Name: 지원 부동 블록을 사용하여 전송 전자 현미경 검사법에서 샘플 지원 필름의 준비 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: 배우세요 지원 부동 블록을 사용한 냉동 전자 현미경 샘플 준비법으로 무정형 탄소와 그래핀 산화물 지원막을 효율적으로 전달하는 방법입니다. 이 기술은 공기-수계면으로부터 샘플을 보호하며 수동 처리와 오염을 최소화합니다.

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저자는 이러한 기술을 테스트하는 데 도움이 임페리얼 칼리지 런던에서 구조 및 합성 생물학 섹션의 모든 구성원을 감사하고 싶습니다, 뿐만 아니라 임페리얼 칼리지 고급 해킹 공간에서 해리 바넷, 구조 생물학 센터의 폴 심슨. CHSA는 웰컴 트러스트와 왕립 학회 (206212/Z/17/Z)가 공동으로 자금을 지원하는 헨리 데일 펠로우십 경에 의해 지원됩니다.

1. TEM 그리드 사전 지원 전송의 일반 준비
<ol><li>10-15초의 이중 증류수(ddH2O) 또는 초순수수로 TEM 그리드를 순차적으로 들어 올리고 침수하는 한 쌍의 깨끗한 핀셋을 사용한다. 참고 : 여기에 부정적인 행동, 경사 팁 핀셋이 사용되었습니다.</li>
	<li>그리드가 그립되어 있는 핀셋을 한쪽에 놓고 ~ 5분 동안 공기 건조를 합니다.</li>
	<li>플라즈마 청소 그리드는 공기 또는 세척 단계를 통해 발생하는 오염 물질의 표면을 제거합니다. 참고 : 여기에, 플라즈마 청소는 25 W의 무선 주파수 전력으로 공기에서 10-15 s에 대해 수행되었다.</li>
</ol>2. 시약 솔루션의 일반적인 준비
<ol><li>우라일 아세테이트(UAc) 용액(2% w/v)<ol>
<li>50mL 튜브를 호일로 감싸고 50mL의 초순수를 채우고 UAc 파우더 1g을 넣습니다. 참고: UAc는 빛에 민감하며 노출시 시간이 지남에 따라 침전됩니다. UAc는 방사성 및 독성이기 때문에 높은 수준의 청결을 유지하십시오. 흡입 이나 섭취에서 발생 하는 가장 심각한 위험으로, 추가 주의 해야 하지 않도록 어떤 미세입자 흡입의 가능성을 방지 하기 위해. 장갑은 우라늄 염을 취급하거나 계량할 때 항상 착용해야 합니다. 마스크와 고글은 적극 추천합니다. 우라늄 염은 국가 내 방사성 위험에 대해 명시된 법적 요구 사항에 따라 폐기되어야 합니다.</li>
		<li>모든 UAc가 용해되도록 1h의 용액을 저어 둡니다. 4°C에 보관하십시오.</li>
		<li>사용하기 전에 0.22 μm 필터를 사용하여 얼룩 용액의 1mL을 작은 유리병에 필터링하여 나머지 아세테이트 결정을 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>그래 핀 옥사이드 (GrOx) 서스펜션<ol>
<li>1.5 mL 튜브 (1 % 최종 농도)로 GrOx의 파이펫 2.5 μL. 파이펫 2.5 μL 의 10% (w/v) n-dodecyl β-D-maltoside (DDM) 세제에 GrOx에, 부드럽게 혼합 (0.1% (w/v) 최종 농도).</li>
		<li>GrOx-DDM 믹스에 245 μL의 초순수물을 넣고 즉시 5분 동안 격렬하게 소용돌이를 가합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>철(III) 염화물(FeCl3) 용액(10% w/v)<ol>
<li>계량 보트에서 FeCl3 5 g의 무게를 신중하게 측정합니다. ddH2O 35mL 및 마그네틱 스터디 바를 포함하는 100mL 측정 실린더로 이송합니다.</li>
		<li>자기 교반 플레이트에 놓고 FeCl3을 용해하여 최종 부피 50mL에 ddH2O를 추가합니다. 0.8 μm 주사기 필터를 통해 FeCl3 용액을 깨끗한 병에 넣고 보관합니다. 참고: FeCl3 은 부식성 및 자극제입니다. 손과 가벼운 비누와 물로 씻는 후, 술을 마시거나 담배를 피우거나 직장을 그만둔다. 증기의 형성을 방지하기 위해 공정 영역에서 좋은 환기를 제공합니다. 안개, 증기, 스프레이를 마시지 마십시오. 장갑은 소금을 취급하거나 계량할 때 항상 착용해야 합니다. 사용 시 마스크와 고글도 추천합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 지지 부동 블록을 사용하여 음수 염색 된 샘플을 준비하기 위해 운하에 탄소 지원 필름에 대한 버퍼 교환
<ol><li>세척 및 플라즈마 깨끗한 TEM 그리드. 참고: 여기서 300개의 메쉬 홀리 카본 구리 그리드가 섹션 1에 설명된 대로 사용되었습니다.</li>
	<li>피펫 10-12 μL 의 부동 블록의 완충 교환(작은 채널 포함)과 인접한 비버퍼 교환으로 의음 염색을 위해 2% UAc 용액의 10-12 μL(섹션 2.1 참조). 참고: 우물의 부피는 10 μL; 그러나, 적절한 필름 부유를 허용하기 위해 상류반연증이 액체의 표면에 형성되도록 샘플 볼륨을 조정한다. 샘플의 양이 적으면 필름 파손이 발생할 수 있습니다.</li>
	<li>엄선하여 전유식 카본 필름을 얹은 두 개의 작은 운하 를 잘라냅니다. 운모 파편이 우물(3.4mm 폭)에 들어갈 만큼 충분히 넓고 우물 길이(3.45mm)보다 길어지면 탄소가 떠있는 동안 조각이 잘 앉을 수 있고 핀셋으로 조각을 처리할 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인하십시오. 참고: 탄소를 처리하려면 평평한 음수 동작 의 긴 팁 핀셋을 사용하십시오. 항유 조각을 절단 할 때, 탄소 필름의 무결성을 유지하기 위해 단일 움직임을 사용하여 잘라.</li>
