Name: 폴리아크릴아미드 젤 전기포및 은 염색에 의한 글리코아미노글리칸 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 57 s
Description: 배우세요 폴리아크릴아미드 젤 전기영동과 은 염색을 이용한 글리코아미노글리칸 검출 및 크기 분석 방법입니다. 생물학적 샘플에서 황산화 GAG을 민감하게 탐지하고 다양한 조직 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 작품은 F31 HL143873-01 (WBL), R01 HL125371 (RJL 및 EPS)에 의해 투자되었다

이 프로토콜에서 분석된 모든 생물학적 샘플은 콜로라도 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에서 승인한 프로토콜에 따라 마우스로부터 수득되었습니다.
1. 헤파란 황산염 고립
<ol><li>조직 샘플의 탈지 참고: 탈지화는 지방이 풍부한 조직을 위한 선택 사항입니다.<ol>
<li>메탄올과 디클로로메탄의 1:1 혼합물을 만듭니다. 샘플 당 약 500 μL을 준비; 조직의 큰 조각은 1 mL까지 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>각 조직 샘플을 탈착을 위해 뚜껑이 있는 작은 유리 용기에 넣습니다. 참고: 샘플 질량은 관심 있는 조직 및 실험적인 필요에 따라 다를 수 있습니다. 50 mg 이하는 일반적으로 적절한 GAG 수율에 충분하지만 최종 사용자가 일부 최적화가 필요할 수 있습니다.</li>
		<li>메탄올:디클로로메탄 용액의 500μL을 각 유리 용기에 넣고 섞습니다. 모든 고체 조직 샘플이 용매에 완전히 침수되었는지 확인합니다. 참고: 혈탄고 피펫 또는 플라스틱 원판 튜브를 사용하여 메탄올/디클로로메탄 용액을 혼합하고 처리합니다. 다른 플라스틱은 용해될 수 있습니다.</li>
		<li>시료를 쉐이커(고정 랙에 고정랙)에 놓고 1시간 동안 부드럽게 교반합니다.</li>
		<li>4°C에서 5분 동안 17,000 x g에서 17,000 x g에서 샘플을 혼합하고 원심분리기를 교반합니다.</li>
		<li>유기 용매 분획 (상수)을 조심스럽게 피펫. 이것은 지질 분획입니다 - 그것은 GAG를 포함하지 않으며 폐기 할 수 있습니다. 참고 : 작은 조각을 잃을 수 있기 때문에 조직을 방해하지 않도록하십시오. 시료 손실을 위험시키기보다는 시료 용기에 일부 유기층을 두는 것이 바람직하다.</li>
		<li>유리 용기의 뚜껑을 열어 두고 후드에서 하룻밤 동안 증발하게 하십시오. 그 튜브는 추가 처리에서 살아남지 않을 것이기 때문에 다음 단계에 대한 튜브를 변경합니다.</li>
		<li>용매 혼합물이 완전히 증발되면 기계적 붕괴 (잔류 샘플이 >50 mg인 경우) 또는 액티나아제 E 소화 (< 50 mg)로 진행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>고체 조직의 기계적 붕괴 (선택 사항; 더 큰 조직 샘플의 경우) 참고: 고체 조직의 가장 작은 조각 (약 50 mg 이하) 소화 단계 동안 완전히 용해 해야 합니다. 그러나, 더 큰 견본은 기계적 붕괴를 요구할 것입니다.<ol>
<li>적절한 크기의 폴리 프로필렌 튜브에 배치하고 액체 질소에 폐쇄 튜브를 배치하여 관심의 플래시 동결 샘플. 샘플이 완전히 단단할 때까지 고정되도록 합니다.</li>
		<li>깨끗한 박격포와 유봉을 사용하여 냉동 샘플을 분말과 같은 일관성으로 분쇄합니다.</li>
		<li>액티나아제 E 소화(1.4단계)로 직접 진행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시료 탈염 및 농도 참고: 이것은 선택적 단계이며 희석 된 액체 조직 샘플 (예를 들어 기관지-폐포라 라베액 (BALF) 또는 플라즈마에만 필요합니다.<ol>
<li>적절한 실험 그룹으로 액체 샘플을 풀 (예를 들어, 생물학적 복제, 또는 실험 그룹에 의해)</li>
		<li>총 샘플 볼륨을 500 μL 원심 필터 컬럼에 넣고 3,000Da의 분자량 차단(MWCO)을 제공합니다.</li>
		<li>실온에서 14,000 x g에서 30 분 동안 회전하십시오. 원하는 샘플 볼륨이 원심 필터 컬럼의 용량을 초과하는 경우 필요에 따라 반복합니다.</li>
		<li>각 컬럼을 400 μL의 탈량, 여과된 물로 3배 세척합니다. 흐름을 폐기합니다.</li>
		<li>필터를 반전시키고 2,000xg에서 1분 동안 신선하고 적절하게 표지된 수집 튜브를 사용할 수 있습니다. -80 °C에서 동결하거나 다음 단계로 진행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>액티나아제 E 소화 참고: 이 단계는 시료에서 단백질 오염 물질을 소화하고 궁극적으로 제거하는 데 필요합니다.<ol>
