즉시 광 방지 바이알에 알리쿼트합니다. 재고 용액의 유통 기한은 -20 °C에서 6 개월입니다.</li>
</ol>2. E44 박테리아 균주 제제
참고: E44는 리팜피신 저항을 가진 수막 대장균의 돌연변이 균주입니다.
<ol><li>저온 보존 된 E44 콜로니를 멸균 파이펫 끝으로 찍어 선을 그리면 100 μg / mL 리팜피신을 포함하는 LB 천지 판에 E44 변형을 접종하십시오. 플레이트를 인큐베이터에 거꾸로 넣고 하룻밤 사이에 37°C로 내려놓습니다.</li>
	<li>실험 하루 전에 멸균 파이펫 팁이 있는 플레이트에서 E44 콜로니 1개를 선택하고 50mL 플라스크에 100 μg/mL 리팜피신을 함유한 BHI 국물의 5mL에 넣습니다. 인큐베이션 셰이커에서 17시간 동안 90rpm으로 세균 배양을 37°C에서 배양한다.</li>
</ol>3. 인간의 말초 혈액에서 호중구의 격리
<ol><li>항응고를 위해 EDTA를 함유한 진공 혈액 수집 튜브에 정맥내 자원 봉사자로부터 혈액 샘플 5mL를 그립니다.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g에서 말초 혈액 샘플을 원심 분리합니다. 혈액 샘플은 원심분리에 의해 3층으로 나뉘며, 아래에서 위쪽으로는 적혈구(RBC) 층, 백혈구(WBC) 층 및 혈장 층이 순차적으로 된다.</li>
	<li>3배 RBC 리시스 버퍼를 사용하여 새로운 튜브에 파이펫으로 백혈구 층을 흡인시합니다. 혼합물을 철저히 혼합하고 실온에서 5 분 동안 배치하십시오.</li>
	<li>5 분 동안 500 x g에서 튜브를 원심 분리합니다. 슈퍼 상체를 완전히 흡인하고 폐기하십시오.<ol>
<li>침전이 흰색으로 바뀔 때까지 RBC 리시스 버퍼를 1-2번 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PBS의 2mL로 침전을 다시 중단하여 세포를 세척한다. 그런 다음 300 x g에서 원심 분리기를 5 분 동안 사용하여 세포가 튜브의 바닥으로 정착할 수 있습니다.</li>
	<li>미리 냉각된 자기 세포 선별 버퍼의 50 μL로 퇴적물을 재연하여 CD16 마이크로비드로 호중구를 라벨링합니다. 그런 다음 인간 CD16 마이크로비드의 50 μL과 완전히 섞는다. 혼합물을 4°C에서 30분 동안 배양합니다. 참고: 세포 표면및 비특이적 라벨링에 대한 항체의 캡핑을 방지하기 위해 용액을 미리 냉각해야 합니다. 대부분의 성인은 혈액의 마이크로 리터 당 약 4,000에서 10,000 백혈구가, 그 중, 호중구는 대략 50-70%를 차지합니다. 추정에 따르면, 인간 말초 혈액의 5 mL에 있는 총 백혈구의수는 일반적으로 2-5 x 10 7까지입니다.</li>
	<li>4°C에서 자기 세포 선별 완충제 및 원심분리기 2mL, 10분 동안 300 x g를 추가하여 세포를 세척합니다. 상체를 완전히 버리고 500 μL의 정렬 버퍼로 침전을 다시 일시 중지합니다.</li>
	<li>자기 컬럼을 조립하고 선반을 분리합니다. 분리기를 자기 기둥으로 선반으로 이동하고 3mL의 정렬 버퍼로 컬럼을 헹구습니다.</li>
	<li>마그네틱 비즈에 의해 표지된 호중구가 자기 열에 부착되도록 세포 현탁액을 컬럼에 떨어뜨립니다.</li>
	<li>3mL의 자기 세포 선별 버퍼를 3mL를 추가하여 라벨이 부착되지 않은 세포를 씻어 내고 매번 열 저장소가 비어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 15mL 튜브에 놓습니다. 열에 자기 셀 정렬 버퍼 5mL을 추가합니다. 플런저를 사용하여 마그네틱 표지된 세포를 밀어내보아. 참고: 호중구의 순도를 향상시키기 위해 새 열을 사용하여 선별 단계를 반복할 수 있습니다.</li>
	<li>튜브를 300 x g에서 5 분 동안 원심 분리하고 상체를 완전히 버리고 배양 배지 1 mL로 침전을 다시 중단합니다. 세포 카운터를 사용하여 세포 수를 결정하고 추가 실험을 위해 세포를 준비합니다.</li>
</ol>4. 로스 의 측정
<ol><li>원심분리기는 300 x g에서 5분 동안 300 x g로 분리된 호중구를 재연하고, 5μM DHE 형광 프로브를 포함하는 배양 배지로 세포 농도를 2 x 10 6/mL로 조절한다.</li>
	<li>37°C에서 호중구를 30분 동안 배양하여 DHE 프로브를 적재한 다음, 잘 200 μL을 가진 96웰 의 검은 폴리스티렌 마이크로플레이트에 세포 현탁액을 할당한다.</li>
	<li>마이크로 플레이트 판독기를 켜고 감지 소프트웨어를 엽니다. 불투명 한 96 웰 플레이트 형식을 선택하고 판독 영역을 결정합니다.<ol>
<li>37°C에서 60분 동안 5분마다 운동 모드(Ex/Em = 518/605 nm)로 형광(Ex/Em = 518/605 nm)을 설정합니다. 각 읽기 전에 3 s에 대 한 접시를 흔들어 있는지 확인 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>인큐베이터에서 마이크로 플레이트를 꺼내, 배양된 E44(MOI=100) 또는 phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) (100 ng/mL)를 3개의 복제를 함유한 전부하된 호중구를 각각 함유하고 있다. PMA를 긍정적인 컨트롤로 사용합니다.</li>
	<li>접시를 마이크로 플레이트 판독기에 놓고 즉시 분석서를 시작합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이익이나 기타 이해 상충을 선언하지 않습니다.