	<li>운하는 우물의 경사로에 앉아 액체 샘플의 표면에서 탄소층이 관찰 될 때까지 45 °의 대략적인 각도로 우물에 마이크를 담들입니다.</li>
	<li>시료에 대한 초기 인큐베이션(일반적으로 샘플 준수에 따라 20내지 20분, 실험적 필요에 따라 이 기간을 최적화) 후, 카본 필름을 복구하고 잔류 점성 시료 보존을 최소화하기 위해 매우 천천히 미카 시트를 철회한다.</li>
	<li>필터 용지로 하부 표면(non-carbon side)을 탭하여 항유를 조심스럽게 얼룩지게 하고, 이어서 2% UAc 용액을 포함하는 상대우물(즉, 3.4단계에서와 같이 약체를 침전)에 적용하여 이산화탄소 베어링을 음의 얼룩으로 교환한다. 참고: 이 시점에서 탄소 층이 얼룩 용액 위에 떠 있는 것을 관찰해야 합니다.</li>
	<li>세척 및 플라즈마 세척 EM 그리드의 구멍이 있는 카본으로 덮인 측면으로 부동 탄소 층을 복구합니다. TEM에서 이미징할 때까지 그리드를 공기 건조상태로 둡니다. 이상적으로는 건조 공정 중에 그리드를 덮어 공기 오염을 방지합니다.</li>
</ol>4. 그래핀 산화물 코팅 TEM 그리드를 준비하기 위한 지원 부동 블록의 적용
<ol><li>위에서 설명한 대로 300메쉬 홀리 카본 구리 그리드를 사용하여 세척 및 플라즈마 청정 TEM 그리드(섹션 1).</li>
	<li>파이펫 10-12 μL GrOx 서스펜션(섹션 2.2 참조)을 플로트 블록을 따라 4개의 비버퍼 교환 우물에 넣습니다. 파이펫 10-12 μL ddH2O 또는 블록의 나머지 4 개의 완충 교환 우물에 초순수. 참고: 이 물 량은 블록의 높이 위로 솟아오르는 약간의 볼록 한 반월 상 연골을 형성하기에 충분합니다.</li>
	<li>4개의 그리드를 각 웰의 GrOx 서스펜션에 1분 동안 부드럽게 떨어뜨려 구멍이 뚫은 카본으로 덮인 면이 용액과 접촉할 수 있도록 합니다. 1분 후, 핀셋을 각 비버퍼 교환의 트위저 홈으로 슬라이딩하여 각 그리드를 조심스럽게 복구합니다.</li>
	<li>매우 부드럽게 짧게 구리를 터치, 비 탄소 덮인 측면 각 그리드의 ddH2O 인접 우물에서. 그런 다음, 조심스럽게 부드럽게 필터 종이 의 조각에 대한, 아래로 물방울 측, 그리드, 물방울 측을 잡아. 참고: 물을 블로팅하면 모세관 작용으로 GrOx 서스펜션이 그리드를 통과하게 됩니다. ddH2O에서 그리드를 잠그지 않도록 하는 것이 중요하므로 접촉은 매우 간단해야 합니다. 그리드를 들어 올릴 때, 물 방울은 그리드의 밑면에 고정되어야 합니다. 이 GrOx 플레이크의 정착을 화나게 할 수 로 필터 용지에 그리드를 이동하지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>핀셋에 그리드를 두어 시료를 준비할 때까지 공기 건조를 합니다. 이상적으로는 건조 공정 중에 그리드를 덮어 공기 오염을 방지합니다.</li>
</ol>5. 단층 그래핀 필름에 샘플의 준비를위한 지원 부동 블록의 응용 프로그램
<ol><li>위에서 설명한 대로 TEM 그리드를 세척(섹션 1)하지만 플라즈마 세척을 생략합니다. 참고: 여기서는 300개의 메쉬 홀리 카본 금 그리드가 사용되었지만 다른 비구리 그리드 또는 구리 합금 그리드도 실행 가능합니다.</li>
	<li>그래핀으로 그리드를 예치하려면 구리(Cu-graphene) 기판에서 저온-EM 그리드로 직접 전송하여 이전에 설명한 바와 같이 25.<ol>
<li>유리 슬라이드에 증착된 Cu-graphene 시트(10mm × 10mm) 위에 4개의 세척 그리드를 놓고, 각 그리드를 이소프로파놀(5-10 μL)으로 덮어 모노레이어 그래핀과 그리드 사이의 친밀한 접촉을 허용합니다. 참고: 그래핀 시트와 접촉하여 그리드의 구멍이 뚫린 카본 으로 덮인 면을 배치해야 합니다.</li>
		<li>이소프로판올이 완전히 증발되면(일반적으로 2h), 그리드가 있는 Cu-graphene 시트를 유리 페트리 접시에 10% (w/v) FeCl3 용액(섹션 2.3 참조)에 띄우고 밤새 실온에서 에칭상태로 둡니다. 공기 오염을 방지하기 위해 접시를 덮습니다. 참고: 에칭이 완료되면 그래핀 단층만 FeCl3 솔루션에 떠 있는 상태로 유지되며, 적절한 조명을 통해 눈으로 볼 수 있습니다.</li>
		<li>TEM 그리드 크기보다 직경이 큰 루프를 사용하여 그래핀 모노레이어에 떠있는 그리드를 어획하고 ddH2O가 함유된 유리 페트리 접시로 조심스럽게 이송하여 세척합니다. 참고: 페트리 접시의 벽에 부딪히지 않도록 그리드를 낚시할 때 매우 주의해야 하며, 이로 인해 그래핀 필름이 파손되거나 구부러질 수 있습니다.</li>
		<li>낚시 그리드에 의해 물에 두 번 더 씻고 모든 잔류 FeCl3을 제거하기 위해 ddH2O가 들어있는 깨끗한 페트리 접시로 옮겨 넣습니다. 마지막으로, 샘플 준비 및 플런지 동결때까지 샘플 버퍼를 포함하는 페트리 접시로 그리드를 전송합니다. 참고: 공기 중 오염 물질에 노출되지 않도록 그리드의 그래핀 으로 덮인 측면은 항상 젖은 상태로 유지되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>피펫 시료(10-12 μL)를 부동 블록의 비버퍼 교환웰에 넣습니다. 샘플이 블록에 준비되면 클린 핀셋 쌍을 사용하여 버퍼 솔루션에서 그래핀 코팅 그리드를 선택하고 샘플을 잘 함유하는 시료의 표면에 배치합니다.</li>
	<li>적절한 잠복기(시료에 따라 1-5분, 실험적 필요에 따라 최적화), 깨끗한 동결 핀셋으로 그리드를 선택하고 블로팅 및 진동을 진행합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는이 작품에 대한 이해의 충돌을 인식하지 않습니다.