<li>10 mg/mL의 원하는 농도에 재조합 액티나아제 E와 샘플을 혼합1:1. 10배 소화 버퍼 농축액의 적절한 부피를 추가합니다. 원하는 최종 농도: 0.005 M 칼슘 아세테이트 및 0.01 M 아세테이트 나트륨, pH 7.5. 예를 들면: 액체 견본의 190 μL, 20 mg/mL Actinase E의 190 μL, 0.05 M 칼슘 아세테이트의 20 μL, 0.1 M 아세테이트 나트륨.</li>
		<li>부드럽게 섞어 샘플을 동요한 다음 55°C에서 48-72h (전체 조직에 대해 최대 7 일까지 소화).</li>
		<li>15-20 분 동안 80 °C로 가열하여 Actinase E를 가열합니다.</li>
		<li>샘플을 -80°C로 동결하거나 1.5단계를 계속합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시료 탈염 및 농도 참고: 생물학적 시료에서 낮은 양의 GAG가 예상되거나, 소모성 시약(즉, 원심 필터 컬럼)의 보존이 바람직한 경우, 샘플은 실험 군당 단일 농축액(예를 들어, 생물학적 복제 또는 실험군에 의한)을 생성하기 위해 풀로 풀을 수 있다.<ol>
<li>총 샘플 볼륨을 MWCO3,000 Da로 500 μL 원심 필터 컬럼에 넣습니다.</li>
		<li>실온에서 14,000 x g에서 30 분 동안 회전하십시오. 원하는 샘플 볼륨이 원심 필터 컬럼의 용량을 초과하는 경우 필요에 따라 반복합니다.</li>
		<li>각 컬럼을 400 μL 디온화, 여과된 물로 3배 세척합니다. 흐름을 폐기합니다.</li>
		<li>필터를 뒤집어 2,000 x g에서 1분 동안 회전하여 신선하고 적절하게 표지된 수집 튜브(일반적으로 원심 필터 컬럼에 포함). -80 °C에서 동결하거나 다음 단계로 진행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>건조<ol>
<li>어느 단계1.5.5에서 용해 된 샘플을 하룻밤 회전 진공 농축기에 배치하거나 아래에 자세히 설명된 대로 샘플을 lyophilize.</li>
		<li>하룻밤 사이에 -80°C또는 액체 질소에 담그면 샘플을 철저히 동결하십시오.</li>
		<li>18G 바늘로 뚜껑을 관통하고 리오필라이저 챔버에 놓습니다. 필요에 따라 포장을 위한 종이 타월을 추가합니다.</li>
		<li>lyophilizer 챔버를 리오필라이저로 수정하고 하룻밤 동안 건조를 동결하십시오 (적어도 -40 °C, 0.135 Torr)</li>
	</ol></li>
	<li>양이온 교환 열<ol>
<li>8M 우레아의 최대 400 μL, 2% CHAPS 솔루션(또는 샘플을 풀링하는 경우 n = 원하는 풀의 샘플 수인 400/n)으로 다시 일시 중단합니다. 가능한 한 세제 용액을 적게 사용하십시오.</li>
		<li>8M 우레아의 400 μL, 2% CHAPS 용액으로 양이온 교환(IEX) 컬럼을 상형화합니다. 실온에서 2,000 x g에서 5 분 동안 회전하십시오.</li>
		<li>400 μL의 샘플/풀로 된 샘플을 IEX 열에 로드합니다. 2,000 x g에서5 분 동안 회전하십시오.</li>
		<li>8M 우레아 400μL, 2% CHAPS 용액으로 3배 세척합니다. 매번 2,000 x g에서 5분 간 회전하십시오.</li>
		<li>Elute 3x 와 400 μL 의 0.2 M NaCl. 각각 2,000 x g에서 5 분 동안 회전하십시오. 이것은 낮은 선호도 분획입니다 - 이것은 원하는 경우 품질 관리 목적을 위해 유지 될 수 있습니다.</li>
		<li>2.7M(16%) NaCl의 400 μL을 가진 엘루트 3배. 각각 2,000 x g에서 5 분 동안 회전하십시오. 이 분획은 관심의 고립 된 글리코 아미노 글리칸을 포함 합니다-그것의 모든 유지!</li>
		<li>각 에출 분획을 탈염하려면 메탄올을 최대 80vol %까지 추가하고 하룻밤 사이에 4 °C에서 배양하십시오. 2,000 x g에서 각 샘플을 5 분 동안 회전하십시오. 이 건조 염자 글리코사미노 글리칸으로 고체 잔류물을 복구. 참고: 또는, 이 단계를 건너뛰고 메탄올 없이 용액을 소금에 절하는 1.8단계를 진행한다.</li>
	</ol></li>
	<li>시료 탈염 및 농도<ol>
<li>필요한 경우, 풀은 분획(1.7.6에서) 적절한 실험 군(예: 생물학적 복제 또는 실험 군에 의한)으로 용출하였다.</li>
		<li>총 샘플 볼륨을 MWCO3,000 Da로 500 μL 원심 필터 컬럼에 넣습니다.</li>
		<li>실온에서 14,000 x g에서 30 분 동안 회전하십시오. 원하는 샘플 볼륨이 원심 필터 컬럼의 용량을 초과하는 경우 필요에 따라 반복합니다.</li>
