지원 부동 블록을 사용하여 전송 전자 현미경 검사법에서 샘플 지원 필름의 준비
2021년 4월 8일
극저온 전자 현미경검사(cryo-EM)에 대한 샘플 제제는 이 방법의 구조 결정 워크플로우에서 상당한 병목 현상이다. 여기서, 우리는 전송 EM 연구를 위한 견본을 안정시키기 위하여 지원 필름의 제조를 위한 사용하기 쉬운, 3차원 인쇄 블록을 사용하기 위한 상세한 방법을 제공합니다.
여기서 우리는 이러한 섬세한 필름의 처리를 용이하게하는 새로운 부양 블록을 사용하여 지원 필름으로 냉동 EM 샘플을 준비하는 향상된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 샘플이 데우레이션과 같은 손상 효과가 발생할 수 있는 공기 물 인터페이스로부터 보호된다는 것입니다. 여기에 제시된 프로토콜 중 하나는 친수성 그래프를 렌더링하기 위해 고가의 치료를 피하므로 전체 EM 커뮤니티에 대한 접근성을 증가시합니다.
작은 부양 장치는 아직 널리 좋은 준비를 위해 전기 현미경 검사법에 의해 사용되지 않습니다. 따라서 이러한 시각적 데모는 사용 기준을 제공할 수 있습니다. 먼저 TEM 그리드를 이중 증류수와 에델 아세테이트로 세척한 다음 플라즈마 세척을 수행합니다.
그런 다음 샘플의 10~12마이크로리터를 버퍼 교환에 잘 첨가하고, 부양 블록과 10~12마이크로리터의 2% 소변 아세테이트 용액을 인접한 비버퍼 교환에 잘 첨가하여 음의 염색을 한다. 얼룩으로 작업 할 때 적절한 안전 예방 조치를 취하는 것이 필수적입니다. 엄선하여 전유식 카본 필름을 얹은 두 개의 작은 운하 를 잘라냅니다.
유수 부조각이 우물에 들어갈 수 있을 만큼 넓고, 탄소가 떠있는 동안 조각이 우물에 앉을 수 있고 핀셋으로 조각을 처리할 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인하십시오. 운하는 우물의 경사로에 앉아 탄소 층이 액체 샘플의 표면에서 관찰 될 때까지 45도의 대략적인 각도로 우물에 마이크를 담그다. 시료로 탄소를 배양한 후, 카본 필름을 회수하고 잔류 점액 시료 보존을 최소화하기 위해 매우 천천히 운하 시트를 철회한다.
필터 종이로 하부 비탄소 표면을 탭하여 중유를 조심스럽게 얼룩시켜 여분의 액체를 제거하고 2% 소변 아세테이트 용액을 함유한 상대 우물에 마이크 조각을 침수하여 탄소층을 음의 얼룩으로 교환한다. 세척 및 플라즈마 세척 EM 그리드의 거룩한 탄소 덮인 측면으로 부동 탄소 층을 복구합니다. 그런 다음 TEM에 이미징될 때까지 그리드를 건조하게 두어 공기 오염을 피하기 위해 이를 덮는 것이 좋습니다.
이전에 설명한 대로 TEM 그리드를 세척한 후, 사용 직전에 그래핀 옥사이드 서스펜션을 준비하고 철저히 소용돌이를 준비합니다. 그런 다음 그래핀 옥사이드 현탁액 10~12마이크로리터를 4개의 비완충 교환 우물에 넣습니다. 부양 블록을 따라.
블록의 나머지 4개의 완충 교환 우물에 이중 증류수 또는 초순수수 10~12마이크로리터를 추가합니다. 각 우물의 그래핀 옥사이드 서스펜션에 4개의 그리드를 부드럽게 떨어뜨리고 1분 동안 배양하여 거룩한 탄소 덮인 면이 용액과 접촉하고 있는지 확인합니다. 1분 후 핀셋을 각 비버퍼 교환의 트위저 홈으로 슬라이딩하여 각 그리드를 조심스럽게 복구합니다.
각 그리드의 구리 비탄소 커버 측을 두 배의 증류수로 부드럽게 간단하게 움직여 서 물 방울이 그리드에 표시될 때까지 인접한 물에 이중 증류수를 제공합니다. 그런 다음 조심스럽게 그리드 물이 필터 용지 조각에 대해 거꾸로 떨어 뜨립니다. 그리드를 덮고 핀셋에 두어 공기를 건조시다.
유리 슬라이드에 증착된 구리 그래프 시트 위에 4개의 세척 그리드를 놓고, 모노레이어 그래핀과 그리드 사이의 친밀한 접촉을 허용하기 위해 각 그리드를 이소프로판올 한 방울로 덮습니다. 이소프로파놀의 완전한 증발 후, 유리 페트리 접시에 페리 염화물 용액에 그리드와 구리 그래핀 시트를 플로트. 그런 다음 공기를 오염하지 않도록 접시를 덮고 하룻밤 동안 실온에서 식각에 둡니다.
TEM 그리드 크기보다 직경이 큰 루프를 사용하여 그래핀 모노레이어에 떠 있는 그리드를 어획하고 세척을 위해 이중 증류수를 함유한 유리 페트리 접시로 조심스럽게 옮기습니다. 그리드를 물에 두 번 세척하고 샘플 준비 및 급락 동결될 때까지 샘플 버퍼가 포함된 페트리 접시로 그리드를 전송합니다. 샘플의 10~12마이크로리터를 부양 블록의 우물에 넣습니다.