이 백서는 샘플 부동 블록을 사용하여 저온-EM 샘플 준비를 위한 비정질 탄소 및 그래핀 필름을 모두 처리하기 위한 프로토콜을 제시합니다27. 지원 블록에 대한 STL 파일은 공용 Thingiverse 리포지토리 [www.thingiverse.com/thing:3440684]에서 자유롭게 사용할 수 있으며 적합한 수지에서 적합한 스테레오소그래피 프린터로 3D 인쇄될 수 있습니다. TEM 그리드를 커버하는 탄소 필름의 사용은 일반적으로 샘플28에 탄소 부유를 포함한다. 음의 얼룩 그리드를 준비하는 이 접근법은 지원 처리 중에 공기 노출을 최소화하므로 오염 및 단백질 변성 감소를 줄입니다. 작은 우물에서 부동 탄소를 사용하여 그리드의 제조는 더 큰 표면적, 즉 수조 또는 페트리 접시에 떠 있는 것이 유리하며, 이 경우 탄소의 기계적 전단이 훨씬 더 쉽게 발생합니다.
UAc는 공표 시 현재의 건강 및 안전 규정으로 인해 구매가 어려울 수 있습니다. 일반적으로 사용되는 다른 많은, 비 방사성, 부정적인 염색 시약을 사용할 수 있으며, 그들의 준비를위한 프로토콜은 이전에 설명되었다29. 대체 얼룩이 이 지원 부동 블록과 함께 사용되지는 않았지만 이미 본질적으로 샘플에 의존하는 샘플(3.5단계)을 이용한 인큐베이션 시간을 최적화하는 것 외에 이러한 프로토콜에 차이가 없을 가능성이 높습니다. 이 GrOx 지원 준비 프로토콜의 핵심 단계는 4.4 단계이며, 물과 GrOx 솔루션이 그리드 가장자리 주위에 접촉하지 못하도록 메모에 의해 강조 표시됩니다. 물과 GrOx 솔루션의 부적절한 혼합은 모세관 작용에 의한 GrOx 플레이크의 단방향 침전을 방지합니다. 탄소 호일의 양쪽에 GrOx 플레이크를 사용하면 두꺼운 층이 발생하므로 GrOx를 거의 단일 층 지지층으로 사용하는 장점을 부정하고 조각 사이에 물을 트래핑하여 추가 적인 얼음 층이있는 사용 가능한 영역의 오염을 유발합니다. 그래 핀 옥사이드 지원 준비는 유연한 폴리올핀 필름에 용액의 액적을 사용하여 비교적 쉽게 달성할 수 있습니다. 그러나, 그런 식으로 수행될 때, 오류를 잘못 처리하여 그리드의 구리 면을 실수로 오염시키는 것이 더 쉽습니다. 부동 블록의 사용은 이러한 사태의 가능성을 감소시킵니다.
마지막으로,이 논문은 친수성 렌더링그래핀 전처리를 피하기 위해 그래핀 으로 덮인 그리드를 준비하는 프로토콜을 제시하여 비용을 절감하고 접근성을 증가시킵니다. 시편 준비 전반에 걸쳐 습식 필름을 유지하고 동결 직전에 블록에 샘플을 적용하면 균일한 시료 분포를 통해 극저온-EM에 적합한 얼음 층의 생성을 허용하기에 충분합니다. 전반적으로 여기에 제시된 프로토콜은 공기-물 인터페이스와의 샘플 접촉을 최소화하므로 시료 절제및 지원 오염을 줄입니다. 이러한 접근 방식에 사용되는 세 개의 지원 필름의 경우, 균일한 샘플 분포는 손상되지 않은 잘 보존된 단일 입자의 이미징과 함께 그리드 전체에서 달성될 수 있습니다.