		<li>각 컬럼을 400 μL 디온화, 여과된 물로 3배 세척합니다. 흐름을 폐기합니다. 1.9단계로 직접 진행합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>콘드로이틴 소화 참고: 이 단계의 목적은 최종 사용자에게 관심이 없는 GAG를 제거하는 것입니다. 이 경우, 콘드로이티나제는 연골을 제거하는 데 사용된다. 대표적인 결과(기관지-폐포라 라베지 유체 및 전체 폐)를 생성하는 데 사용되는 조직에서, 연골황산염을 소화하면 헤파란 황산염을 1차 잔류 개그로 나뭇잎이 된다. 최종 사용자는 실험 목표에 따라 추가 소화 단계를 추가해야 할 수 있습니다.<ol>
<li>350 μL의 소화 버퍼(50mM 암모늄 아세테이트 와 2mM 염화염화 pH 7.0로 조정)를 멤브레인을 건드리지 않고 원심 필터 컬럼에 적재한다.</li>
		<li>재조합 연골 연골 ABC의 5 μL을 추가합니다.</li>
		<li>샘플 튜브를 37°C 오븐에 넣고 1시간 동안 배양합니다.</li>
		<li>컬럼을 뒤집어 적절히 레이블이 붙은 수집 튜브로 배치합니다. 2000 x g에서1 분 동안 회전하십시오.</li>
		<li>15-20 분 동안 80 °C로 샘플을 가열하여 연골 증액 ABC를 비활성화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>시료 탈염 및 농도<ol>
<li>필요한 경우, 풀 콘드로이틴은 1.9.5 단계에서 적절한 실험 그룹으로 샘플을 소화했습니다(예: 생물학적 복제 또는 실험 군에 의한)</li>
		<li>총 샘플 볼륨을 MWCO 3,000 Da로 500 μL 원심 필터 열에 넣습니다.</li>
		<li>실온에서 14,000 x g에서 30 분 동안 회전하십시오. 원하는 샘플 볼륨이 원심 필터 컬럼의 용량을 초과하는 경우 필요에 따라 반복합니다.</li>
		<li>각 컬럼을 400 μL 디온화, 여과된 물로 3배 세척합니다. 흐름을 폐기합니다.</li>
		<li>필터를 반전시키고 2,000 x g에서 1분 동안 신선하고 적절하게 표지된 수집 튜브를 사용할 수 있습니다. -80 °C에서 동결하거나 다음 단계로 진행하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>건조 참고: 이 단계에서는 가능한 한 적은 양의 물과 흐르는 버퍼에서 샘플을 다시 일시 중단할 수 있도록 건조가 필요합니다.<ol>
<li>한 단계에서 연골 소화 샘플을 배치 1.10.5 회전 진공 농축기 하룻밤 또는 다음과 같이 lyophilize:</li>
		<li>하룻밤 사이에 -80°C또는 액체 질소에 담그면 샘플을 철저히 동결하십시오.</li>
		<li>18G 바늘로 뚜껑을 관통하고 리오필라이저 챔버에 놓습니다. 필요에 따라 포장을 위한 종이 타월을 추가합니다.</li>
		<li>lyophilizer 챔버를 리오필라이저로 수정하고 하룻밤 동안 건조하게 얼립니다 (적어도 40 °C, 0.135 Torr)</li>
	</ol></li>
</ol>2. 고립되고 정제된 글리코아미노글리칸의 폴리아크릴아미드 젤 전기포아
<ol><li>폴리아크릴아미드 젤 전기포에 필요한 솔루션을 미리 준비(표1). 참고: 시료에 있을 것으로 예상되는 글리코사미노글리칸의 크기에 따라 젤 용액을 해결하는 백퍼센트 아크릴아미드를 선택합니다. 15%는 더 큰 조각(길이 30개 이상의 소멸 하위 단위) 문제를 해결하는 데 권장됩니다. 22% 작은 조각에 대 한 (<20 길이의 소멸 하위 단위).</li>
	<li>빈 카세트를 PAGE 탱크에 넣습니다. 다음과 같이 해결 젤을 캐스팅 : 15 mL 튜브에서, 젤 용액의 10 mL, 10 % 암모늄 과황산염의 60 μL (갓 준비해야합니다), TEMED의 10 μL (TEMED 마지막 추가)를 혼합합니다. 튜브를 부드럽게 2-3배 반전시다. 파이펫을 사용하여 위의 10mL 솔루션을 카세트에 빠르게 추가합니다. 2mL의 탈이온화, 여과된 물로 오버레이하여 30분 동안 젤을 중합할 수 있도록 합니다. 참고: 다음 PAGE 프로토콜은 총 부피가 약 12mL인 13.3 x 8.7cm(너비 x 길이) 1.0mm 두께의 주조 카세트를 사용하여 수직 페이지 시스템에 최적화되었습니다. 다른 카세트 시스템을 사용할 수 있지만 최종 사용자가 최적화해야 할 수 있습니다.</li>
	<li>해결 젤이 완전히 중합된 후, 오버레이 된 물을 버리고 스태킹 젤을 다음과 같이 캐스팅 : 15 mL 튜브에서, 스태킹 젤 용액의 3 mL, 10 % 암모늄 아황 의 90 μL (갓 준비해야합니다), TEMED의 3 μL (TEMED 마지막 추가).</li>
	<li>튜브를 부드럽게 2-3배 반전시다. 파이펫을 사용하여 고화된 해결 젤 위에 스태킹 젤 용액을 빠르게 추가합니다. 카세트를 챙으로 채웁니다. 설정에 포함된 빗을 완전히 삽입합니다. 스태킹 젤을 30분 동안 중합하도록 허용합니다.</li>
	<li>젤이 중합되면 테이프 스트립이 카세트 바닥에서 제거되었는지 확인하고 카세트를 PAGE 탱크 어셈블리에 다시 넣습니다.</li>
	<li>상하 챔버 버퍼를 각각 채웁니다.</li>
