Name: CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: 배우세요 CRISPR/Cas9 유전자 노크인 방법을 대식세포 및 T 세포주에서 형광 리포터와 세포 분류를 이용해 적용하는 법을. 약물 내성 선택 없이 Rosa26 유전자좌에 효율적으로 유전자를 삽입하여 면역세포 기능 유전체 연구에 활용할 수 있습니다.

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신샹의과대학의 유동 세포측정 핵심 시설에 감사드립니다. 이러한 기술의 개발은 NSFC가 LZ, 81471595 및 YL에 32070898 81601360 보조금에 의해 지원되었습니다. 이 작품은 허난교육위원회 제21IRTSTHN030재단의 지원도 받고 있다.

1. 로사26 로커스를 대상으로 sgRNAs의 설계 및 플라스미드 건설
<ol><li>원하는 삽입 부위 주변의 설계 가이드 RNA
	<ol>
<li>마우스 Rosa26(이하 mRosa26로 지정) 노크-인 실험에 대한 삽입 부위가 mRosa26의첫 번째 인트론에 위치하고 있는지 확인; 이 사이트는 이전 연구에서 사용 되었습니다28,29. 인간 세포에서의 노크-인 실험의 경우, 삽입 부위가 mRosa2630의인간 호모로로 확인된 인간 ROSA26 궤적(이하 hROSA26)에있는지 확인한다.</li>
		<li>마우스 게놈 정보학(http://www.informatics.jax.org/)과 엔셈블 게놈 브라우저(http://www.ensembl.org/index.html)로부터 획득한 마우스 및 인간 종의 게놈 서열을 각각 사용한다. mRosa26 또는 hROSA26 궤적의 게놈 서열의 50개의 베이스 쌍(bp)을 복사하여 원하는 삽입 부위를 측면으로 한다.</li>
		<li>온라인 웹 도구 CRISPOR (http://crispor.tefor.net/)31을사용하여 디자인 가이드 RNA . 입력 시퀀스의 100bp를 1.1.2에서 붙여넣습니다. 특이도 점수가 높은 두 개의 가이드 RNA, 고효율 점수 및 낮은 오프 타겟 활성을 선택합니다. 또한, 더 높은 Doench 점수RNA 가이드를 선택하고"비효율적"32로표시된 것을 피하십시오. 참고: 대체 CRISPR 설계 도구는 벤치링 CRISPR 설계 도구(https://benchling.com/crispr)와 같은 가치 있고 공개적으로 사용할 수 있습니다. CRISPR/Cas9 매개 녹인 돌연변이 셀의 주파수를 증가시키기 위해, 가능하면 원하는 삽입 부위에 가까운 두 개의 가이드 RNA를선택한다 33.</li>
		<li>mRosa26 메뚜기의 경우 mR26-sg1(5'-CTCCAGTTTCTAGAAGAT -3') 및 mR26-sg2(5'-CGCCCATCTTCTAGAAAGAC-3')(그림 1A)로지정된 2개의 인접 가이드 RNA를 사용하십시오. hROSA26 메큐의 경우, hR26-sg1(5'-GGCGATGACGAGATCACGCG -3') 및 hR26-sg2(5'-AATCGAGAAGCGACTCACA-3')(그림 1B)를사용합니다. 참고: mR26-sg1 및 mR26-sg2및 hR26-sg2의 게놈 편집 활동은 RAW264.7 세포 및 Jurkat 세포에서 각각 평가하였다(보충 파일, 도면 S1참조).</li>
	</ol></li>
	<li>Rosa26 로커스를 대상으로 sgRNA를 포함하는 CRISPR 발현 벡터의 복제
	<ol>
<li>하나의 가이드 RNA에 대한 앞으로 올리고를 합성하고 역 (보충 파일참조). 참고: U6 프로모터에 의해 구동되는 발현에 도움이 되는 가이드 서열의 시작에 'G' 뉴클레오티드를 추가하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 전술한 mR26-sg1을 복제하기 위해, 전방 올리고는 CACCGCTCCAGTCTTTCTAGAAGAT이고 역 올리고는 AAACATCTTCTAGAAGAGGGAGC이다. 전방 올리고에 추가 G와 역 올리고의 보완은 굵게 표시됩니다.</li>
		<li>가이드 RNA에 대응하는 클론 합성 올리고스는 장연구소(https://www.addgene.org/crispr/zhang/)에 의해 개발된 gRNA 클론에 대한 일반적인 프로토콜을 사용하여 전작21(도 1C)에서생성된 올인원 CRISPR 발현 벡터 pX458-DsRed2로 변환; 그러나, 젤 정화 단계를 건너뛰고 PCR 정화 키트를 사용하여 소화된 벡터를 정화한다(재료표참조). 참고: 이전 프로토콜에서, BbsI 소화 벡터의 겔 정화가 수행되었다; 그러나 이 단계는 시간이 많이 걸립니다. 본 프로토콜에서 소화된 제품은 PCR 정제 키트를 사용하여 정제되고 일반적으로 유사한 효율을 가진 양성 식민지를 생성하는 다운스트림 결찰 반응에 직접 사용된다.</li>
