Name: Somitogenesis를 지배하는 신호 진동의 기능적 조사를위한 미세 유체 학적 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 배우세요 마우스 배아의 신호 진동을 미세유체학적으로 조절하고 동기화하는 방법을. PDMS 칩 제작, 조직 배양, 실시간 영상 분석을 통해 발생 생물학에서 신호 역학의 기능을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

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UMC 위트레흐트의 양 리와 조스 말다(Jos Malda)가 금형의 3D 프린팅에 도움을 준 것, 프로토콜에 대한 매우 유용한 피드백을 받은 Sonn넨 그룹의 Karen van den Anker, 현미경 내의 미세 유체 칩 홀더를 위한 Hubrecht Institute의 기계 워크샵의 Tjeerd Faase에게 감사드립니다. 우리는 원고를 비판적으로 읽은 Sonnen 그룹 전체와 건설적인 피드백에 대한 검토자에게 감사드립니다. 이 작품은 ERC 시작 보조금 계약 No. 850554 K.F.S.에 따라 유럽 연구위원회 (European Research Council)로부터 자금을 지원받았습니다.

<ol><li>Manning, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+single-cell+live+imaging+links+HES5+dynamics+with+cell-state+and+fate+in+murine+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Quantitative single-cell live imaging links HES5 dynamics with cell-state and fate in murine neurogenesis.</a> Nature Communications. 10 (1), (2019).</li>
<li>Seymour, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jag1+modulates+an+oscillatory+Dll1-Notch-Hes1+Signaling+module+to+coordinate+growth+and+fate+of+pancreatic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Jag1 modulates an oscillatory Dll1-Notch-Hes1 Signaling module to coordinate growth and fate of pancreatic progenitors.</a> Developmental Cell. , 1-17 (2020).</li>
<li>Hubaud, A., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+dynamics+in+vertebrate+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signaling dynamics in vertebrate segmentation.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 709-721 (2014).</li>
<li>Aulehla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt3a+plays+a+major+role+in+the+segmentation+clock+controlling+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Wnt3a plays a major role in the segmentation clock controlling somitogenesis.</a> Developmental Cell. 4 (3), 395-406 (2003).</li>
<li>Aulehla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%CE%B2-catenin+gradient+links+the+clock+and+wavefront+systems+in+mouse+embryo+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A β-catenin gradient links the clock and wavefront systems in mouse embryo segmentation.</a> Nature Cell Biology. 10 (2), 186-193 (2008).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initiation+and+propagation+of+Hes7+oscillation+are+cooperatively+regulated+by+Fgf+and+Notch+signaling+in+the+somite+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">The initiation and propagation of Hes7 oscillation are cooperatively regulated by Fgf and Notch signaling in the somite segmentation clock.</a> Developmental Cell. 13 (2), 298-304 (2007).</li>
<li>Niwa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+types+of+oscillations+in+notch+and+Fgf+signaling+regulate+the+spatiotemporal+periodicity+of+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Different types of oscillations in notch and Fgf signaling regulate the spatiotemporal periodicity of somitogenesis.</a> Genes and Development. 25 (11), 1115-1120 (2011).</li>
<li>Sonnen, K. F., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+signal+encoding+-+From+cells+to+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic signal encoding - From cells to organisms.</a> Seminars in Cell and Developmental Biology. 34, 91-98 (2014).</li>
<li>Wahl, M. B., Deng, C., Lewandowski, M., Pourquié, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signaling+acts+upstream+of+the+NOTCH+and+WNT+signaling+pathways+to+control+segmentation+clock+oscillations+in+mouse+somitogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF signaling acts upstream of the NOTCH and WNT signaling pathways to control segmentation clock oscillations in mouse somitogenesis.</a> Development. 134 (22), 4033-4041 (2007).</li>
<li>Sonnen, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+phase+shift+between+Wnt+and+Notch+signaling+oscillations+controls+mesoderm+segmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modulation of phase shift between Wnt and Notch signaling oscillations controls mesoderm segmentation.</a> Cell. 172 (5), 1079-1090 (2018).</li>
<li>Sonnen, K. F., Merten, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+as+an+emerging+precision+tool+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Microfluidics as an emerging precision tool in developmental biology.</a> Developmental Cell. 48 (3), 293-311 (2019).</li>
<li>Baker, B. M., Trappmann, B., Stapleton, S. C., Toro, E., Chen, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+embedded+within+extracellular+matrix+to+define+vascular+architectures+and+pattern+diffusive+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidics embedded within extracellular matrix to define vascular architectures and pattern diffusive gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (16), 3246-3252 (2013).</li>
<li>Cimetta, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+device+generating+stable+concentration+gradients+for+long+term+cell+culture%3A+Application+to+Wnt3a+regulation+of+%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic device generating stable concentration gradients for long term cell culture: Application to Wnt3a regulation of β-catenin signaling.</a> Lab on a Chip. 10 (23), 3277-3283 (2010).</li>
<li>Demers, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development-on-chip%3A+In+vitro+neural+tube+patterning+with+a+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Development+%28Cambridge%29%22%5BJournal%5D)">Development-on-chip: In vitro neural tube patterning with a microfluidic device.</a> Development (Cambridge). 143 (11), 1884-1892 (2016).</li>
<li>Frank, T., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-switching+allows+independently+programmable%2C+extremely+stable%2C+high-throughput+diffusion-based+gradients%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flow-switching allows independently programmable, extremely stable, high-throughput diffusion-based gradients.</a> Lab on a Chip. 13 (7), 1273-1281 (2013).</li>
<li>Tay, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+NF-B+dynamics+reveal+digital+activation+and+analogue+information+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell NF-B dynamics reveal digital activation and analogue information processing.</a> Nature. 466 (7303), 267-271 (2010).</li>
<li>Kellogg, R. A., Gómez-Sjöberg, R., Leyrat, A. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+microfluidic+single-cell+analysis+pipeline+for+studies+of+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-throughput microfluidic single-cell analysis pipeline for studies of signaling dynamics.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1713-1726 (2014).</li>
<li>Kellogg, R. A., Tay, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+facilitates+transcriptional+control+under+dynamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noise facilitates transcriptional control under dynamic inputs.</a> Cell. 160 (3), 381-392 (2015).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+positioning+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Subcellular positioning of small molecules.</a> Nature. 411 (6841), 1016(2001).</li>
<li>Takayama, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+chemical+treatment+of+cellular+microdomains+using+multiple+laminar+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective chemical treatment of cellular microdomains using multiple laminar streams.</a> Chemistry & Biology. 10 (2), 123-130 (2003).</li>
<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab on a Chip. 13 (18), 3599-3608 (2013).</li>
<li>Li, C. Y., Wood, D. K., Huang, J. H., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-based+pipeline+for+systematic+modulation+and+analysis+of+3D+tumor+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Flow-based pipeline for systematic modulation and analysis of 3D tumor microenvironments.</a> Lab on a Chip. 13 (10), 1969-1978 (2013).</li>
<li>Tumarkin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+combinatorial+cell+co-culture+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">High-throughput combinatorial cell co-culture using microfluidics.</a> Integrative Biology. 3 (6), 653-662 (2011).</li>
<li>Berthier, E., Young, E. W. K., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineers+are+from+PDMS-land%2C+biologists+are+from+polystyrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Engineers are from PDMS-land, biologists are from polystyrenia.</a> Lab on a Chip. 12 (7), 1224-1237 (2012).</li>
<li>Lauschke, V. M., Tsiairis, C. D., François, P., Aulehla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaling+of+embryonic+patterning+based+on+phase-gradient+encoding%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scaling of embryonic patterning based on phase-gradient encoding.</a> Nature. 493 (7430), 101-105 (2013).</li>
<li>Lo, J. F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+and+temporal+control+of+oxygen+microenvironment+at+the+single+islet+level%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Quantitative and temporal control of oxygen microenvironment at the single islet level.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (81), (2013).</li>
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<li>Lucchetta, E. M., Lee, J. H., Fu, L. A., Patel, N. H., Ismagilov, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+Drosophila+embryonic+patterning+network+perturbed+in+space+and+time+using+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dynamics of Drosophila embryonic patterning network perturbed in space and time using microfluidics.</a> Nature. 434 (7037), 1134-1138 (2005).</li>
<li>Nikolaev, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+mini-intestines+through+scaffold-guided+organoid+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis.</a> Nature. , (2020).</li>
<li>Sanka, R., Lippai, J., Samarasekera, D., Nemsick, S., Densmore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D%C2%B5F+-+Interactive+design+environment+for+continuous+flow+microfluidic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">3DµF - Interactive design environment for continuous flow microfluidic devices.</a> Scientific Reports. 9 (1), 1-10 (2019).</li>
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<li>Yoshioka-kobayashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+delay+controls+synchronized+oscillation+in+the+segmentation+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coupling delay controls synchronized oscillation in the segmentation clock.</a> Nature. 16, (2019).</li>
<li>Mönke, G., Sorgenfrei, F. A., Schmal, C., Granada, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+time+frequency+analysis+for+biological+data+-+pyBOAT%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimal time frequency analysis for biological data - pyBOAT.</a> bioRxiv. , (2020).</li>
<li>Toettcher, J. E., Voigt, C. A., Weiner, O. D., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promise+of+optogenetics+in+cell+biology%3A+Interrogating+molecular+circuits+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The promise of optogenetics in cell biology: Interrogating molecular circuits in space and time.</a> Nature Methods. 8 (1), 35-38 (2011).</li>
<li>Dettinger, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+microfluidic+system+for+dynamic+stimulation+and+tracking+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Automated microfluidic system for dynamic stimulation and tracking of single cells.</a> Analytical Chemistry. 90 (18), 10695-10700 (2018).</li>
<li>Manfrin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+signaling+centers+for+the+spatially+controlled+patterning+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Engineered signaling centers for the spatially controlled patterning of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 16 (7), 640-648 (2019).</li>
<li>Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organoids-on-a-chip.</a> Science. 965, 960-965 (2019).</li>
<li>Krenger, R., Cornaglia, M., Lehnert, T., Gijs, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for%3A+Caenorhabditis+elegans+culture+and+oxygen+consumption+rate+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for: Caenorhabditis elegans culture and oxygen consumption rate measurements.</a> Lab on a Chip. 20 (1), 126-135 (2019).</li>
</ol>