	<li>건조된 시료를 1.11.4 단계에서 최소한의 필요한 대용량으로 녹여서 여과된 수역(PAGE 젤내 의 우물 부피의 50%). 1:1을 샘플 로딩 버퍼와 섞습니다. 샘플과 HS 올리고사카라이드 "사다리"(표 1참조)를 젤에 적재합니다.</li>
	<li>100 V에서 5 분 동안 젤을 미리 실행하십시오. 그런 다음 20-25 분 (15 % 폴리 아크릴아미드 해결 젤), 40-50 분 (18 % 폴리 아크릴아미드 해결 젤), 90-100 분 (22 % 폴리 아크라이클라미드 해결 젤)에 대해 200 V에서 젤을 실행합니다. 참고: 200 V 런타임의 일부 최적화가 필요할 수 있습니다. 페놀 레드는 길이 2폴리머 서브유닛인 헤파린 올리고당오리라이드보다 먼저 이동합니다(즉, 중합2 또는 dp2의 정도); 브로모페놀 블루는 dp10-dp14보다 먼저 이동합니다. 페놀 레드 밴드가 젤 의 바닥으로 거의 마이그레이션되지만 정반대가 아니라 전압이 적용될 때 최상의 결과를 얻을 수 있습니다. 그에 따라 런타임을 조정합니다.</li>
</ol>3. 실버 염색 프로토콜
<ol><li>실버 염색에 필요한 모든 솔루션을 미리 준비하십시오(표2). 참고: PAGE 젤이 스테인드, 개발 및 정지 용액에 배치될 때까지 직접 만지지 마십시오. 대신 깨끗한 플라스틱 또는 유리 도구를 사용하여 젤을 조작합니다. 젤을 직접 처리하면 염색 후 겔에 손가락 인쇄 왜곡 및 기타 눈에 보이는 아티팩트가 생성됩니다.</li>
	<li>실행이 완료되면, 탈이온화, 여과 된 물로 채워진 깨끗하고 중간 큰 용기에 카세트와 추출 젤을 분해합니다. 참고: 젤을 직접 취급하지 않으려면 파이펫 팁이나 기타 플라스틱 물체를 사용하여 물에 잠긴 상태에서 카세트에서 젤을 부드럽게 벗깁니다. 젤은 깨지기 쉬우며 조심스럽게 처리하십시오.<ol>
<li>물을 버리십시오. 알시안 블루 스테인딩 용액으로 젤을 5분 간 염색합니다.</li>
		<li>알시안 블루 얼룩을 버리십시오. 알시안 블루 스테닝 솔루션의 대부분이 제거 될 때까지 탈이온, 여과 된 물로 2-3 배 빠르게 헹구고 씻습니다.</li>
		<li>로커에서 하룻밤 사이에 변조되고 여과된 물에 얼룩을 내도록 하십시오. 잔류 얼룩이 밤새 젤에서 완전히 세척되도록 충분한 양의 탈이온화된 여과된 물이 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>젤을 50% 메탄올로 씻어내며(총 40분, 변경 용액 2~3배).</li>
		<li>젤을 탈이온화물로 30분 동안 씻으시면 됩니다. 물을 버리고 총 2 시간 동안 3 시간을 더 반복하여 매번 물을 대체하십시오.</li>
		<li>신선하고 깨끗한 용기에 은질산염 염색 용액으로 30분 동안 젤을 염색합니다.</li>
		<li>탈이온화된 여과된 물에 2-3배 빠르게 헹구고 씻어 실버 염색 용액을 완전히 제거합니다.</li>
		<li>탈이온, 여과 된 물에 30 분 동안 씻으라. 물을 버리고 총 90 분 동안 2x를 반복하여 매번 수조를 교체하십시오.</li>
		<li>물을 버리고 개발 솔루션을 추가합니다.</li>
		<li>개발 솔루션이 추가되면 조심스럽게 젤을 관찰하고 밴드의 모양을 조심하십시오. 얼룩의 품질과 로드된 샘플의 질량에 따라 개발은 몇 초에서 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.</li>
		<li>원하는 밴드가 표시되자마자 개발 용액을 즉시 폐기하고 스톱 솔루션으로 간단히 세척하십시오.</li>
		<li>스톱 용액 세척을 버리고 신선한 정지 솔루션으로 대체하십시오. 로커 나 셰이커에 1 시간 동안 담그십시오.</li>
		<li>디온화된 여과된 물로 하룻밤 간 세척하십시오(그러나, 젤은 정해세척 직후에 이미지될 수 있음).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>LaRivière, W. B., Schmidt, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pulmonary+endothelial+glycocalyx+in+ARDS%3A+A+critical+role+for+heparan+sulfate%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Membrane%22%5BJournal%5D)">The pulmonary endothelial glycocalyx in ARDS: A critical role for heparan sulfate.</a> Current Topics in Membrane. 82, 33-52 (2018).</li>
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저자는 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