호중구는 인간의 혈액 순환에서 백혈구의 가장 풍부한 구성 요소역할을합니다. 그(것)들은 병원체 의 침략에 대하여 방어의 첫번째 선을 구축하는 타고난 인간 면역 계통에 있는 중요한 이펙터 세포입니다(11). ROS의 생성은 phagocytosis11다음호중구의 주요 bactericidal 기계장치 중 하나를 나타낸다. 최근 연구에 따르면 호중구 세포 외 트랩(NET)이라고 불리는 호중구에 의해 방출된 순과 같은 구조도6,11,12의박테리아 살해 과정에 관여하는 것으로 나타났다.
병원성 미생물의 자극에 의해 유도된 호중구에 의해 생성된 ROS는 주로 2개의 막 결합 서브유닛(gp91 phox 및 p22phox)과3...

신생아 세균성 뇌막염은 일반적인 소아 전염병입니다. K1 캡슐을 가진대장균(E. coli)은신생아 세균성 뇌막염을 유발하는 가장 흔한 그램 음성 병원균으로, 전체 발병률 1,2,3의약 80%를 차지한다. 항균 화학 요법과 지원 치료의 진보에도 불구하고 세균 성 뇌막염은 여전히 높은 이환율과 사망률4를가진 가장 파괴적인 조건 중 하나입니다.
신생아 세균성 뇌막염의 발생은 일반적으로 신생아의 국소 병변으로부터 말초 순환으로 병원성 박테리아의 진입에 의한 박테혈으로 시작하여 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통해 뇌로 침투하여 수막4의염증을 초래한다. 박테리아의 발병은 호중구와 대식세포 등을 포함한 박테리아와 숙주 면역 세포 사이의 상호 작용에 달려 있습니다. 백혈구의 ~50-70%를 차지하는 호중구는 세균 감염5,6에대한 첫 번째 방어선이다. 박테리아의 침입 동안, 활성화된 호중구는 전염하는 부위에 모집되고 슈퍼옥사이드 음염, 과산화수소, 하이드록실 라디칼 및 단일 산소7을포함하는 반응성 산소 종(ROS)을 방출한다. ROS는 세포막, 핵산 분자 및 박테리아의 단백질과 의결된 레독스 반응을 겪으며,침입하는박테리아8의 부상과 사망을 초래한다. 미토콘드리아는 진핵세포에서 ROS 생산의 주요 사이트이며, 다양한 산화제(예를 들어, 니코틴아마이드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염(NADPH) 산화체 복합체, 립산소아제 시스템, 단백질 키나아제 C 및사이클로시산소시스템)의 생산을 중화한다. 호중구의 1차 항균 메커니즘을 나타내는 ROS의 생산의 실시간 측정은 박테리아-숙주 상호 작용 중에 숙주 방어를 연구하는 유용한 방법입니다.
이 프로토콜에서, 수막 대장균에 감염된 호중구의 시간 의존적인 ROS 생산은 실시간 형광 마이크로 플레이트 판독기에 의해 검출된 형광 ROS 프로브 DHE로 정량화되었다. 이 방법은 또한 병원체 숙주 상호 작용 동안 다른 포유류 세포에서 ROS 생산의 평가에 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>15mL 폴리프로필렌 원추형 원심분리기 튜브</td><td>KIRGEN</td><td>KG2611</td><td></td></tr><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3025</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agar DINGGUO</td><td>DH010-1.1</td><td></td></tr><tr><td>Autuomated cell counter</td><td>Bio-rad</td><td>508BR03397</td><td></td></tr><tr><td>생물학적 안전성 Carbinet</td><td>Shanghai Lishen</td><td>Hfsafe-1200Lcb2</td><td></td></tr><tr><td>뇌 심장 주입</td><td>BD</td><td>237500</td><td></td></tr><tr><td>CD16 Microbeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-045-701</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Changsha Xiangyi</td><td>TDZ5-WS</td><td></td></tr><tr><td>Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Dihydroethidium (DHE)</td><td>MedChemExpress</td><td>104821-25-2</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Cellmax</td><td>SA211.02</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Heraeus</td><td>Hera Cell</td><td></td></tr><tr><td>MACS 분리 완충액</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>분자 장치</td><td>SpectraMax M5</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Beyoitme</td><td>S1819-1mg</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS 분리 장치</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Solarbio</td><td>13292-46-1</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 매체</td><td>Sangon Biotech</td><td>E600027-0500</td><td></td></tr><tr><td>온도 조절 셰이커</td><td>Shanghai Zhicheng</td><td>ZWY-100D</td><td></td></tr><tr><td>트립톤</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

수막 대장균에 감염된 호중구의 반응성 산소 종의 실시간 정량화

Real-Time Quantification of Reactive Oxygen Species in Neutrophils Infected with Meningitic Escherichia Coli

대장균 (대장균)은신생아 뇌막염을 유발하는 가장 흔한 그램 음성 박테리아입니다. 혈액-뇌 장벽을 통한 세균혈및 세균성 침투의 발생은 대장균 뇌막염의 발달을 위한 필수 단계입니다. 반응성 산소 종 (ROS)은 침략 된 병원체를 파괴하는 호중구의 주요 bactericidal 메커니즘을 나타냅니다. 이 프로토콜에서, 수막 대장균에 감염된 호중구에서의 시간 의존적인 세포내 ROS 생산은 실시간 형광 마이크로 플레이트 판독기에 의해 검출된 형광 ROS 프로브를 사용하여 정량화되었다. 이 방법은 또한 병원체 호스트 상호 작용 도중 포유류 세포에 있는 ROS 생산의 평가에 적용될 수 있습니다.