지난 10년 동안, 주로 검출기 기술뿐만 아니라 다른 기술 분야에서도 획기적인 돌파구는 전염 전자 현미경 검사법(TEM)1,2에 의해 생물학적으로 관련된 시스템을 이미지화할 수 있는 해상도의 상당한 증가를 촉진했습니다. 저온-EM은 이미 단일 입자 분석 (SPA)을 통해 단백질의 50 μg에서 고해상도 구조의 해상도를 허용한다는 사실에도 불구하고, 극저온-EM 샘플 및 그리드 준비는 주요 병목 현상3,4,5 남아있다. SPA 샘플은 유리체 얼음 층 내에서 약 무작위로 분포된 거대 분자로 구성됩니다. 얼음은 입자와 용매 사이의 대비 차이를 최대화하기 위해 가능한 한 얇아야 합니다. 생물학적 거대 분자는 더 나은 solvated 남아 있기 때문에 두꺼운 얼음에서 (즉, 그들의 토착 구조를 잃을 가능성이 적습니다). 더욱이, 입자는 입자 크기6보다 훨씬 두꺼운 얼음에서 시야에 훨씬 더 잘 분포되는 것으로 나타났으며 탄소 필름의 구멍 내에서 는 종종 발견되지 않을 수 있습니다.
또한, 두꺼운 얼음 층은 높은 표면 대 부피 비율로 인해 공기-물 인터페이스에 근접하는 분자의 확률을 감소시키고, 극저온-EM 연구를 위한 표준 플런지 동결 방법을 사용하면 입자의 ~90%를 공기-물 인터페이스에 흡착시키는 결과를 낳는 것으로 추정되고 있다7. 두꺼운 얼음으로 인해 신호6,7의 용매 및 수반되는 감쇠 내의 산란 이벤트가 증가하여 눈에 띄게 높은 배경을 초래합니다. 따라서 가능한 한 얇은 유리 얼음 층을 달성할 필요가 있습니다. 이상적으로 레이어는 파티클보다 약간 두껍습니다. 그리드에 적용되는 모든 다른 샘플을 극복해야 하는 연구원의 과제는 시료 내입자의 구조적 무결성을 유지하면서 고대비 이미징을 위해 충분히 얇은 시편을 준비하는 것입니다. 공기-물 인터페이스에 단백질 흡착은 여러 가지, 일반적으로 해로운, 효과 동반.
첫째, 이러한 소수성 인터페이스에 단백질의 결합은 종종 빠르게 진행되고 전형적으로 돌이킬 수 없는 단백질의 데칭을 유도합니다8,9. 효모 지방산 신타제를 사용하여 실시한 연구에 따르면 흡착입자의 최대 90%가 변성10입니다. 둘째, 비정질 탄소11 또는 support12에서 수집된 80S 리보솜 데이터 세트의 배향 분포를 비교한 연구에서 얻은 증거에 따르면 공기-물 인터페이스는 부피13의 3D 재구성을 손상시키는 심각한 우대 방향을 일으킬 수 있음을 보여주었다. 공기-물 인터페이스와의 입자 상호 작용을 줄이는 방법에는 계면활성제(예: 세제)와의 동결 버퍼 의 보충, 지원 필름의 사용, 기판의 선호도 캡처 또는 비계, 및 가속 된 급락 시간을 포함한다. 계면 활성제의 사용은 일부 단백질 샘플이 존재할 때 이상적으로 행동할 수 있기 때문에 자체 문제와 관련이 있으며, 선호도 포착 및 스캐폴딩 기판은 일반적으로 엔지니어링 맞춤형 그리드 표면 및 캡처 전략이 필요합니다. 마지막으로, 급속한 급락 장치의 개발에 대한 연구가 많이 있지만14,15,16, 이들은 일반적으로 널리 사용할 수없는 장치를 필요로한다.
생물학적 저저온-EM의 표준 TEM 그리드는 이미 천공 무정형 탄소 foil17을 특징으로 하지만, 추가 지원 필름생성및 TEM 그리드로의 전송에 사용할 수 있는 프로토콜이 많이 있습니다. 이러한 필름의 사용은 샘플 안정화를 위한 오랜 방법입니다18. 무정형 탄소 지지대는 결정성 미카 시트19의 증발 및 증착에 의해 생성되며, 이 시트는 층이 그리드에 부동될 수 있으며, 부유물의 유용성은 이전 보고20에 확립된 유용한 도구로서 지원한다. 일반적으로 Hummers method21의 수정된 버전을 사용하여 제조된 그래핀 옥사이드 플레이크는, 감소된 배경 신호뿐만 아니라 거대 분자22를 고정및 안정화하는 능력뿐만 아니라 비정질 탄소에 바람직한 지지 구조로 사용되어 왔다. 최근에는 기계적 안정성, 높은 전도도, 배경 잡음에 대한 매우 낮은 기여도, 모노레이어 graphene24의 거시적으로 넓은 영역을 생성하고 TEM grids25로 전송하기 위한 재현 가능한 방법의 출현으로 인해 그래 핀을 TEM 지원 필름으로 사용하는 것에 대한 관심이 다시 높아지고 있습니다. . 흡기 필름이 부족한 얼음보다 유사하게 또는 더 나쁜 빔 유도 모션을 겪는 비정질 탄소와 비교했을 때, 그래핀은 극저온-EM 이미지의 빔 유도 모션의 현저한 감소를 보였다12.
그러나, 유수성 그래핀이 공기물 간면 성소로부터 지방산 신디사이저를 보호하는 동안, 이 연구의 저자는 그래핀이 대기 탄화수소 오염의 조합과 그리드s10을 수소화하는 데 사용되는 시약으로 인해 표본 준비 중에 오염되었다고 지적했다. 실제로, 그래 핀의 우수한 자질의 많은에도 불구하고, 그것의 광범위 한 사용은 여전히 그것의 소수성을 감소 하는 데 필요한 파생에 의해 방해 12, 궁극적으로 화학적으로 어렵고 전문 장비 필요. 본 논문은 무정형 탄소, 그래핀 옥사이드 및 그래핀 샘플의 제조를 위한 프로토콜을 3차원(3D) 인쇄시 부동 블록을 사용하여 TEM 그리드로 생성된 기판으로부터 지지 필름을 직접 전송하도록 한다(도 1). 이러한 장치를 사용하는 주요 장점은 필름의 습윤 전달, 지지대의 소수성 오염을 최소화하고 결과적으로 추가 처리의 필요성을 최소화하고 잠재적으로 손상될 수 있는 수동 처리 단계의 수를 줄이는 것입니다. 이러한 접근 방식은 구현비용이 저렴하므로 샘플 지원이 필요한 극저온-EM 연구에 널리 접근가능하고 적용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>기본 플라즈마 클리너(230V)</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-32G-2</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 핀셋 N5A INOX.</td><td>Dumont Swissmade</td><td>0302-N5A-PO</td><td></td></tr><tr><td>Dumont 핀셋 NGG INOX.</td><td>Dumont Swissmade</td><td>0102-NGG-PO</td><td></td></tr><tr><td>Ehtylacetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270989-250ML</td><td></td></tr><tr><td>낚시 루프 10 &mu; L</td><td>VWR</td><td>612-9353</td><td></td></tr><tr><td>그래핀 옥사이드 2 mg/mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>763705-25ML</td><td></td></tr><tr><td>철(III) 염화물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31232-250MG</td><td></td></tr><tr><td>운모 시트 75 mm x 25 mm x 0.15 mm</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG250-1</td> 우리는 일반적으로 Cu Graphenea N/A 10 mm x 10 mm, 팩에 2 nm 단층 그래핀<td>의 대상 탄소 막 두께로 운모를 코팅합니다.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 4</td></tr><tr><td>n-dodecyl &beta;-D-maltoside (DDM)</td><td>GLYCON Biochemicals GmbH</td><td>D97002-C</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R1.2/1.3 300 mesh copper grids</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>JBS-X-101-Cu300</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R2/1 300 mesh copper grids</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>JBS-X-102-Cu300</td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil R2/1 300 mesh gold grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>Q350AR1</td><td></td></tr><tr><td>가위</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT577</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>TAAB Laboratories Equipment</td><td>U001</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>FEI</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 여과지 55mm</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1441-055</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 여과지 70mm</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1441-070</td><td></td></tr></tbody></table>