GAGs는 다양한 생물학적 프로세스에서 중심적인 역할을 합니다. 황화 GAGs (HS 및 CS와 같은)의 주요 기능 중 하나는 다운스트림 신호 기능을 변경할 수있는 리간드와 상호 작용하고 결합하는 것입니다. 개그 결합 친화성의 중요한 결정요인은 GAG 폴리머 체인 8,9,14의길이이다. 이러한 이유로, 연구원은 합리적인 정밀하게 관심의 생물학적 샘플에서 분리 된 GAG 체인의 크기를 정의 할 수 있어야합니다. 실용적이기 위해 이 기술은 일반적인 실험실 장비와 시약을 사용하여 수행될 수 있어야 합니다.
이 프로토콜은 생물학적 샘플에서 GAG를 분리하고 정화하고 PAGE를 통해 크기별로 분리하고 Alcian 파란색 및 은 염색 기술을 사용하여 시각화하는 방법을 설명합니다. 크기별로 글리코아미노글리칸을 분리하는 방법에는...

글리코아미노글리산(GAGs)은 살아있는 유기체에서 유비쿼터스 원소이며 많은 기본적인생리적과정에 기여하는 선형 다당류의 다양한 가족이다. 헤파란 황산염(HS) 및 콘드로이틴 황산염(CS)과 같은 GAGs는 다당류 사슬을 따라 뚜렷한 위치에서 황살이 될 수 있으며, 부정적인 전하의 지리적 영역을 부여한다. 이들 GAGs는 프로테오글리칸으로 알려진 세포 표면 단백질에 테더링될 때 세포 외 공간으로 투영하여 코그네이트 리간드에 결합하여 시스-(동일한 세포에 부착된 리간드) 및 트랜스-(이웃 세포에 부착된 리간드) 신호 공정2의조절을 허용한다. 또한, GAGs는 또한 구체 지하 막3,혈관 내피 글리코릭스4 및 폐 상피 글리코릭스5,및 결합 조직(연골6)과같은 조직에서 구조적 요소로서 중요한 역할을 수행한다.
GAG 다당류 체인의 길이는 생물학적 맥락에 따라 크게 다르며 매우 복잡한 효소 규제 시스템7에의해 동적으로 길어지고, 갈라지고, 수정될 수 있다. 중요한 것은, GAG 폴리머 사슬의 길이는 리간드에 대한 그들의 결합 친화성에 실질적으로 기여하고, 그 후, 그들의 생물학적 기능에8,9. 이러한 이유로, 내인성 GAG의 기능의 결정은 그 크기의 감사를 필요로한다. 불행히도, 단백질과 핵산과는 달리 GAGs를 감지하고 측정하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 기술은 거의 존재하며, 이는 역사적으로 이 다양한 다당류 제품군의 생물학적 역할에 대한 비교적 제한된 조사를 초래했습니다.
이 문서에서는 대부분의 생물학적 조직에서 GAG를 분리하고 정화하는 방법에 대해 설명하고, 또한 폴리아크릴아미드 젤 전기포진(PAGE)을 사용하여 분리된 폴리머의 길이를 공정한 수준의 특이성을 평가하는 방법을 설명합니다. 다른, 매우 복잡 한 (그리고 종종 질량 분광계 기반) 글리코믹 접근 과는 달리, 이 방법은 표준 실험실 장비 및 기술을 사용 하 여 사용할 수 있습니다. 따라서 이러한 실용적인 접근법은 원주민 GAGs의 생물학적 역할과 문맥적으로 중요한 리간드와의 상호 작용을 결정하는 조사관의 능력을 확장할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Accuspin Micro17 탁상용 마이크로 원심분리기</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td>14000 xG가 가능한 모든 탁상용 마이크로 원심분리기/로터 조합이 적합합니다.</td></tr><tr><td>아크릴아미드(고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP170-100</td><td>전기영동 등급</td></tr><tr><td>Actinase E</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5147</td><td>프로테아제 믹스 S. griseus</td></tr><tr><td>Alcian Blue 8GX(고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC400460100</td><td></td></tr><tr><td>아세트산 암모늄 (고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A639-500</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>수산화 암모늄 (액체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A669S-500</td><td>인증 ACS</td></tr><tr><td>과황산 암모늄 (고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP179-25</td><td>전기 영동 등급</td></tr><tr><td>Barnstead GenPure Pro Water 정화 시스템</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10-451-217PKG</td><td>모든 물 탈이온화/정화 시스템은 허용되는 대체품입니다</td></tr><tr><td>Boric acid (solid)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>Bromphenol blue (solid)thermoFisher</td> <td>Scientific</td><td>B392-5</td><td></td></tr><tr><td>칼슘 아세테이트(고체)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18-609-432</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>염화칼슘(고체)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC349610250</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>CHAPS 세제(3-((3-콜라미도프로필) 디메틸암모니오)-1-프로판설포네이트)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>28299</td><td></td></tr><tr><td>콘드로이티나제 ABC</td><td>시그마 알드리치</td><td>C3667</td><td></td></tr><tr><td>PAGE용 기준 빈 카세트(두께 1.0mm, 12+2웰)</td><td>Bio-Rad</td><td>3459901</td><td>1.0mm 두께의 PAGE 주조 카세트 시스템으로 충분합니다.</td></tr><tr><td>Criterion PAGE Cell 시스템(셀 및 전원 공급 장치)</td><td>Bio-Rad</td><td>1656019</td><td>유사한 수직 gel PAGE 시스템이 작동)</td></tr><tr><td>Dichloromethane(액체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>AC610931000</td><td>인증 ACS</td></tr><tr><td>EDTA 이나트륨염(고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>02-002-786</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>빙초산(액체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A35-500</td><td>인증 ACS</td></tr><tr><td>글리신(고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>G48-500</td><td>전기영동 등급</td></tr><tr><td>Heparanase I/III</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3917</td><td>Flavobacterium heparinum Heparinum</td></tr><tr><td>유래 데카사리드(dp10)</td><td>galen scientific</td><td>HO10</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 유래 헥사당(dp6)</td><td>갈렌 사이언티픽</td><td>HO06</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 유래 올리고당(dp20)</td><td>갈렌 사이언티픽</td><td>HO20</td><td></td></tr><tr><td>염산(액체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A466-250</td><td></td></tr><tr><td>동결 건조기</td><td>Labconco</td><td>7752020</td><td>-40C 및 0.135 Torr을 달성할 수 있는 모든 동결 건조기가 작동합니다. 회전식 진공 농축기로 교체할 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>메탄올 (액체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>A412-500</td><td>인증 ACS</td></tr><tr><td>분자 이미저 겔 독 XR 시스템</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8170</td><td>모든 유사한 겔 이미징 시스템은 허용 가능한 대체품입니다</td></tr><tr><td>N,N'-메틸렌-비스-아크릴아미드(고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP171-25</td><td>전기영동 등급</td></tr><tr><td>페놀 레드(고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>P74-10</td><td>Free acid</td></tr><tr><td>Q Mini H 이온 교환 컬럼</td><td>Vivapure</td><td>VS-IX01QH24</td><td>이온 교환 컬럼은 최소 적재 부피 0.4mL, 작동 pH 2-12, pKa 11의 이온 그룹에 대한 선택성을 가져야 합니다</td></tr><tr><td>.질산은(고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S181-25</td><td>인증 ACS</td></tr><tr><td>아세트산 나트륨(고체)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S210-500</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>염화나트륨 (고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>수산화나트륨 (고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>S392-212</td><td></td></tr><tr><td>자당 (고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>TEMED (N, N, N', N'-tetramethylenediamine)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP150-20</td><td>전기영동 등급</td></tr><tr><td>트리스 베이스 (고체)</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>BP152-500</td><td>분자생물학 등급</td></tr><tr><td>초원심 필터, 0.5mL, 3000 Da 분자량 컷오프</td><td>Amicon</td><td>UFC500324</td><td>샘플 크기에 따라 더 큰 용량의 필터 장치가 사용될 수 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Urea (solid)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>Vacufuge Plus</td><td>Eppendorf</td><td>22820001</td><td>모든 회전식 진공 농축기가 작동하며, 동결건조기로 교체 가능</td></tr><tr><td>진공 필터 장치, 일회용, 0.22uM pore PES, 500mL 용량</td><td>thermoFisher Scientific</td><td>569-0020</td><td>대체 용량 및 필터 재료 허용</td></tr></tbody></table>