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신호 역학이 다세포 시스템을 어떻게 제어하는지는 이 분야에서 오랫동안 제기되어 왔습니다. 기능적 조사는 중요한 도전 과제인데, 왜냐하면 이러한 역학은 이것을 허용하기 위해 미묘하게 변조되어야하기 때문입니다.11. 경로 교란에 대한 이러한 시간적 제어는 원칙적으로 광유전학으로 달성될 수 있으며, 이는 또한 높은 공간 조절을 가능하게 한다34. 그러나 광유전학은 문제의 각 신호 전달 경로를 분석하기위한 정교한 유전 도구의 확립을 필요로합니다. 여기에 설명된 현재 프로토콜은 모든 신호전달 경로의 교란을 위한 매우 다재다능한 도구를 제공한다. 미세 유체 학적 실험을 통해 일시적으로 제어 된 약물 펄스를 적용하여 조직 배양에서 신호 전달 경로의 역학을 기능적으로 조사 할 수 있습니다. 여기서, 초점은 생체외 배양물에서의 소미토제네시스의 연구에 있지만, 프로토콜은 임의의 다른 모델 시스템에 적합하도록 적응될 수 있다.
프로토콜의 특정 단계는 성공적인 미세유체학 실험을 수행하는 데 매우 중요합니다(표 1에 요약됨). 요점은 다음과 같이 논의됩니다. 실험 과정 동안 배지 흐름으로 인해 조직 배양은 전단 스트레스를 경험합니다. 모델 시스템이 연속 흐름에 노출되면 세포 스트레스가 발생할 수 있으며 극단적 인 경우 전단 효과로 인한 세포 사멸이 발생할 수 있습니다. 마우스 테일 버드의 생체 외 조직 배양 및 현재 칩 설계의 경우, 60 μL / h (최대 100 μL / h)의 유량이 최소한의 전단 효과로 잘 작동하는 것으로 나타났습니다. 동일한 칩에 대해 여러 펌프가 동시에 켜지면 개별 펌프의 유량을 적절하게 조정하여 총 유량이 증가하지 않도록 해야 합니다. 현재 프로토콜이 다른 모델 시스템 및 칩 설계에 맞게 조정되면 유량이 최적화되어야 합니다. 대안적으로, 매질을 연속적으로 플러시하지 않고, chip35 상의 매질을 주기적으로 변경할 수 있다. 이러한 설정은 또한 마우스 소미토제네시스(미공개, 데이터 미도시)에서 신호전달 진동을 제어하는데 적용될 수 있다. 또한, 조직 배양이 직접적인 유체 흐름에 노출되지 않고 약물이 이웃 채널에서 확산되어 조직에 도달하는 설정도 구상 될 수 있습니다. 이러한 시스템은 ESC 분화의 시험관내 모델에 성장 인자의 구배를 적용하는데 성공적으로 사용되었다14,36.
미세 유체 실험의 한 가지 주요 쟁점은 실험 중에 기포가 온칩으로 발생한다는 것입니다. 칩 또는 튜브 내의 기포는 칩 상의 균일한 액체 흐름을 방해할 수 있고 그 위치에서 배아 배양물의 제거로 이어질 수 있다. 기포의 존재를 방지하기 위해, 프로토콜의 다양한 단계는 필수적이다. 먼저, 주사기 내의 배양 배지 및 미세유동 칩 자체는 데시케이터를 사용하여 탈기되어야 한다(단계 3.1.3). 둘째, 샘플을 로딩 입구에 로딩 할 때, 샘플과 함께 칩에 공기를 파이프하지 않도록주의해야합니다 (3.2.3 단계). 셋째, 튜브를 매체로 채울 때 칩을 부착하기 전에 모든 기포를 펌핑해야합니다 (3.3.2 단계). 그렇지 않으면, 이러한 기포는 실험 중에 메인 칩으로 밀려날 것이다. 마지막으로, 실험 동안, 배지는 반투과성 튜빙으로 인해 이미징 챔버 또는 인큐베이터 내에서 평형화된다. 튜빙의 투과성은 또한 매체의 증발을 허용하므로 튜브에 새로운 기포가 형성되는 것을 방지하기 위해 실험 중에 습도가 조절되도록하십시오.
일반적으로 미세 유체 공학은 연구자의 특정 질문에 적용 할 수있는 매우 다양한 도구입니다. 현재의 설계 접근 방식은 칩 당 최대 12 개의 생체 외 배양물을 병렬로 이미징 할 수 있습니다. 이 숫자는 주로 실험 당 배아의 수와 충분한 해상도로 각 배아 배양을 이미지화하는 데 걸리는 시간에 의해 제한됩니다. 단일 실험에서 여러 조건을 비교해야 하는 경우 단일 유리 슬라이드에 여러 칩을 장착할 수 있습니다. 칩 설계가 제공되어 여러 조직 외식편을 병렬로 이미징하는 데 이상적이지만 개인화 된 설계는 높은 처리량 분석을 허용하고 단일 실험 내에서 더 많은 조건의 조합을 증가시키기 위해 샘플 수의 한계를 극복 할 수 있습니다16,17. 마이크로유체학은 칩 상에서 배양될 수 있는 모델로 제한되며, 온칩 배양은 각 모델 시스템에 대해 개별적으로 최적화되어야 할 것이다27,37,38.
지난 5-10 년 동안 미세 유체 공학은 높은 처리량 접근법과 신호 역학 및 구배의 미묘한 변조에 대한 잠재력으로 인해 다양한 생물학적 질문을 해결하기 위해 적용되었습니다. 요즘 미세 유체 공학은 실험실에서 쉽게 설정할 수있는 쉽게 적용 할 수 있고 저렴하며 다재다능한 도구가되었습니다. 여기서, 현재의 프로토콜은 특정 응용, 즉 소미토제네시스를 지배하는 신호전달 역학을 연구하는 데 최적화되어 있다. 조직 생물학의 개별 연구 질문에 맞게 이 프로토콜과 디자인을 적용하는 것은 간단합니다.