샘플이 블록에 준비되면 클린 핀셋 쌍을 사용하여 버퍼 용액에서 그래 핀 코팅 그리드를 선택하고 잘 함유 된 샘플의 표면에 배치하십시오. 적절한 잠복기 후, 깨끗한 동결 핀셋으로 그리드를 선택하고 블로팅 및 진동을 진행합니다. 지지 부양 블록으로 준비된 음수 스테인드 그리드는 일반적으로 전체 그리드 표면에 걸쳐 무정형 탄소로 덮여 있습니다.
탄소 필름의 파손은 어떤 경우에는 발생하지만, 많은 수의 그리드 사각형이 자연 그대로이므로 부정적인 염색 목적으로 적용됩니다. 마찬가지로, 좋은 필름 커버리지는 그래 핀 산화물 프로토콜을 사용하여 전체 그리드에서 일상적으로 달성됩니다. 그래핀 옥사이드 그리드는 원료로부터 신속하게 제조할 수 있으며 시료를 매우 보호합니다.
동결 직전에 그래핀을 적재하고 시료 적용을 시동상태로 유지하는 것만으로 극저온-EM에 적합한 얼음 층을 생성하기에 충분합니다. 이 프로토콜은 그래핀 친수성 렌더링장비를 필요로 하지 않으며 시료 회수에 대한 이점을 제공합니다. 지지 부양 블록에는 각 웰의 부위에 두 개의 바늘 포트가 있어 C2에서 버퍼가 확장될 수 있으며 글리세롤 그라데이션에서 유래된 시료에 매우 유용합니다.
부양 블록은 소량의 제어 가능한 버퍼 흐름뿐만 아니라 기능적 지원 필름을 활용하여 그리드 선호도 정화 방법을 탐색할 수 있게 되었습니다.
개요
이 기사는 새로운 플로테이션 블록을 사용하여 극저온 전자 현미경(cryo-EM) 샘플을 준비하는 개선된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 샘플을 손상시키는 공기-물 경계로부터 보호하고, EM 커뮤니티의 접근성을 향상시킵니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 극저온 전자 현미경
- 샘플 준비 기술
- 구조 생물학
배경
- 샘플 준비는 극저온 EM 워크플로의 병목 현상입니다.
- 지지 필름은 섬세한 샘플을 안정화하는 데 중요합니다.
- 현재 방법은 비쌀 수 있고 복잡할 수 있습니다.
- 새로운 플로테이션 블록은 프로세스를 단순화할 수 있습니다.
연구 목적
- 극저온 EM 샘플 준비를 위한 접근 가능한 프로토콜을 제공합니다.
- 지지 필름 취급에 플로테이션 블록의 사용을 시연합니다.
- 샘플 안정성을 향상하고 변성 위험을 줄입니다.
사용된 방법
- TEM 그리드의 세척 및 플라즈마 청소.
- 샘플 및 음성 염색 적용을 위한 플로테이션 블록의 사용.
- 샘플 보호 강화를 위한 그래핀 옥사이드의 통합.
- 준비 중 그리드의 주의 깊은 취급 및 이동.
주요 결과
- 변성 감소와 함께 개선된 샘플 안정성.
- 극저온 EM을 위한 그래핀 옥사이드의 성공적인 적용.
- 샘플 준비에서 플로테이션 블록의 효과성 시연.
- 프로토콜은 접근 가능하며 비싼 처리가 필요하지 않습니다.
결론
- 플로테이션 블록 방법은 극저온 EM 샘플 준비를 향상시킵니다.
- 프로토콜은 더 넓은 EM 커뮤니티에 의해 채택될 수 있습니다.
- 개선된 방법은 샘플의 더 나은 구조 분석을 용이하게 합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Efficient and reproducible sample preparation for cryo-EM is critical for structural biology pipelines, yet remains a bottleneck due to sample fragility and contamination risks. The support flotation block enables streamlined transfer of delicate support films, reducing manual handling and preserving sample integrity for high-resolution imaging. This innovation enhances predictive confidence in early discovery and supports robust portfolio progression by minimizing artifacts and sample loss.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables reliable interrogation of macromolecular structure by protecting samples from air-water interface denaturation.
- Supports functional target validation by maintaining native conformations during grid preparation.
- Reduces mechanistic ambiguity by minimizing sample damage and contamination.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of validated EM grids for downstream structural screening workflows.
- Improves reproducibility and standardization of support film application across batches.
- Enables rapid, scalable preparation of grids with amorphous carbon, graphene, or graphene oxide supports.
Translational & Preclinical Research
- Preserves sample integrity for translational studies requiring high-fidelity structural data.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling robust imaging of challenging samples.
- Mitigates risk of false negatives due to sample denaturation or contamination.
Pipeline & Workflow Integration
The flotation block method integrates at the sample preparation stage, bridging early discovery and lead identification with preclinical imaging workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling high-quality structural data acquisition.
- Screening: Delivers reproducible, contamination-minimized grids for reliable compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative, high-integrity imaging outputs for comparative analysis.
- Translational Research: Maintains sample fidelity for downstream biomarker or mechanistic studies.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized, reusable protocol adaptable to various support films and sample types.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces structural ambiguity in target validation.
- Operational Value: Streamlines workflows, reduces manual steps, and minimizes contamination risk.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by improving data quality and reproducibility.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted advancement by reducing sample loss and preparation failures.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EM grid handling and support film transfer.
- Needs access to flotation block, plasma cleaning, and standard EM preparation infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible results across projects.
- Adaptable to carbon, graphene, and graphene oxide supports as demonstrated.
- Potential limitations include occasional film breakage and need for careful contamination control.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:47
Preparation of Negatively Stained Samples with Amorphous Carbon Support
2:21
Preparation of Graphene Oxide-coated TEM Grids
3:27
Preparation of Samples on Monolayer-graphene Films Using the Flotation Block
4:44
Results: Examples of Sample Support Films Prepared Using the Floatation Block
5:34
Conclusion