폴리아크릴아미드 젤 전기포및 은 염색에 의한 글리코아미노글리칸 검출

Detection of Glycosaminoglycans by Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Silver Staining

헤파란 황산염(HS) 및 콘드로이틴 황산염(CS)과 같은 황산 글리코아미노글리산(GAGs)은 살아있는 유기체에서 유비쿼터스이며 다양한 기본적인 생물학적 구조 및 공정에서 중요한 역할을 한다. 폴리머로서 GAG는 4000 Da에서 40,000 Da까지 다양하게 함유된 다당류 체인을 함유하는 다분산 혼합물로 존재합니다. 이러한 사슬 내에는 음전하의 도메인이 존재하며, 이는 cognate 단백질 리간드의 양전하 잔류물과의 상호 작용을 용이하게 하는 음전하 패턴을 부여합니다. GAG의 황질 도메인은 이러한 정전기 상호 작용을 허용하기에 충분한 길이여야 합니다. 생물학적 조직에서 GAG의 기능을 이해하려면 조사원은 GAG의 크기를 분리, 정화 및 측정할 수 있어야 합니다. 이 보고서는 다양한 생물학적 조직 유형에서 분리된 GAGs 간의 크기 차이를 비교적 작은 차이를 해결하기 위해 활용할 수 있는 실용적이고 다재다능한 폴리아크릴아미드 젤 전기포고제 기반 기술을 설명합니다.

알시안 블루는 황산 GAGs 10을염색하는 데 사용된다; 이 신호는 후속 실버 얼룩(11)을사용하여 증폭된다. 도 1은 은 염색 개발 프로세스의 시각적 데모를 제공합니다. 입증된 바와 같이, 발전에이전트가 폴리아크릴아미드 젤을 관통함에 따라 전기포고증에 의해 분리된 GAGs를 나타내는 알시안 청색 신호가 증폭된다. 일반적으로 개발 과정은 밀도 종속 방식으로 은과 알시안 블루 스테인드 GAG를 감소시키고, 각 대역의 가장자리는 먼저 감소하는 반면 중앙의 더 조밀하게 염색된 영역은 마지막으로 얼룩지게 됩니다.
문헌에서, PAGE 기반 접근법을 이용한 GAG검출의 보고된 한계는 0.5-1 μg12,13범위입니다. 우리의 접근법을 이용한 검출 한...