발달은 신호전달 경로를 통한 세포간 통신에 의해 제어된다. 조직과 공간의 적절한 세포 분화를 조율하는 신호 전달 경로의 수는 제한되어 있습니다. 이러한 다수의 프로세스를 조절하기 위해, 정보는 신호전달 경로의 역학, 신호1,2의 주파수 또는 지속기간과 같은 시간에 따른 경로의 변화로 인코딩될 수 있다.
소미토제네시스 동안, 소미틱 조직은 프레소미틱 중배엽(PSM)3으로부터 주기적으로 분절된다. PSM은 Wnt, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및 레티노산 신호전달의 구배에 의해 공간적으로 조직된다. Wnt 및 FGF 신호가 낮은 결정 전방의 전방 PSM에서, 세포는 소미트로 분화하기 위해 프라이밍된다. 분화는 전사 활성화의 파동이 이러한 결정 전선에 도달할 때 발생한다. PSM 내에서, Wnt, FGF, 및 노치 신호전달이 발진한다. 이웃 세포는 위상에서 약간 벗어나 진동하며, 이로 인해 Wnt, FGF 및 Notch 경로의 하류에서 후방으로 이동하는 진동 전사 활성화의 파동이 발생합니다. 마우스 배아에서, 전사파는 대략 매 2 시간마다 결정 전면에 도달하고 소마이트 형성을 개시한다. 신호전달 경로를 교란시키거나 활성화시킴으로써 소미토제네시스를 연구하는 것은 이러한 경로의 중요성을 예시할 수 있다4,5,6,7,8,9. 그러나, 세포 거동의 조절에서 신호전달 역학의 기능을 조사할 수 있으려면, 신호전달 경로를 영구적으로 활성화하거나 억제하는 대신 미묘하게 조절하는 것이 필수적이다.
분절된 마우스 배아 내의 신호전달 경로 활성을 시간적으로 조절하기 위해, Sonnen et al.은 미세유체 시스템10을 개발하였다. 이 시스템은 생물학적 샘플11을 포함하는 칩의 마이크로채널 내에서 유체 유동의 엄격한 제어를 허용한다. PSM의 적절한 세분화를 위한 신호전달 역학의 중요성을 연구하기 위해, 이러한 미세유체학 셋업은 마우스 세그멘테이션 클럭 ex vivo의 신호전달 역학을 조절하는데 이용된다. 경로 활성화제 또는 억제제를 배양 챔버 내로 순차적으로 펄싱함으로써, Wnt, FGF 및 Notch 신호전달의 역학의 외부 조절이 달성된다10. 예를 들어, 개별 경로의 기간과 다수의 진동 신호전달 경로 사이의 위상 관계를 수정할 수 있다. 동적 신호 전달 리포터의 수반되는 실시간 이미징을 사용하여 경로 자체에 대한 연행의 효과, 분화 및 소마이트 형성에 미치는 영향을 분석 할 수 있습니다. 신호전달 역학에 대한 이러한 수준의 제어를 사용하여, 소미토제네시스 동안 Wnt-와 Notch-신호전달 경로 사이의 위상 관계의 중요성을 강조하였다10.
개인화된 칩 설계는 로컬 환경 내의 시공간 교란에 대한 많은 옵션, 예를 들어, 안정적인 기울기 형성12,13,14,15, 맥박 활성화/억제10,16,17,18 또는 국부적 교 란19,20 . Microfluidics는 또한 실험 처리의 자동화로 인해 더 재현 가능한 판독 및 더 높은 처리량을 가능하게 할 수 있습니다.21,22,23. 본 프로토콜은 미세유체학 및 조직 내의 내인성 신호전달 진동의 동반을 모든 표준 생명과학 실험실에 도입하기 위한 것이다. 클린 룸 및 소프트 리소그래피 장비와 같은 칩 생성을위한 정교한 장비가없는 경우에도 미세 유체 칩을 제조하고 생물학적 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다. 금형은 자유롭게 사용할 수 있는 CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 설계할 수 있습니다. 일반적으로 폴리디메틸실록산(PDMS)으로 구성된 미세유체 칩 생성용 금형은 3D 프린터로 인쇄하거나 인쇄 회사에서 주문할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 미세유체 칩은 고가의 장비의 요구 없이 하루 이내에 생산될 수 있다24. 여기서, 칩 설계가 제공되며, 이와 함께 2차원(2D) 생체외 배양물25에서 마우스 세그멘테이션 클럭의 연입을 위한 몰드가 3D 프린터로 인쇄될 수 있다.
미세 유체 공학에 의해 활성화 된 온칩 배양과 정확한 교란은 신호 전달 경로가 다세포 행동을 제어하는 방법의 분자 메커니즘을 푸는 데 탁월한 잠재력을 가지고 있습니다. 신호 역학 및 형태소 구배는 개발중인 많은 프로세스에 필요합니다. 이전에, 실험실은 세포, 조직 및 전체 유기체를 미세유체 칩에서 배양하였고, 주로 2D 세포 배양의 시공간 교란을 위한 프로토콜이 다른 곳에 제공되었다12,26,27,28,29. 다세포 시스템에서 로컬 환경을 변조하기 위해 미세유체학을 적용하면 높은 처리량과 정밀한 시공간 교란에 대한 새로운 관점이 열립니다. 미세 유체 공학 분야는 이제 발달 생물 학자들에게 비 전문적이고 저렴하며 쉽게 적용 할 수있는 도구가되었다는 점에 도달했습니다.
여기서, Notch 신호전달 억제제의 펄스에 대한 마우스 세그멘테이션 클럭의 연입에 대한 프로토콜이 제공된다. 이러한 실험은 (1) 미세유체 칩의 생성, (2) 튜브의 제조 및 칩의 코팅, 및 (3) 미세유체 실험 자체(도 1A)로 구성된다. 척추동물 모델 시스템과 관련된 연구는 책임있는 위원회의 사전 윤리적 승인이 필요합니다.