이 문서에 설명된 프로토콜을 사용하여, 호중구는 인간 말초 혈액에서 격리되고 E44 감염에 응하여 ROS 수준의 변경을 검출하기 위하여 형광 프로브 DHE로 로드되었습니다. 여기서, 우리는 실시간으로 마이크로 플레이트 판독기에 의해 결정된 E44 균주에 의해 생성된 ROS 생산을 보여주는 대표적인 데이터를 제공합니다. 100의 MOI에서 E44 균주를 첨가함으로써 ROS 수치가 즉시 증가하고 시간 의존적 방식으로 연속 상승 추세를보였다(도 1). 호중구에서 세포내 ROS의 잘 알려진 ROS 유도기인 PMA를 추가하여 초기 단계에서 평평한 곡선을 제시하는 S자형 곡선을 관찰한 후 20분에서 40분으로 크게 증가하여 60분(그림1)으로정점을 찍었습니다.
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대장균은 신생아 그람 음성 세균성 뇌막염의 주요 원인입니다. 세균성 감염 도중, 호중구에 의해 생성된 반응성 산소 종은 중요한 bactericidal 역할을 합니다. 여기서 우리는 뇌막염 대장균에 대응하여 호중구에서 반응성 산소 종을 검출하는 방법을 소개한다.

Escherichia coli (E. coli) is the most common Gram-negative bacteria causing neonatal meningitis. The occurrence of bacteremia and bacterial penetration ...