이 보고서는 생물학적 샘플에서 황지방 글리코아미노글리칸(GAGs)을 분리하고 정화하는 기술과 크기를 대략적으로 분류하기 위한 폴리아크릴아미드 젤 전기포아제 접근법을 설명합니다. GAGs는 조직 구조에 기여하고 단백질과의 정전기 상호 작용을 통해 신호 공정에 영향을 미칩니다. GAG 폴리머 길이는 코그네이트 리간드에 대한 결합 친화성에 기여합니다.

Sulfated glycosaminoglycans (GAGs) such as heparan sulfate (HS) and chondroitin sulfate (CS) are ubiquitous in living organisms and play a critical role ...

이 프로토콜은 존재를 감지하고 많은 생물학적 과정에 점점 더 인식되는 중요성의 분자인 글리코사미노글리칸의 길이를 측정하는 데 사용할 수 있는 간단한 기술을 설명합니다. 이 기술은 대부분의 생명 과학 실험실에 쉽게 적응할 수 있습니다. 비교 가능한 글리코믹 기술은 종종 글리코케화학 연구 실험실에서만 볼 수 있는 장비와 전문 지식이 필요합니다.이 기술은 글리코칼릭스, 인체의 내피 및 상피 표면을 줄 다당류 코트를 연구에 관심이있는 연구자에게 특히 유용 할 수 있습니다. 먼저 빈 카세트를 PAGE 탱크에 넣습니다. 15 밀리리터 튜브에 10% 암모늄 감산에서 갓 제조된 60 마이크로리터와 젤 용액 을 혼합하여 해결 젤을 캐스팅합니다.그런 다음 TEMED의 마이크로리터 10기를 추가합니다. 튜브를 부드럽게 2~3번 반전시다. 파이펫을 사용하여 활성 폴리 아크릴아미드 젤 용액10 밀리리터를 카세트에 빠르게 추가합니다.2밀리리터의 탈이온화된 여과된 물로 오버레이하고, 30분 동안 젤을 중합할 수 있게 한다. 해결 젤이 완전히 중합된 후 오버레이 된 물을 버리십시오. 스태킹 젤 용액 3밀리리터를 15밀리리터 튜브에 갓 준비한 10% 암모늄 감산의 90 마이크로리터와 혼합하여 스태킹 젤을 캐스팅합니다.그런 다음 TEMED의 마이크로 리터 3 개를 추가하고 튜브를 부드럽게 2 ~ 3 번 반전시면 됩니다. 파이펫을 사용하여 카세트가 가장자리에 채워지도록 응고된 해결 젤 위에 스태킹 젤 용액을 빠르게 추가합니다. 빈 폴리아크릴아미드 젤 카세트에 포함된 빗을 완전히 삽입하고 스태킹 젤이 30분 동안 중합되도록 합니다.젤이 중합되면 카세트 바닥에서 테이프 스트립을 제거하고 카세트를 PAGE 탱크 어셈블리에 다시 넣습니다. 상하 챔버를 각각의 버퍼 솔루션으로 채웁니다. 말린 글리코아미노글리칸 샘플을 최소한의 필요한 양의 탈이온화 여과된 물로 용해하고 샘플 적재 버퍼와 일대일 비율로 혼합합니다.샘플과 HS 올리고당 사다리를 젤에 적재합니다. 젤을 100볼트에서 5분간 예전한 다음, 해결 젤 용액의 아크릴아미드 비율에 따라 20~100분 동안 200볼트에서 실행합니다. 실행이 완료되면 카세트를 분해하고 신중하게 탈이온 여과 된 물로 채워진 큰 깨끗한 용기로 젤을 추출합니다.그런 다음 물을 버리고 알시안 블루 염색 용액에 젤을 5 분 동안 염색하십시오. 알시안 블루 얼룩을 버리고, 알시안 블루 스테닝 용액의 대부분이 제거 될 때까지 탈이온 화 된 여과된 물로 2 ~ 3 번 신속하게 씻으십시오. 젤을 실버 질산염 염색 용액에 넣고 신선한 깨끗한 용기에 30분간 염색합니다.그런 다음 탈온화 된 물에 각각 2 ~ 3 번 세척하여 실버 염색 용액을 완전히 제거하십시오. 물을 버리고 개발 솔루션을 추가합니다. 밴드의 모양을 위해 조심스럽게 젤을 관찰하십시오.얼룩의 품질과 로드된 샘플의 질량에 따라 개발은 몇 초에서 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. 원하는 밴드가 보이자마자 개발 용액을 즉시 폐기하고 STOP 용액으로 젤을 간단히 세척합니다. 폴리아크릴아미드 젤 전기포광에 의한 밀도 의존적 해결 후 알시안 블루및 은 염색 기술을 사용하여 분리되고 정제된 글리코아미노글리칸을 시각화하였다.이 그림에서 볼 수 있듯이, 상이한 폴리머 길이의 헤파란 황산염 올리고당류는 이 PAGE 기반 접근법을 사용하여 쉽게 검출할 수 있었다. 이 방법의 검출 한계는 0.5 마이크로그램으로 낮게, 기술이 생물학적 견본에서 분리되고 정제된 글리코사미노글리칸을 검출하는 데 매우 민감하다는 것을 보여줍니다. 이 방법을 사용하여 시각화된 4개의 다른 헤파린 황산염 올리고당 오리고당라이드 중, 불가분하지 않은 헤파린은 가장 쉽게 검출할 수 있었다.이 샘플에서 각 개별 밴드의 밀도는 정제 된 헤파린 올리고당라이드의 동등한 질량에 의해 생성 된 밴드보다 낮습니다. 액체 생물학적 샘플에서 글리코아미노글리칸 정제의 효율은 원래 글리코미노미노글리칸의 상대적으로 낮은 농도를 포함하는 마우스에서 수집된 기관지포라 라베지 샘플을 사용하여 평가되었다. 또한, 이 기술의 성공은 전체 폐 균질에서 분리된 헤파린 황산염을 사용하여 입증되었으며, 이는 약 10개의 소멸 서브유닛과 동일한 가장 작은 파편으로 충분한 양의 분리된 헤파린 황산염을 산출했습니다.새로 준비된 시약을 사용하고 이 프로토콜에 사용되는 모든 시약을 필터링하는 것이 매우 중요합니다. 이 기술을 성공적으로 수행하기 위해 최고 순도와 품질의 시약을 사용하는 것이 중요합니다.