지원 부동 블록을 사용하여 전송 전자 현미경 검사법에서 샘플 지원 필름의 준비

Preparation of Sample Support Films in Transmission Electron Microscopy using a Support Floatation Block

저온 전자 현미경 검사법(cryo-EM)에 의한 구조 결정은 지난 10년 동안 급속히 성장했습니다. 그러나 샘플 준비는 여전히 중요한 병목 현상으로 남아 있습니다. 매크로 분자 샘플은 유리체 얼음의 얇은 층에서 임의의 방향에서 직접 직접 이미지됩니다. 그러나, 많은 샘플은 이것에 내화되고, 공기 물 인터페이스에서 단백질 성모는 일반적인 문제입니다. 이러한 문제를 극복하기 위해 비정질 탄소, 그래핀 및 그래핀 산화물을 포함한 필름을 지원하여 시료가 채워질 수 있는 표면을 제공하기 위해 그리드에 적용하여 공기-물 인터페이스의 해로운 영향을 경험하는 입자의 가능성을 줄입니다. 그러나 이러한 섬세한 지지대를 그리드에 적용하려면 파손, 공중 오염 또는 광범위한 세척 및 세척 단계를 방지하기 위해 신중한 처리가 필요합니다. 최근 보고서는 지원 필름을 샘플로 직접 습식 전송할 수 있는 사용하기 쉬운 부동 블록의 개발에 대해 설명합니다. 블록의 사용은 필요한 수동 처리 단계의 수를 최소화하여 지원 필름의 물리적 무결성을 보존하고 소수성 오염이 발생할 수 있는 시간을 최소화하여 얼음 박막을 계속 생성할 수 있도록 합니다. 이 백서는 EM 연구를 위한 탄소, 그래핀 및 그래핀 산화물 지지체의 제조를 위한 단계별 프로토콜을 제공합니다.