<table><tbody><tr><td>10 mL 주사기</td><td>Becton, Dickinson and company</td><td>300912</td><td></td></tr><tr><td>184 실리콘 엘라스토머 경화제</td><td>SYLGARD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>184 실리콘 엘라스토머 PDMS</td><td>SYLGARD</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>3 ml 주사기</td><td>Becton, Dickinson and company</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>접착 테이프</td><td></td><td></td><td>스카치 매직 테이프 또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>무딘 끝 집게 Bochem 18/10 스테인레스 스틸</td><td>Fisher Scientific</td><td>10663341</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 동결 건조 pH ~ 7</td><td>Biowest</td><td>P6154</td><td></td></tr><tr><td>압축 공기 시스템</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>결정화 접시</td><td>VWR</td><td>10754-7</td><td>멸균</td></tr><tr><td>D-(+) - 포도당 45 %</td> <td>Sigma</td><td>G8769</td><td></td></tr><tr><td>건조기</td><td>VWR</td><td>467-0104</td><td></td></tr><tr><td>일회용 컵</td><td>Duni</td><td>173 941</td><td></td></tr><tr><td>일회용 포크</td><td>스테이플</td><td>511514</td><td></td></tr><tr><td>해부 장비</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM / F12</td><td>세포 배양 기술</td><td>맞춤형</td><td>DMEM / F-12, 페놀 레드 없음, L- 글루타민 없음, 포도</td></tr>당 <tr><td>피브로넥틴</td> 없음 <td>시그마</td><td>F1141-5MG</td><td></td></tr><tr><td>플로우 후드 Baker 511514의 BioVanguard Greenline</td><td>CleanAir</td><td></td><td>UV 광원</td></tr><tr><td>용 유리 슬라이드 번호 1.5H 고정밀, 70x70 mm</td><td>Marienfeld</td><td>107999098</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 버퍼</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>현미경</td><td>Leica</td><td>Leica SP8 MP</td><td></td></tr><tr><td>바늘 22G</td><td>Becton, dickinson 및 회사</td><td>z412139-100EA</td><td></td></tr><tr><td>오븐</td><td>VWR</td><td>390-09</td><td></td></tr><tr><td>PBS0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 오븐 펨토</td><td>다이너 전자</td><td></td><td></td></tr><tr><td>펀치 &오슬래시; 1mm</td><td>유니-코어</td><td>WB100073</td><td></td></tr><tr><td>스케일</td><td>싸토리우스</td><td>엔트리스</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프</td><td>WPI</td><td>AL-4000</td><td></td></tr><tr><td>튜빙 &오슬래시; 1mm</td><td>APT</td><td>AWG24T</td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>VWR</td><td>181-0308</td><td></td></tr></tbody></table>

somitogenesis를 지배하는 신호 진동의 기능적 조사를위한 미세 유체 학적 접근법

A Microfluidics Approach for the Functional Investigation of Signaling Oscillations Governing Somitogenesis