대장균은 신생아 뇌막염을 유발하는 가장 흔한 그램 음성 박테리아입니다. 신생아 세균성 뇌막염의 발생은 순전히 세균염으로 시작하고 혈액내 박테리아가 뇌막염을 일으키는 원인이 되기 위하여 혈액 두뇌 장벽을 통해 침투합니다. 호중구는 세균 감염에 대한 방어의 첫 번째 라인입니다.세균성 침략 도중, 활성 호중구는 ROS를 풀어 놓습니다. ROS는 침입병원균을 파괴하는 숙주 세포의 주요 박테리오시달 메커니즘을 나타낸다. 호중구에서 ROS의 생산을 측정하는 것은 박테리아 호스트 상호 작용 중에 호스트의 방어를 시작하는 데 유용한 방법입니다.멸균 파이펫으로 접시에서 하나의 세균 식민지를 가지고 오목 한 플라스크에 리팜피신을 포함하는 다섯 밀리리터 브레인 - 심장 주입 매체에 넣어. 세균 배양을 37센티미터에서 배양하고, 인큐베이션 셰이커에서 17시간 동안 90RPM을 증식합니다. 5 분 동안 2000 RPM에서 말초 혈액 샘플을 원심 분리합니다.원심분리기 후에, 혈액 견본은 3개의 층으로 나뉩니다. 아래에서 위쪽으로, 적혈구 층, 백혈구 층 및 혈장 층. 백혈구층을 멸균 파이펫으로 새로운 튜브로 흡입합니다.적혈구 리시스 버퍼를 3배 추가합니다. 혼합물을 철저히 섞고 실온에서 5분간 놓습니다. 2000 RPM에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.슈퍼 상체를 완전히 흡인하고 폐기하십시오. 퇴적물이 하얗게 변할 때까지 적혈구의 용해 절차를 하나 또는 두 번 반복합니다. 2밀리리터 PBS로 퇴적물을 다시 중단하여 세포를 씻으라.그런 다음 튜브를 1000 RPM에서 5분 동안 원심분리합니다. 15 마이크로리터 프리코드 자기 세포 선별 버퍼로 퇴적물을 1,500만 개의 세포에 재부착한다. 마이크로리터 마그네틱 마이크로비드 15개에 넣고 잘 섞어줍니다.혼합물을 4센티미터에서 30분 동안 배양합니다. 정상적인 조건하에서, 성인 인간은 마이크로 리터 혈액 당 대략 4 10, 000 백혈구가 있습니다. 따라서 5밀리리터 인간의 말초 혈액에 있는 총 백혈구의 비용은 거의 5천만 미만입니다.그리고 15 마이크로 리터 자기 선별 버퍼에서 50 마이크로 리터 자기 구슬이 충분하다. 호중구의 정상 비율은 전체 백혈구의 50~70%이다. 따라서 약 1,000만 마리의 호중구가 5밀리리터 혈액에서 얻을 수 있습니다.튜브에 1,000만 개의 세포당 2밀리리터 자기 선별 버퍼를 추가하고 원심분리기를 4센티미터, 1, 200 RPM에서 10분 동안 추가하여 세포를 세척합니다. 자기 컬럼을 조립하고 선반을 분리합니다. 상체를 완전히 폐기하고 최대 1억 개의 셀에 대해 500 마이크로리터 자기 선별 버퍼로 퇴적물을 다시 중단합니다.3밀리리터 자기 선별 버퍼로 컬럼을 헹구는 다. 