비정질 탄소 지지체로 제조된 TEM 그리드는 일반적으로 전체 그리드 표면에 걸쳐 다룹니다. 탄소 막의 파손은 일부 주름 (그림 2A)과 함께 어떤 경우에는 발생하지만, 그리드 사각형의 큰 숫자는 자연 그대로 따라서 부정적인 염색 목적을 위해 널리 적용. 지지의 무결성에 영향을 미치는 주요 요인은 탄소 증발 중에 결정되는 탄소 두께입니다. 마찬가지로 이 GrOx 프로토콜을 사용하면 전체 그리드(그림 2B)에서 양호한 커버리지가 일상적으로 수행됩니다. 1분 동안 GrOx 서스펜션을 단일 적용하면 플레이크 가장자리로 인해 쉽게 볼 수 있는 여러 레이어가 있는 몇 가지 영역을 보장하기에 충분합니다. GrOx 그리드는 원료로부터 신속하게 제조할 수 있으며 시료를 매우 보호합니다. 그러나, 플레이크 가장자리, 불완전한 커버리지 및 러플은 GrOx 플레이크의 특성 때문에 다른 기술보다 GrOx 그리드에서 더 자주 볼 수 있습니다.
무정형 탄소와 같은 그래 핀 지원 필름의 무결성은 증착 과정에 따라 다르지만, 잘 덮여있는 영역은 단일 층 그래 핀의 특성 회절 패턴을 표시합니다. 중요한 것은, 그래핀 지지필름을 적시시킴으로써, 시료는 인큐베이션 기간 이후에 부유블록으로부터 회수될 수 있고, 단일 입자 분석을 위해 어쩔 수 없는 방식으로 수집된 데이터를 수집할 수 있다. 이 방법은 습윤을 위한 그래핀의 다른 치료가 필요하지 않으므로, 그래핀 친수성 렌더링을 위한 고가의 장비에 대한 요구 사항을 제거하고, 시료 준비 및 그리드 동결(그림 2C)에 앞서 지원 필름을 준비하는 것이 가장 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62321/62321fig01.jpg"> 그림 1: 지원 필름 준비 중 샘플 부동 블록 설계 및 응용 프로그램. (A) 형상, 깊이 및 경사의 측정을 포함하여 부동 블록의 상단, 잘 및 측면 뷰의 회로도. 바늘을 삽입하는 채널뿐만 아니라 휴식을 취할 트위저 팁에 대한 홈이 표시됩니다. (B) 비정질 탄소 층은 경사로, 즉 부정적인 염색 된 TEM 그리드를 준비하는 동안 부동 블록의 우물 내에 포함 된 버퍼의 표면에 쉽게 부동 될 수 있습니다. (C) 우물의 폭은 하나의 TEM 그리드를 수용하기에 적합하며, 트위저 홈은 준비 단계에서 불필요하게 그리드를 방출하고 픽업할 필요성을 줄이지만 그리드가 해제될 경우 굽힘 위험 없이 그리드를 복구하는 정의된 경로를 제공합니다. B 의 이미지는 27에서 수정됩니다. 약어 : TEM = 전염 전자 현미경 검사. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62321/62321fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62321/62321fig02.jpg"> 그림 2: 부동 블록을 사용하여 준비된 샘플 지원 필름의 일반적인 예입니다. 그리드 정사각형(왼쪽) 및 이미지(오른쪽) 뷰는 (A) 무정형 탄소, (B) 그래핀 옥사이드, (C) 그래핀 서포트 필름에 대해 부동 블록을 사용하여 제조된다. 비정질 탄소 지지체는 음극염을 위한 70S 리보솜의 제조에 사용되었으며, 그래핀 옥사이드 및 그래핀 지지체는 저온-EM을 위한 70S 리보솜을 제조하는 데 사용되었다. A와 C의 이미지는 27에서 수정됩니다. 그리드 사각형 = 10 μm에 대한 배율 막대; B 및 C 그리드 사각형 = 5 μm에 대한 스케일 바; A-C 이미지 뷰의 배율 막대 = 50nm입니다. 약어 : 냉동 - EM = 냉동 전자 현미경 검사. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62321/62321fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

극저온 전자 현미경검사(cryo-EM)에 대한 샘플 제제는 이 방법의 구조 결정 워크플로우에서 상당한 병목 현상이다. 여기서, 우리는 전송 EM 연구를 위한 견본을 안정시키기 위하여 지원 필름의 제조를 위한 사용하기 쉬운, 3차원 인쇄 블록을 사용하기 위한 상세한 방법을 제공합니다.

Structure determination by cryo-electron microscopy (cryo-EM) has rapidly grown in the last decade; however, sample preparation remains a significant ...