발달하는 마우스 배아의 전소성 중배엽의 주기적 분할은 신호전달 경로의 네트워크에 의해 조절된다. 신호 진동과 기울기는 각각 세그먼트 형성의 타이밍과 간격을 제어하는 것으로 생각됩니다. 관련된 신호 전달 경로가 지난 수십 년 동안 광범위하게 연구되었지만, somitogenesis를 제어하는 신호 진동의 기능에 대한 직접적인 증거는 부족했습니다. 신호 역학의 기능적 조사를 가능하게하기 위해, 미세 유체학은 이러한 역학의 미묘한 변조를위한 이전에 확립 된 도구입니다. 이 미세유체 기반 연행 접근법을 통해 내인성 신호 진동은 경로 조절기의 펄스에 의해 동기화됩니다. 이것은 예를 들어, 진동 기간 또는 두 진동 경로 사이의 위상 관계의 변조를 가능하게 한다. 또한, 경로 조절제의 공간 구배는 조직을 따라 확립되어 신호 구배의 특정 변화가 소미토제네시스에 어떻게 영향을 미치는지 연구할 수 있다.
본 프로토콜은 미세유체학의 최초 사용자를 위한 미세유체 접근법을 확립하는 것을 돕기 위한 것이다. 미세 유체 시스템을 설정하는 데 필요한 기본 원리와 장비가 설명되고 칩 설계가 제공되어 3D 프린터를 사용하여 칩 생성을위한 금형을 편리하게 준비 할 수 있습니다. 마지막으로, 미세유체 칩 상에서 일차 마우스 조직을 배양하는 방법 및 경로 조절제의 외부 펄스에 대한 신호전달 진동을 수반하는 방법이 논의된다.
이러한 미세유체 시스템은 또한 다른 맥락에서 신호전달 역학 및 모르포겐 구배의 기능적 조사를 위해 위스트룰로이드 및 오가노이드와 같은 다른 생체 내 및 시험관내 모델 시스템을 보유하도록 적응될 수 있다.