detection-glycosaminoglycans-polyacrylamide-gel-electrophoresis

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연구

JoVE Journal

Biology

생물학

SDS - PAGE에 의해 다음 glycoproteins에서 설탕을 제거하는 구체적인 glycosidases를 사용하면 단백질 시료에 glycan 변경을 탐지하는 유용한 방법이며 초기 glycobiology 연구를위한 좋은 선택입니다. deglycosylation 다음과 같은 변경 사항은 겔 이동성의 교대 ​​또는 glycan 민감한 시약과 염색법에 의해 감지 수 있습니다.

특정 엔도와 exoglycosidases를 사용하여 단백질 글리코 실화의 식별 및 특성

이 비디오에서는 형광 프로브를 사용하여 총 단백질을 시각화하기 위한 폴리아크릴아미드 겔의 은 염색 방법을 보여줍니다.

형광 은 염색: 폴리아크릴아미드 겔에서 총 단백질을 시각화하는 기술

이 비디오에서는 황산화 글리코사미노글리칸 올리고당 단편의 알시안 블루 및 실버 결합 염색 절차를 보여줍니다. 이 결합된 염색 기술은 폴리아크릴아미드 겔에서 서로 다른 길이의 글리코사미노글리칸 중합체 띠를 크게 증폭시킵니다.

은 염색 황화 글리코사미노글리칸의 염색: 폴리아크릴아미드 겔에서 황화 글리코사미노글리칸의 시각화를 위한 염색 방법

이 비디오는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동을 사용하여 마우스 폐 조직에서 분리한 헤파란 황산염의 분리 절차를 보여줍니다.

폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 마우스 폐 조직에서 분리된 다양한 사슬 길이의 헤파란 황산염을 검출하는 분석 기법

이 비디오에서는 인간 비기능성 뇌하수체 선종(NFPA)의 종양 조직에서 얻은 복잡한 단백질 혼합물에서 개별 단백질을 분리하는 2차원 겔 전기영동 방법을 보여줍니다. 단백질은 1차원에서 전하를 기준으로 분리되고 2차원에서 분자량에 따라 추가로 분리됩니다.

2차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동: 전하와 분자량에 근거를 둔 복잡한 단백질 혼합물에 있는 단백질의 분석을 위한 별거 기술

O-결합 글라이칸의 다양성을 종합적으로 탐구하기 위해 과메틸화 및 신속한 상 분할 방법과 결합된 겔 내 환원적 β-제거를 위한 새로운 절차를 SDS-PAGE에 의해 분해되고 질량 분석법에 의한 후속 글리코마이크 분석이 가능한 당단백질에서 직접 방출되는 O-결합 글라이칸의 분석에 적용됩니다.

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여기, 우리는 간단 하 고 저가 실버 3 시 약 및 처리의 7 분 이며 유전자 분석에 높은-품질 SSR 데이터의 빠른 생성을 위한 적합 한 프로토콜을 얼룩이 지를 보고 합니다.

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여기, 우리는 새로운 형광 얼룩 polyacrylamide 젤에서 총 단백질 검출에 대 한 기술 개요는 상세한 프로토콜을 설명 합니다. 프로토콜 활용 Ag+를 감지 하는 실버 이온 전용 형광 턴 온 프로브-단백질 복합물, 전통적인 발은 얼룩의 특정 한계를 제거 하 고.

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면역글로불린 G(IgG) N-글리칸은 친수성 상호작용 UPLC를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또한, IgG N-글리칸의 구조는 명확하게 분리된다.  여기에 제시된 이 실험 방법에 대한 소개는 연구 환경에서 널리 사용될 수 있도록 한다.

초고성능 액체 크로마토그래피에 의한 면역글로불린 G N-글리칸 분석

배우세요 폴리아크릴아미드 젤 전기영동과 은 염색을 이용한 글리코아미노글리칸 검출 및 크기 분석 방법입니다. 생물학적 샘플에서 황산화 GAG을 민감하게 탐지하고 다양한 조직 연구에 활용할 수 있습니다.

폴리아크릴아미드 젤 전기포및 은 염색에 의한 글리코아미노글리칸 검출

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