여기서 우리는 이러한 섬세한 필름의 처리를 용이하게하는 새로운 부양 블록을 사용하여 지원 필름으로 냉동 EM 샘플을 준비하는 향상된 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 샘플이 데우레이션과 같은 손상 효과가 발생할 수 있는 공기 물 인터페이스로부터 보호된다는 것입니다. 여기에 제시된 프로토콜 중 하나는 친수성 그래프를 렌더링하기 위해 고가의 치료를 피하므로 전체 EM 커뮤니티에 대한 접근성을 증가시합니다.작은 부양 장치는 아직 널리 좋은 준비를 위해 전기 현미경 검사법에 의해 사용되지 않습니다. 따라서 이러한 시각적 데모는 사용 기준을 제공할 수 있습니다. 먼저 TEM 그리드를 이중 증류수와 에델 아세테이트로 세척한 다음 플라즈마 세척을 수행합니다.그런 다음 샘플의 10~12마이크로리터를 버퍼 교환에 잘 첨가하고, 부양 블록과 10~12마이크로리터의 2% 소변 아세테이트 용액을 인접한 비버퍼 교환에 잘 첨가하여 음의 염색을 한다. 얼룩으로 작업 할 때 적절한 안전 예방 조치를 취하는 것이 필수적입니다. 엄선하여 전유식 카본 필름을 얹은 두 개의 작은 운하 를 잘라냅니다.유수 부조각이 우물에 들어갈 수 있을 만큼 넓고, 탄소가 떠있는 동안 조각이 우물에 앉을 수 있고 핀셋으로 조각을 처리할 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인하십시오. 운하는 우물의 경사로에 앉아 탄소 층이 액체 샘플의 표면에서 관찰 될 때까지 45도의 대략적인 각도로 우물에 마이크를 담그다. 시료로 탄소를 배양한 후, 카본 필름을 회수하고 잔류 점액 시료 보존을 최소화하기 위해 매우 천천히 운하 시트를 철회한다.필터 종이로 하부 비탄소 표면을 탭하여 중유를 조심스럽게 얼룩시켜 여분의 액체를 제거하고 2% 소변 아세테이트 용액을 함유한 상대 우물에 마이크 조각을 침수하여 탄소층을 음의 얼룩으로 교환한다. 세척 및 플라즈마 세척 EM 그리드의 거룩한 탄소 덮인 측면으로 부동 탄소 층을 복구합니다. 그런 다음 TEM에 이미징될 때까지 그리드를 건조하게 두어 공기 오염을 피하기 위해 이를 덮는 것이 좋습니다.이전에 설명한 대로 TEM 그리드를 세척한 후, 사용 직전에 그래핀 옥사이드 서스펜션을 준비하고 철저히 소용돌이를 준비합니다. 그런 다음 그래핀 옥사이드 현탁액 10~12마이크로리터를 4개의 비완충 교환 우물에 넣습니다. 부양 블록을 따라.블록의 나머지 4개의 완충 교환 우물에 이중 증류수 또는 초순수수 10~12마이크로리터를 추가합니다. 각 우물의 그래핀 옥사이드 서스펜션에 4개의 그리드를 부드럽게 떨어뜨리고 1분 동안 배양하여 거룩한 탄소 덮인 면이 용액과 접촉하고 있는지 확인합니다. 1분 후 핀셋을 각 비버퍼 교환의 트위저 홈으로 슬라이딩하여 각 그리드를 조심스럽게 복구합니다.각 그리드의 구리 비탄소 커버 측을 두 배의 증류수로 부드럽게 간단하게 움직여 서 물 방울이 그리드에 표시될 때까지 인접한 물에 이중 증류수를 제공합니다. 그런 다음 조심스럽게 그리드 물이 필터 용지 조각에 대해 거꾸로 떨어 뜨립니다. 그리드를 덮고 핀셋에 두어 공기를 건조시다.유리 슬라이드에 증착된 구리 그래프 시트 위에 4개의 세척 그리드를 놓고, 모노레이어 그래핀과 그리드 사이의 친밀한 접촉을 허용하기 위해 각 그리드를 이소프로판올 한 방울로 덮습니다. 이소프로파놀의 완전한 증발 후, 유리 페트리 접시에 페리 염화물 용액에 그리드와 구리 그래핀 시트를 플로트. 그런 다음 공기를 오염하지 않도록 접시를 덮고 하룻밤 동안 실온에서 식각에 둡니다.TEM 그리드 크기보다 직경이 큰 루프를 사용하여 그래핀 모노레이어에 떠 있는 그리드를 어획하고 세척을 위해 이중 증류수를 함유한 유리 페트리 접시로 조심스럽게 옮기습니다. 그리드를 물에 두 번 세척하고 샘플 준비 및 급락 동결될 때까지 샘플 버퍼가 포함된 페트리 접시로 그리드를 전송합니다. 샘플의 10~12마이크로리터를 부양 블록의 우물에 넣습니다.샘플이 블록에 준비되면 클린 핀셋 쌍을 사용하여 버퍼 용액에서 그래 핀 코팅 그리드를 선택하고 잘 함유 된 샘플의 표면에 배치하십시오. 적절한 잠복기 후, 깨끗한 동결 핀셋으로 그리드를 선택하고 블로팅 및 진동을 진행합니다. 지지 부양 블록으로 준비된 음수 스테인드 그리드는 일반적으로 전체 그리드 표면에 걸쳐 무정형 탄소로 덮여 있습니다.탄소 필름의 파손은 어떤 경우에는 발생하지만, 많은 수의 그리드 사각형이 자연 그대로이므로 부정적인 염색 목적으로 적용됩니다. 마찬가지로, 좋은 필름 커버리지는 그래 핀 산화물 프로토콜을 사용하여 전체 그리드에서 일상적으로 달성됩니다. 그래핀 옥사이드 그리드는 원료로부터 신속하게 제조할 수 있으며 시료를 매우 보호합니다.동결 직전에 그래핀을 적재하고 시료 적용을 시동상태로 유지하는 것만으로 극저온-EM에 적합한 얼음 층을 생성하기에 충분합니다. 이 프로토콜은 그래핀 친수성 렌더링장비를 필요로 하지 않으며 시료 회수에 대한 이점을 제공합니다. 지지 부양 블록에는 각 웰의 부위에 두 개의 바늘 포트가 있어 C2에서 버퍼가 확장될 수 있으며 글리세롤 그라데이션에서 유래된 시료에 매우 유용합니다.부양 블록은 소량의 제어 가능한 버퍼 흐름뿐만 아니라 기능적 지원 필름을 활용하여 그리드 선호도 정화 방법을 탐색할 수 있게 되었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