열에 부착된 자기 구슬에 의해 표지된 호중구를 허용하도록 셀 서스펜션을 열에 적용합니다. 매번 기둥 저장소가 비어 있으면 3밀리리터 버퍼를 세 번 추가하여 비특이적 특이적 셀을 씻어낸다.자기 분리기에서 컬럼을 제거하고 새 튜브에 넣습니다. 열에 5밀리리터 자기 선별 버퍼를 추가합니다. 플런저를 사용하여 마그네틱 표지된 세포를 밀어내보아.1, 200 RPM에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 수퍼내를 완전히 흡인시키고, 1밀리리터 배양 배지로 퇴적물을 재보편하게 한다. 카운터를 사용하여 셀 번호를 결정합니다.DHE 형광 프로브를 함유한 배양 배지에서 밀리리터당 세포 농도를 2백만 으로 조정하였다. 호중구를 인큐베이터에 30분 간 배치하여 DHE 프로브를 로드합니다. 셀 서스펜션을 96웰의 검정 마이크로플레이트에 잘 200 마이크로리터가 할당합니다.마이크로 플레이트 판독기를 켭니다. 온도를 37센티미터로 설정하고, 형광 읽기 모드, 운동 읽기 유형을 선택하고, 형광 파장을 설정합니다. 플레이트 형식을 선택합니다.판독 영역을 결정합니다. 1시간 동안 5분마다 형광 강도를 측정합니다. 각 읽기 전에 3 초 동안 접시를 흔들어.인큐베이터에서 마이크로 플레이트를 꺼내십시오. 세 번의 반복으로 PMA 또는 E44 균주를 추가합니다. 마이크로 플레이트 판독기에 접시를 넣고 시작 버튼을 눌러 즉시 분석서를 시작합니다.이 문서에서 프로토콜 개요를 사용하여 호중구는 인간의 말초 혈액으로부터 분리되고 형광 프로브 DHE로 로드되었습니다. PMA를 추가함으로써, 호중구에 있는 세포내 ROS는, 20에서 40 분으로 중요한 증가를 보여주었고, 60 분에 피크에 도달했습니다. 그러나 나는 E44 균주, ROS 생산이 즉시 발생하고 의존적으로 시간을 증가 생각합니다.E44 균주에 의한 ROS의 발현은 PMA에 의한 것과 유사합니다. 호중구에서 ROS 생산의 검출은 호중구의 박테리오시달 메커니즘의 추가 연구에 기여할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 실시간으로 호중구에서 ROS 생산을 검출하는 쉬운 방법을 제공합니다.간단한 방법은 또한 호스트 박테리아 상호 작용 도중 그밖 호스트 세포 모형에 있는 ROS 생산을 감시하기 위하여 이용될 수 있었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Neisseria meningitidis (NM), g 부정적인 인간 특정 호흡기 병원체가 인간 α - actinin에 바인딩할 수 있습니다. 여기 우리는 인간의 뇌 microvascular 내피 세포 (HBMECs)에 세균 입국 후 α - actinin 세포와 세균의 colocalisation의 시각화를위한 프로토콜을 제시한다.