이 프로토콜로, 미세유체학을 이용한 마우스 세그멘테이션 클럭의 신호전달 진동의 외부 연입에 대한 방법이 제시된다. Notch 신호전달 억제제의 펄스를 적용함으로써, 독립적인 배아 배양물에서의 신호전달 진동은 서로 동기화된다10. 세그멘테이션 클럭의 기능을 연구하기 위해 이 시스템을 적용하기 위한 전제 조건은 시그널링 다이내믹과 세그멘테이션이 여전히 온칩에 존재한다는 것이다. 이전에 Wnt 및 Notch 신호 전달 역학은 일정한 배지 흐름에도 불구하고 유지되고 물리적 경계 형성은 전방 PSM10을 나타내는 말초 2D 배양물에서 지속된다는 것을 이전에 보여주었습니다.
외부 약물 펄스에 대한 신호전달 진동의 수반을 확인하기 위해, 미세유체 실험 동안 황색 형광 단백질 금성을 발현하는 Notch 신호전달 리포터 LuVeLu5의 실시간 이미징이 수행된다. 칩 상의 2D 배양물의 배향은 제어하기 어렵기 때문에, 전방 조직에서의 신호전달 진동이 분석된다. 2D 배양물의 주변은 재현 가능하게 검출될 수 있다. 온칩 조직 절편의 방향은 마음대로 제어 할 수 없으며 칩의 전체 내부 표면은 피브로넥틴으로 코팅됩니다. 따라서 문화가 칩의 측면이나 천장에 부착되는 경우가 종종 있습니다. 샘플이 시야각(x, y 및 z 방향)에서 벗어나거나 꼬리의 후부 끝이 아래쪽을 향하도록 부착하는 경우 일반적으로 이러한 샘플은 제외됩니다.
추가 분석을 위해, 이러한 연입 실험의 배수가 결합된다. 독립적인 실험은 대략 400 nm에서 염료, 캐스케이드 블루에 의해 시각화된 약물 펄스의 타이밍을 사용하여 서로 정렬될 수 있다. 동기화를 분석하고 시각화하기 위해 정량화된 진동을 추세를 낮춘 다음(그림 2B,D) 평균 및 표준 편차로 표시하거나 진동의 위상을 계산할 수 있습니다. 이를 통해 독립적 인 후부 배아 배양의 진동과 외부 약물 펄스 간의 위상 관계를 분석 할 수 있습니다 (그림 2C, E). 파이썬 기반 프로그램 pyBOAT33은 이러한 신호 진동의 주기, 위상 및 진폭을 결정하는 간단하고 사용자 친화적 인 도구입니다. 동반을 확인하기 위해, 예를 들어, 내인성 신호 진동의 기간을 결정할 수 있습니다. 130분의 주기로 펄스를 인가할 때, 노치 신호 진동은 또한 130분의 기간을 나타낸다(그림 2F)10. 또한, 캐스케이드 블루 펄스를 사용하여, 상이한 시그널링 리포터를 갖는 독립적인 실험이 서로 정렬될 수 있다. 이러한 방식으로 다수의 시그널링 리포터들의 진동들 사이의 위상 관계가 간접적으로 결정될 수 있다10.
따라서, 제시된 미세유체 시스템은 발달하는 마우스 배아의 생체외 배양물에서 신호전달 진동의 조절을 허용한다. 세그먼트 형성 및 분화를 위한 마커의 이미징과 함께, 이 시스템은 이제 세분화 시계의 신호전달 경로가 어떻게 상호작용하는지, 그리고 이들이 소마이트 형성을 어떻게 조절하는지를 해부하는데 적용될 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig01.jpg"> 그림 1: 미세유체 프로토콜의 개략적인 개요. (A) 칩 금형은 CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 설계할 수 있습니다. 마우스 소미토제네시스의 생체외 모델에서 신호전달 진동을 훈련시키기 위한 칩 설계가 제공된다. 예를 들어, 금형은 3D 인쇄로 생성되거나 주문할 수 있습니다. 미세유체 칩은 PDMS의 성형에 의해 생산된다. 경화된 PDMS 칩은 절단되고 플라즈마 오븐을 사용하여 유리 슬라이드에 공유 결합된다. 칩 내의 유리 표면은 해부 된 조직이 부착 될 수 있도록 피브로넥틴으로 코팅되어 있습니다. 배아 조직은 로딩 입구를 통해 칩 상에 로딩되고, 이는 이후에 폐쇄된다. 다른 매체 조건을 가진 펌프가 칩의 입구에 부착되고 흐름 프로그램이 초기화됩니다. 조직은 실험 동안 공초점 현미경을 사용하여 이미징 할 수 있습니다. (Sonnen et al., 201810에서 채택 된 Kymographs. Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0에 따라 Cell에서 재인쇄 및 수정되었습니다.) (b) 후부 마우스 배아 조직의 온칩 배양을 위한 주형 설계의 개략도도. 미세유체 채널의 높이는 500 μm이며, 배아 후부 마우스 꼬리의 배양에 충분하다. 이 몰드를 인쇄하는 파일은 보충 파일 1에 제공되며 대안은 보충 파일 2에 제공됩니다. (c) PDMS 기둥 온칩으로 둘러싸인 E10.5 단면화된 마우스 꼬리의 브라이트필드 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62318/62318fig02.jpg"> 도 2: 미세유체학 실험의 대표적인 결과. (A) 배지 및 약물 펌프를 이용한 동반 실험의 개략적인 표현. 신호전달 경로 조절제의 펄스는 마우스 배아의 생체외 배양에 적용되고, 신호전달 진동은 동적 신호전달 리포터(예를 들어, 노치 신호전달 리포터 LuVeLu5 및 Wnt 신호전달 리포터 Axin2T2A10)의 실시간 이미징에 의해 시각화될 수 있다. 파선은 시간 경과에 따른 분석에 사용되는 영역을 나타냅니다. (B-F) LuVeLu 리포터 진동은 노치 신호전달 억제제 DAPT의 주기적 펄스에 의해 수반된다. (B,D) DAPT 또는 DMSO 대조군을 사용하여 인연행시 전방 PSM에서의 노치 신호 진동의 정량화. (C,E) 노치 신호 진동의 위상과 외부 DAPT/DMSO 펄스의 타이밍 사이의 위상-위상 관계 플롯. 동반의 경우, 안정된 위상 관계가 확립된다. (f) DMSO 및 DAPT 펄스로 연행된 샘플을 비교하는 리포터 진동의 평균 기간 및 SEM의 정량화. (Sonnenet al., 201810에서 채택 된 그림. Creative Commons Attribution CC BY-NC-ND 4.0.)에 따라 Cell에서 재인쇄 및 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/62318fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>문제</td>
			<td>제안된 솔루션</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">PDMS는 유리에 결합하지 않는다.</td>
			<td>- PDMS와 유리가 모두 깨끗한지 확인하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 챔버 주위에 본딩을 위해 충분한 PDMS가 있는지 확인하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 플라즈마 오븐의 설정을 최적화합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="4">내 칩에 기포가 있습니다.</td>
			<td>- 펌프가 켜져 있는지 확인합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 칩에 조직을 로딩하기 전에 칩을 탈기합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 실험 시작 전에 배지를 탈기한다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 인큐베이션 챔버의 습도가 충분히 높은지 확인하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">조직은 실험 초기에 죽습니다.</td>
			<td>- 칩을 적재하고 조립 할 때 매체에 HEPES를 추가하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 로딩하는 동안 조직을 너무 자주 안팎으로 플러시하지 마십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 유속이 너무 높지 않은지 확인하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">조직은 이미징 중에 사망합니다.</td>
			<td>- 영상에서 광독성이 없는지 확인</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 오염이 없는지 확인하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 유속이 너무 높아서는 안됩니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">이미징 중에 초점이 변경됩니다.</td>
			<td>- 이미징 중에 자동 초점을 사용하여 이미징 슬라이드의 드리프트를 조정합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 칩이 적어도 30 분 동안 현미경 내의 온도와 평형화되도록하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>콘센트/입구 분리.</td>
			<td>- 모든 튜브를 완전히 아래로 밀어 내립니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">칩의 유리가 깨집니다.</td>
			<td>- 더 조심하십시오, 유리는 매우 연약합니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 얇은 유리는 이미징에만 필요합니다. 이미징이 수행되지 않으면 일반적으로 더 두꺼운 유리 슬라이드를 사용할 수 있습니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 브레이크가 칩 외부에 있으면 문제가되지 않을 수 있습니다. 칩의 유리 씰이 파손되면 액체가 새어 나와 공기가 들어옵니다.</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">내 칩에 오염이 있습니다.</td>
			<td>- 배양 배지에 항생제를 첨가하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 모든 장비와 튜브를 살균하십시오.</td>
		</tr>
<tr>
<td>- 빠르고 깨끗하게 작업하십시오.</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 문제 해결
보충 파일 1: 3D 프린터로 금형을 인쇄하기위한 STL 파일. 이 주형은 후부 배아 조직의 온칩 배양을 위한 미세유동 칩을 생성하는데 사용된다( 도 1에 도시된 설계). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-1.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 2: STL 파일은 후부 배아 조직의 온칩 배양을 위한 미세유동 칩을 생성하기 위해 3D 프린터로 주형을 인쇄한다. 보충 파일 1 및 그림 1에 표시된 설계와는 달리, 이 설계에는 소량의 공기가 주 미세 유체 챔버로 유입되는 것을 방지하기 위해 입구에 버블 트랩이 포함되어 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-2.stl" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 3 : 칩을 현미경에 넣을 홀더를 생성하기위한 설계 파일. 이 홀더는 96웰 플레이트의 치수를 가지며 대부분의 현미경의 표준 홀더에 맞아야 합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62318/Supp-file-3.dwg" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

미세유동 칩 상에서 마우스 배아 조직의 배양 및 조작을 위한 프로토콜이 제공된다. 경로 조절제의 펄스를 적용함으로써, 이 시스템은 마우스 소미토제네시스의 기능적 조사를 위해 신호전달 진동을 외부적으로 제어하는데 사용될 수 있다.

Somitogenesis를 지배하는 신호 진동의 기능적 조사를위한 미세 유체 학적 접근법

Periodic segmentation of the presomitic mesoderm of a developing mouse embryo is controlled by a network of signaling pathways. Signaling oscillations and ...