출처: Bucher, T. 외, 『B. subtilis 바이오필름 연구를 위한 소분자 바이오필름 억제제 특성화 모델로서의 방법론』. J. Vis. 경험(2016)이 영상은 고해상도 이미징을 위해 성숙한 박테리아 바이오필름 집락을 준비하는 과정을 보여줍니다. 고정, 탈수, 장착, 금속 코팅 단계를 다루어 바이오필름 형태를 보존하고 시각화합니다.

형태학적 분석을 위한 박테리아 바이오필름 군락 준비

이 논문은 투과형 전자 현미경으로 현탁 세포를 시각화하기위한 사용하기 쉽고 저렴한 cryofixation 방법을 설명한다.

플 런지 프리즈 : 투과 전자 현미경에서 서스펜션 세포의 초 구조 및 면역 로컬 ​​라이 제이션 연구를위한 도구

이 연구는 전송 전자 현미경 검사 법에서 고가의 장비 없이 미생물의 직렬 ultrathin 섹션을 얻기 위한 안정적이 고 쉽게 절차를 선물 한다.

전송 전자 현미경 검사 법에서 미생물의 직렬 Ultrathin 섹션을 얻기위한 방법

악기 및 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨의 준비를 위한 방법 제공 됩니다. 아무 종이 blotting 단계 필요, 따라서이 단백질, 크게 샘플 손실을 감소 시키고 단일 세포 lysate 시각적 proteomics에 대 한 분석을 사용에 대 한 가질 수 해로운 결과 피하는.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

여기서, 우리는 관심 있는 지역을 표적으로 하기 위하여 직렬 블록 면 및 집중된 이온 광선 주사 전자 현미경 을 능등하게 결합하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이를 통해 3차원으로 효율적으로 검색하고 넓은 시야에서 드문 이벤트를 찾을 수 있습니다.

직렬 블록 얼굴 및 집중된 이온 빔 검사 전자 현미경 검사법을 사용하여 표적으로 한 연구 결과

여기에서는 초저온 전자 단층 촬영을 위한 세포 샘플 준비를 안내하는 3D 상관 집속 이온 빔 밀링을 위한 파이프라인을 제시합니다. 형광 태그가 부착된 관심 단백질의 3D 위치는 먼저 극저온 형광 현미경으로 측정한 다음 밀링을 대상으로 합니다. 이 프로토콜은 포유류, 효모 및 박테리아 세포에 적합합니다.

고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

지질 단층은 수십 년 동안 구조 연구를 위한 2차원(2D) 단백질 결정을 형성하는 기초로 사용되어 왔습니다. 그들은 공기 물 인터페이스에서 안정적이며 전자 이미징을위한 얇은 지지 재료로 작용할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생물학 연구를 위한 지질 단층을 준비하는 에 입증된 단계를 제시합니다.

전자 결정학 연구를 위한 지질 단층 방법을 이용한 샘플 준비

streptavidin 친화성 그리드를 제작하기 위한 단계별 프로토콜은 초저온 전자 현미경에 의한 까다로운 고분자 샘플의 구조 연구에 사용할 수 있도록 제공됩니다.

극저온 전자 현미경 시료 전처리를 위한 Streptavidin-Affinity Grid 제작

지혈 혈전 형성을 위한 천자 상처 절차가 여기에 제시되어 있습니다. 형성된 혈전은 크며 직경이 수백 미크론입니다. 따라서 볼륨 이미징 접근 방식이 적합합니다. 우리는 많은 사람들이 사용할 수 있는 고해상도 접근 방식으로 몽타주 광역 투과 전자 현미경을 제안하고 분취 프로토콜에 대해 자세히 설명합니다.

Puncture Wound Hemostasis and Preparation of Samples for Montaged Wide-Area Electron Microscopy Analysis

전통적인 팁 기반 연속 희석 중 플라스틱 용기에 펩타이드 흡착은 효능 결정에 상당한 영향을 미치고 약물 발견의 선도 물질 식별 및 선도 물질 최적화 단계에 사용되는 구조-활성 관계의 이해를 혼란스럽게 할 수 있습니다. 여기에서는 펩타이드 샘플의 자동화된 음향 비접촉 연속 희석 방법에 대해 설명합니다.

효능 판별 분석에서 펩타이드 작용제의 직렬 희석에 대한 분배 자동 음향

배우세요 지원 부동 블록을 사용한 냉동 전자 현미경 샘플 준비법으로 무정형 탄소와 그래핀 산화물 지원막을 효율적으로 전달하는 방법입니다. 이 기술은 공기-수계면으로부터 샘플을 보호하며 수동 처리와 오염을 최소화합니다.

지원 부동 블록을 사용하여 전송 전자 현미경 검사법에서 샘플 지원 필름의 준비

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