고세포 밀도 생물반응기를 이용한 실시간 정량적 세포내 NMR에 의한 인간 세포에서의 단백질-리간드 상호작용 모니터링

세포 내 NMR 분광법은 살아있는 세포에서 단백질 구조와 기능을 직접 연구하고 단백질-리간드 상호작용과 같은 생물학적으로 관련된 과정을 모니터링하는 독특한 접근 방식을 제공합니다. 이 NMR 생물반응기는 분광계에서 며칠 동안 많은 수의 인간 세포를 생존 가능하고 대사적으로 활성으로 유지할 수 있으며, 실시간 세포 내 NMR 적용을 가능하게 한다. 이 방법은 형태적 또는 화학적 변화를 겪는 임의의 용해성, 자유롭게 텀블링되는 세포내 단백질에 적용될 수 있다.

동위원소 표지는 방법의 적용가능성을 더욱 확장시킨다. 시작하려면, 두 번째 유동 유닛 NMR 튜브를 사용하여 유동 유닛을 조립하고, 나중에 셀을 포함하는 것으로 교체한다. 올바른 조립을 위해 흐름 장치 작동 지침을 참조하십시오.

유량 장치 온도 조절기에 연결된 수조를 섭씨 37도로 설정하고 저수지 병을 수조에 놓습니다. 저수지 병의 FEP 튜브를 펌프에 연결하십시오. 바이오리액터 밸브를 돌려 바이패스하고 펌프를 매체로 미리 채웁니다.

이어서, 생물반응기 밸브를 돌려 유동시키고, 생물반응기를 분당 0.1 밀리리터의 배지로 미리 채운다. 형질감염된 HEK 293 T 세포의 T75 플라스크를 이산화탄소 인큐베이터로부터 취하고, 소모된 배지를 제거한다. 두 밀리리터의 트립신 EDTA를 세포에 첨가하고, 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션하여 세포를 분리한다.

20 밀리리터의 완전한 DMEM으로 트립신을 비활성화하고 위아래로 피펫팅하여 세포를 완전히 다시 일시 중단하십시오. 그런 다음 50 밀리리터 원심 분리 튜브에 옮깁니다. 세포를 실온에서 다섯 분 동안 800X G에서 원심분리하고 상층액을 버린다.

세포 펠릿을 1.5밀리리터 캡핑된 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 세포를 아가로스 실에 내장하려면 블록 히터에서 섭씨 85도에서 응고 된 아가로스의 분취량 하나를 녹인 다음 블록 히터의 섭씨 37도에서 용액에 보관하십시오. 파스퇴르 피펫으로 유량 장치 NMR 튜브의 바닥을 60 ~ 70 마이크로 리터의 1.5 % 아가로스 겔로 채우고 얼음 위에 올려 놓고 5 밀리미터 높이의 바닥 플러그를 만듭니다.

셀 펠릿을 블록 히터에서 15 ~ 20 초 동안 가열하고 기포 형성을 피하면서 세포를 450 마이크로 리터의 아가로스 용액에 조심스럽게 재현탁하십시오. 세포 / 아가로스 현탁액을 1 밀리리터 주사기에 연결된 0.75 밀리미터 내경의 30 센티미터 길이의 크로마토 그래피 PEEK 튜브로 흡인하십시오. 튜브를 실온에서 두 분 동안 식히십시오.

유동 유닛 NMR 튜브를 실온에서 100 마이크로리터의 PBS로 미리 채운다. 아가로오스에 매립된 세포의 실을 주사기를 부드럽게 밀어서 유동 유닛 NMR 튜브 내로 캐스팅한다. 유량 유닛으로부터 빈 NMR 튜브를 제거하고 몇 분 동안 분당 두 밀리리터로 유량을 증가시켜 입구 튜브 내의 잔류 가스 버블을 제거한다.

유속을 분당 0.2 밀리리터로 설정하고 세포가 들어있는 NMR 튜브를 천천히 그러나 꾸준히 위쪽으로 밀어 넣습니다. 생물반응기 배지를 분당 0.1 밀리리터의 유속으로 공급한다. NMR 분광계의 온도를 310켈빈으로 설정하고 분광계에 유량 유닛을 삽입합니다.

생물반응기가 NMR 분광계에 삽입되면 배지 교환이 가능하도록 몇 분 정도 기다립니다. 양성자 채널의 정합 및 튜닝을 조정하고, 자석을 심고, 양성자를 90도 하드 펄스 길이로 계산하십시오. 양성자 하드 펄스에 따라 각 펄스 시퀀스에서 양성자 전력 레벨을 조정하십시오.