다세포 시스템을 제어하는 신호 전달 경로는 동적입니다. 이러한 역학의 기능을 이해하려면 전체 신호 활동에 영향을 미치지 않고 이러한 역학을 미묘하게 변조 할 수 있어야합니다. 이 프로토콜은 마우스 배아 개발에서 신호 진동의 기능적 해부를 허용하는 미세 유체 시스템을 사용합니다.신호 역학은 성인 조직을 포함한 많은 조직에서 발견되었습니다. Microfluidics는 세포, 조직 및 오가노이드 배양을 포함한 많은 모델 시스템에 맞게 조정할 수있는 다목적 도구입니다. 시작하기 위해, 중합을 유도하기 위해 단량체와 촉매를 아홉 대 일 비율로 혼합함으로써 필요한 양의 PDMS를 준비한다.일회용 도구를 사용하고 혼합이 제대로 이루어 졌는지 확인하십시오. PDMS 혼합물을 데시케이터에 넣고 약 30분 동안 진공을 적용하여 공기를 제거한다. 약 3 ~ 5 밀리미터의 PDMS 층을 칩 몰드에 붓고 약 30 분 동안 데시케이터에 다시 넣으십시오.금형 재료에 따라 섭씨 65도 이하에서 하룻밤 사이에 오븐에 넣어 금형을 치료하십시오. 메스를 사용하여 칩을 금형에서 잘라냅니다. 펀치 입구 및 출구 구멍은 미세 유체 챔버의 내부에서 시작하는 하나의 밀리미터 생검 펀치로 시작됩니다.유리 슬라이드를 압축 공기로 청소하십시오. 칩을 유리 슬라이드에 결합하려면 칩과 유리 슬라이드를 측면이 위를 향하도록 접착할 수 있도록 플라즈마 오븐에 넣습니다. 사용 된 기계에 특정한 프로토콜을 사용하여 플라즈마를 생성 한 다음 활성화 된 표면을 서로 배치하고 압력을 고르게 가하여 칩을 유리에 결합하십시오.실험용 튜빙 및 칩을 제조하기 위해, 튜빙을 45도 각도로 절단하고 각각의 튜빙에 하나의 바늘을 부착한다. 바늘, 칩 및 플러그가있는 튜브를 접시에 넣고 약 15 분 동안 자외선에 노출시켜 살균하십시오. 칩을 피브로넥틴으로 코팅하려면, 실온에서 PBS와 1%페니실린 또는 스트렙토마이신을 함유하는 비이커에 칩을 넣는다.칩을 PBS로 플러시하여 P200 피펫으로 공기를 제거합니다. 칩의 각 챔버에 대해 세 밀리리터 주사기를 로드합니다. 피브로넥틴이 들어있는 주사기에 바늘을 부착하고 주사기를 주사기 펌프에 연결하십시오.수동으로 플러시 튜브를 사용하여 공기를 제거하십시오. 칩의 출구에 콘센트 튜브를 부착하십시오. 튜브를 바닥까지 끝까지 밀고 칩을 코팅하기 위해 낮은 유량을 설정하십시오.주사기 펌프를 적어도 두 시간 또는 하룻밤 동안 작동시키십시오. 끝나면 펌프를 멈추고 바늘 바로 뒤에 튜브를 차단하십시오. 실험을 위한 배지로 채워진 주사기를 준비하고, PBS 내에서 배양 배지 및 칩 둘 다를 탈기시킨다.칩에서 대부분의 기포를 내뿜거나 빨아 들인 다음 펌프에 주사기를 설치하고 주사기에 입구 튜브를 부착하십시오. 조직을 칩에 적재하려면 꼬리의 가장 뒤쪽 끝을 해부하십시오. 칩을 배양 배지로 플러시하여 25 마이크로몰 HEPES로 PBS를 제거하였다.P200 피펫을 사용하여 조직을 칩에 로드합니다. 각 조직 로딩 단계 후에, PDMS 충전된 튜빙의 조각을 사용하여 상응하는 조직 로딩 입구를 닫는다. 미세유체 설정을 조립하려면 내부에 기포가 생기지 않고 튜브를 미세유체 칩에 부착하십시오.이렇게하려면 튜브 끝에 배지 한 방울이 있는지 확인하십시오. 모든 튜브가 칩에 부착되면 비이커에서 꺼내어 젖은 티슈가 들어있는 접시에 넣으십시오. 접시와 약 1.5 미터의 입구 튜브를 하룻밤 배양을위한 인큐베이터에 넣으십시오.배양 중 기포가 형성되지 않도록 높은 습도를 확보하십시오. 대안으로, 칩의 외부를 건조시키고 현미경 홀더에 넣은 다음, 라이브 이미징 실험을 위해 거꾸로 된 현미경의 인큐베이션 챔버 내부에 홀더와 약 1.5 미터의 입구 튜브를 넣는다. 적어도 20분의 일정한 흐름 후에, 실험을 위해 계획된 펌핑을 시작한다.분절된 마우스 배아에서 노치 신호전달을 훈련시키려면, 실험이 끝날 때까지 100분 배지 및 30분 동안 반복되는 약물 펄스의 펌핑 프로그램을 사용하여, 전형적으로 24시간 동안 반복한다. 실시간 이미징의 경우 최소 30분 후에 이미징을 시작합니다. 신호 진동의 동반을 확인하기 위해 여러 실험이 약물 펄스의 타이밍을 사용하여 정렬되고 캐스케이드 블루 염료로 시각화됩니다.정량화된 진동은 추세를 낮추고 평균으로 표시할 수 있으며 진동의 표준 편차 또는 위상을 계산할 수 있습니다. 독립적인 후부 배아 배양물의 진동과 외부 약물 펄스 사이의 위상 관계가 분석될 수 있다. 동반을 확인하기 위해, 예를 들어 파이썬 기반 프로그램 pyBOAT를 사용하여 내인성 신호 진동의 기간을 결정할 수 있습니다.130분의 주기로 펄스를 적용할 때, 노치 신호 진동은 또한 130분의 기간을 나타낸다. 미세 유체 실험 중에 액체의 증발을 방지하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 중간 흐름을 방해하는 기포가 칩에 형성됩니다.이를 방지하려면 배지와 칩을 탈기하고 인큐베이터의 습도가 충분히 높은지 확인하십시오. 이 방법을 사용하여, 신호전달 역학은 변조될 수 있고, 그 효과는 형광 리포터의 실시간 이미징, 면역염색, 또는 계내 혼성화에 의해 분석될 수 있다. 또한, 조직은 또한 추가 분석을 위해 칩으로부터 추출될 수 있다.이 방법을 사용하여 배아 발달에서 신호 진동의 기능을 연구 할 수 있습니다. 마우스 배아의 분절화를 위한 두 개의 진동 신호전달 경로 사이의 위상 이동의 중요성을 입증하기 위해 적용되었다. 보다 일반적으로, 이제 다세포 시스템에서 동적 시그널링 코딩의 메카니즘을 해부하는데 사용될 수 있다.