의 세포 상호 작용 Visualisation 및 부량 Neisseria meningitidis</em공촛점 이미징에 의해 α - actinin>과 인간

이 비디오에서는 옵소니화된 박테리아 생물막에 노출되었을 때 호중구에 의한 활성 산소 종의 생성을 감지하는 체외 화학발광 분석을 시연합니다.

Opsonized Biofilm과의 상호 작용에 따른 호중구에 의한 ROS 생산 측정

감염의 사이트에서 활성화 된 내피 세포에 백혈구 준수는 호스트의 염증 반응의 중요한 구성 요소입니다. 수 있습니다 호중구 결합 분석은이 보고서에...

정량<em&gt; 체외</em정적 조건에서 활성화 된 기본 인간의 미세 혈관 내피 세포에 호중구 부착을 측정하는&gt; 분석

우리는 정량적 연구를위한 각종 아메바 및 포유류의 세포 모델에 적용 할 수있는 활성 산소 종 (ROS)의 측정을위한 일련의 프로토콜을 채택.

검출 시각화 및 아메바 모델 시스템에서 활성 산소 종의 생성을 정량

생체 발광 대장균 O1:K1:H7을 가진 신생아 마우스의 감염은 중요한 폐 염증 및 폐 병리를 가진 패혈증 감염을 초래합니다. 여기서는 전신 세균성 부담, 염증 성 프로파일링 및 폐 조직 병리학의 열거와 병행하여 세로 내 인트라비셔널 이미징을 사용하여 신생아 패혈증을 모델링하고 추가로 연구하는 절차를 설명합니다.

그람 음성 세균 패혈증의 신생아 화상 진찰 모형

여기에서는 뮐러 아교 세포 (MGC)에서 2',7'-dichlorofluorescein diacetate probe (DCFH-DA)를 사용하여 세포 반응성 산소 종 (ROS)을 검출하기위한 체계화되고 접근 가능하며 재현 가능한 프로토콜을 제안합니다. 이 방법은 유세포 분석기로 총 세포 ROS 수준을 정량화합니다. 이 프로토콜은 사용하기 매우 쉽고 적합하며 재현 가능합니다.

뮐러 신경교 세포에서 2',7'-디클로로플루오레세인 디아세테이트 프로브 및 유세포 분석기를 사용한 반응성 산소 종의 정량화

본 프로토콜은 호중구-생물막 상호작용의 연구를 기술한다. 황색포도상구 균 생물막은 시험관 내에서 확립되고 말초 혈액 유래 인간 호중구와 함께 배양됩니다. 호중구의 산화 파열 반응은 정량화되고 생물막 내의 호중구 국소화는 현미경으로 결정됩니다.

인간 호중구와 황색포도상구균 생물막 사이의 상호작용을 시각화하고 정량화하기 위한 표준화된 체외 분석

대사 세포외 플럭스 분석기를 사용하여 마우스와 인간 호중구 및 HL60 세포의 미토콘드리아 호흡을 측정하는 단계적 프로토콜을 설명합니다.

호중구의 미토콘드리아 생물에너지 프로파일의 실시간 측정

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

학습하세요 수막 대장균에 감염된 호중구에서 반응성 산소 종을 실시간으로 정량화하는 방법을. 형광 프로브와 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 호중구의 살균 메커니즘을 연구할 수 있습니다.

수막 대장균에 감염된 호중구의 반응성 산소 종의 실시간 정량화

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