첫 번째 zgesgp 양성자 NMR 스펙트럼을 기록하여 샘플 함량을 필드 균질성으로 기록한다. zgesgp 및 p3919gp 또는 SOFAST-HMQC 실험을 원하는 개수로 복사하고 획득 스풀러에 큐에 넣습니다. 외부 분자의 농축된 용액을 멸균된 긴 바늘 주사기로 실리콘 튜브를 관통하여 배지 저장고 병에 주입한다.

NMR 실험이 끝나면 세포가 들어있는 튜브를 빈 튜브로 교체하고 유동 장치를 물로 헹구십시오. 표지되지 않은 탄산 탈수효소를 발현하는 세포의 경우, 제로 충전 및 지수 라인 확장 창 기능을 적용하여 p3919gp 스펙트럼을 처리한다. 질소-15 표지된, 수퍼옥사이드 디스뮤타제를 발현하는 세포의 경우, 두 차원 모두에서 제로 필링 및 제곱 부호 벨 윈도우 기능을 적용하여 SOFAST-HMQC 스펙트럼을 처리한다.

MATLAB에서 사용자 지정 스크립트 Load_ascii_spectra을 사용하여 스펙트럼 영역을 가져옵니다. Load_acqus 스크립트를 실행하여 1D 스펙트럼에서 타임스탬프를 추출합니다. mcr_main 스크립트를 실행하여 MCR-ALS 2.0 GUI를 열고 데이터 선택 탭에서 스펙트럼 매트릭스를 로드합니다.

플로팅하여 데이터를 확인합니다. 단수 값 분해 또는 수동으로 구성 요소의 수를 평가하고 순수 스펙트럼의 초기 추정 방법을 선택합니다. 가장 순수한 변수 감지 또는 진화하는 요인 분석을 사용할 수 있습니다.

데이터 집합 선택 창에서 계속을 선택합니다. 농도에 대한 제약조건을 제약조건:행 모드 창에서 설정합니다. 부정성이 아닌 제약 조건을 적용하고 fnnls를 구현으로 선택하고 두 개를 종 수로 선택합니다.

그런 다음 하나의 클로저 제약 조건을 적용하고, 제약 조건을 하나로 설정하고, 클로저 제약 조건을 동일하게 설정하고, 모든 종에 적용합니다. 제약조건:열 모드 창에서 스펙트럼에 대한 제약조건을 설정합니다. 부정성이 아닌 제약 조건을 적용하고 구현으로 fnnls를 선택하고 두 개를 종 수로 선택하십시오.

마지막 창에서 50번의 반복과 0.01 수렴 기준을 설정합니다. 농도, 스펙트럼 및 표준 편차에 대한 출력 이름을 지정합니다. 계속을 클릭하여 MCR-ALS 피팅을 실행합니다.

생물반응기 내의 세포는 트리판 블루 시험에 의해 확인된 바와 같이 최대 72시간 동안 생존을 유지할 수 있다. 생물반응기는 HEK 293 T 세포의 시토졸에서 과발현된 탄산 탈수효소에 대한 두 개의 억제제인 아세타졸아미드 및 메타졸아미드의 결합의 실시간 모니터링을 위해 사용되었다. 과발현된 단백질로부터의 신호의 존재 및 필드 균질성은 첫 번째 여기-조각된 양성자 스펙트럼으로 평가되었다.

탄산 탈수효소의 경우, 아연 배위 히스티딘 및 기타 방향족 잔기로부터 발생하는 WATERGATE 스펙트럼의 백만 당 11 내지 16 부분 사이의 영역에서 양성자 신호를 관찰함으로써 두 억제제의 세포 내 결합을 모니터링하였다. 성공적인 결합은 추가적인 신호의 출현에 의해 확인되었다. MCR-ALS는 자유 및 결합된 탄산 탈수효소로부터 발생하는 NMR 신호를 분리하고, 두 종의 상대적 농도 프로파일을 제공하기 위해 사용되었다.

상기 생물반응기는 글루타티온 퍼옥시다제 모방체인 ebselen에 의해 촉진된 분자내 이황화 결합의 아연 결합 슈퍼옥사이드 디스뮤타제의 형성을 모니터링하기 위해 적용되었다. 2D 스펙트럼의 선택된 영역에 대한 MCR-ALS 분석은 두 종에서 발생하는 신호를 분리하고 상대적 농도 프로파일을 제공했습니다. 기포 형성을 일으킬 수있는 압력 점프를 피하기 위해 흐름 장치 NMR 튜브를 천천히 그리고 꾸준히 삽입하고 제거하는 것이 중요합니다.

NMR 생물 반응기의 개발은 살아있는 세포에서 redux 조절 및 약물 / 표적 상호 작용을 플로팅하는 것과 같은 원자 분해능 시간 의존적 인 과정을 연구 할 수있는 길을 열었습니다.