a-microfluidics-approach-for-functional-investigation-signaling

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 클린 룸이나 부드러운 리소그래피 필요없이 여러 독특한 변종에 유사한 동적 조건을 적용 할 수있는 마이크로 유체 장치를 생산하는 간단한 방법을 제시한다.

여러 고유 긴장 유학을위한 마이크로 유체 장치

Somitogenesis는 리듬 발달 과정입니다 공간적 패턴 척추 동물의 태아의 몸 축. 이전에, 우리는이 과정을 드라이브주기 유전자를 관찰하는 형광 기자를 사용하여 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 개발했다. 여기, 우리의 문화는 체외에서 시간이 지남에 따라이 라인 및 이미지 자신의 진동을 세포를 분산.

단일 세포의 Zebrafish의 분할 시계의 이미징을위한 분산 Presomitic 중배엽 세포 배양의 생성

파라메트릭 광기계 여기(parametric optomechanical excitations)는 최근 광학 방사선 압력과 자극된 브릴루인 산란(Brillouin scattering)을 통해 미세유체 광기계 공진기에서 실험적으로 입증되었습니다. 이 논문은 이러한 미세유체 공진기의 제작과 함께 광기계적 진동을 생성하고 검증하는 방법론에 대해 설명합니다.

제작 및 미세 유체 광​​ 기계 발진기의 테스트

이 비디오 기사는 체계적이고 효율적으로 많은 무척추 동물 배아에서 복잡한 신호 전달 경로 및 규제 네트워크의 구성 요소를 특성화하는 데 사용할 수있는 생체 방법론에 직접적인을 자세히 설명합니다.

단순함의 힘 : 같은 성게 배아<em&gt; 생체</em&gt; 복잡한 세포 간 신호 전달 네트워크의 상호 작용 유학을위한 발달 모델

segmentation clock는 PSM(pre-somitic mesoderm)에서 진동 유전자 발현을 구동합니다. Dynamic Notch 활동은 이 프로세스의 핵심입니다. 우리는 이미징 및 컴퓨터 분석을 사용하여 공간 표현 데이터에서 시간 역학을 추출하여 델타 리간드와 노치 수용체 발현이 척추동물 PSM에서 진동한다는 것을 입증합니다.

자세한 공간 식지도에서 동적 식 데이터의 시간적 순서

물성 및 비보에 긴장 매개 변수 측정 도구의 부족 방지 개발 하는 동안 그들의 역할을 확인 합니다. 우리는 원자 힘 현미경 (AFM) 및 나노-추적 epiboly 동안 그대로 zebrafish 태아 노른자위 셀에 기계적 기능 척도를 고용. 이 메서드는 안정적이 고 광범위 하 게 적용 관입 개입을 피하.

AFM와 Microrheology Zebrafish 태아 노른자위 셀에

여기, 우리 optogenetic 컨트롤의 진동 정보 셀 전송 분석 및 유전자 발현의 모니터링 라이브 프로토콜을 제시. 이 방법은 다세포 시스템에서 동적 유전자 식 프로그램의 기능적 중요성을 테스트 하려면 독특한 플랫폼을 제공 합니다.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

상세한 단계별 프로토콜은 다성 성 O9-1 신경 문장 세포및 다양한 강성의 폴리 아크릴아미드 하이드로겔을 사용하여 시험관 내 기계적 신호를 연구하기 위해 여기에 설명되어 있습니다.

신경 문장 세포에서 기계적 신호를 연구하기 위한 최적화된 O9-1/하이드로겔 시스템

이 프로토콜은 마이크로 채널에서 10-1000Hz의 고조파 진동 흐름을 생성하는 편리한 방법을 보여줍니다. 이는 컴퓨터 제어 스피커 다이어프램을 모듈식 방식으로 마이크로채널에 인터페이싱하여 수행됩니다.

마이크로채널에서 서브킬로헤르츠 진동 흐름의 생성을 위한 외부 드라이버의 조립 및 특성화

본 프로토콜은 최소한의 사용자 개입으로 수백 개의 초파리 멜라노가스터 배아를 정렬, 고정 및 정밀하게 압축할 수 있는 미세유체 시스템의 설계, 제조 및 특성화를 설명합니다. 이 시스템은 자극 후 분석을 위한 샘플의 고해상도 이미징 및 회수를 가능하게 하며 다른 다세포 생물학적 시스템을 수용하도록 확장할 수 있습니다.

고처리량 미세유체 압축 시스템을 통한 다세포 유기체의 기계자극

여기서는 내피세포를 동기화된 진동성 고혈당과 맥동성 전단 스트레스에 노출시키는 마이크로유체 시스템을 제작하고 작동시키는 프로토콜을 제시합니다. 이 접근법은 당뇨병 내피 기능 장애 연구를 위한 생리학적으로 적합한 시험관 내 모델을 제공합니다. 이 프로토콜은 산화 스트레스와 내피 세포 반응의 정량적 측정을 가능하게 합니다.

생리적 맥박성 전단 응력과 진동성 고혈당 하에서 내피 기능 장애를 모델링하는 마이크로플루이딕 시스템

배우세요 마우스 배아의 신호 진동을 미세유체학적으로 조절하고 동기화하는 방법을. PDMS 칩 제작, 조직 배양, 실시간 영상 분석을 통해 발생 생물학에서 신호 역학의 기능을 정밀하게 연구할 수 있습니다.

Somitogenesis를 지배하는 신호 진동의 기능적 조사를위한 미세 유체 학적 접근법

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