		<li>제조 업체의 지시에 따라에체리치아 대장균 DH5α 유능한 세포의 50 μL로 결찰 생성물(step 1.2.2)의 10 μL을 변환합니다. 암피실린(100 μg/mL)이 있는 LB 한천 플레이트에서 3개의 콜로니를 무작위로 골라 내고, 하룻밤 동안 배양하기 위해 암피실린을 장착한 LB 배지 3mL로 접종한다.</li>
		<li>sanger 시퀀싱을 위해 야간 세균 배양 1mL을 사용하고 구조가 정확하다는 것이 확인될 때까지 나머지를 4°C에서 유지하십시오: pDsR-mR26-sg1 및 pDsR-mR26-sg2용 mRosa26 메뚜기 노크-인, hROSA26 궤적용 pDsR-hR26-sg1 및 pDsR-hR26-sg2.</li>
		<li>고농도 의 플라스미드 DNA(약 2μg/μL)를 대금판으로 준비하여 질산등급 플라스미드의 정화를 위한 맥시프레플 키트(재료표참조)를 준비한다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 동종 재조합 템플릿으로 타겟팅 벡터의 설계 및 구성
<ol><li>
상동성 지향 수리 템플릿 설계
	<ol>
<li>CAG 하이브리드 프로모터, POI의 cDNA복제를 허용하는 AscI 제한 사이트, IRES-EBFP2 리포터, 소 성장 호르몬 폴리아데니션(bGH-polyA) 신호(그림1B)를 포함하는 이전 연구29에서최적화된 발현 카세트를 사용하여 POI를 구성적으로 표현하기 위한 표적 벡터를 설계한다.</li>
		<li>mRosa26 또는 hROSA26 궤적의 게놈 서열과 동성애를 공유하는 호모로지 암(HAs)을 설계합니다. 원하는 삽입 부위로부터 식 카세트의 왼쪽까지 상류 게놈 서열에 대응하는 5' HA의 ~1kb를 포함한다. 유사하게, 삽입 부위로부터 하류 게놈 서열에 대응하는 3' HA의 ~1kb를 발현 카세트의 오른쪽으로 포함한다. 참고: 표현식 카세트는 CRISPR/Cas9 절단사이트(34)에가능한 한 가깝게 삽입된다. CRISPR/Cas9에 의한 표적 알레일의 재절단을 피하기 위해, 포팅벡터(34,35)에프로토스페서-인접 모티프(PAM) 서열(5'-NGG-3')에 뉴클레오티드 변화를 통합한다.</li>
		<li>타겟팅 벡터의 선형화를 허용하려면 5' HA의 상류에 있는 고유한 EcoRI 사이트와 3HA 하류의 고유한 BamHI 사이트를 삽입합니다.</li>
		<li>상용 벤더가 표적 벡터를 합성하고 pKR26-iBFP 및 pKhR26-iBFP로 지정하여 mRosa26 및 hROSA26 노크인을 각각 지정합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
타겟팅 벡터를 상동성 지향 복구 템플릿으로 구성
	<ol>
<li>POI를 발현하기 위해, Ensembl 게놈 브라우저로부터 cDNA 서열(coding sequence)을 얻고 가장 긴 단백질 서열을 소유한 전사체를 선택한다. 예를 들어, 인간 ACE2 유전자의 cDNA는 ACE2-202 ENST00000427411.2 및 인간 RASGRP1 유전자의 cDNA는 RASGRP1 ENSG000000172575이다.</li>
		<li>상용 벤더의 도움으로 POI의 cDNA를 합성합니다. 또한 PCR 증폭을 통해 cDNA를 복제할 수도 있다(여기에 설명되지 않음). CDNA의 ATG 개시 코돈과 cDNA의 정지 코돈(5'-GGCGCGCC-3') 직전에 AscI 제한 사이트(기울임꼴 및 굵은) 및 코자크 컨센서스 번역 개시 사이트(밑줄)를 포함하는 서열 GGCGCGCCACC(5'-3')를 배치합니다.</li>
		<li>AscI로 합성 된 서열을 소화하고 제조 업체의 지침에 따라 제한 소화 후 DNA 조각을 정화하도록 설계된 PCR 정화 키트를 사용하여 정화하십시오 (재료 표참조).</li>
		<li>정제된 cDNA 인서트를 제조업체의 지시에 따라 T4 DNA 리게아제를 사용하여 AscI-선형화된 백본 벡터 pKR26-iBFP 또는 pKhR26-iBFP에 리게이트한다.</li>
		<li>최종 표적 벡터, pKR26-POI-iBFP 또는 pKhR26-POI-iBFP를 시퀀싱하여 확인합니다. maxiprep을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 검증된 구문을 정화합니다.</li>
		<li>에코리 또는 BamHI를 사용하여 타겟팅 벡터를 소화하고 제조업체의 지침에 따라 PCR 정제 키트를 사용하여 소화 제품을 정화합니다. 선형 화된 표적 벡터(~0.8 μg/μL)를 -20°C에서 전기포기까지 저장합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 대식세포및T세포선의 전기화
<ol><li>전기 화에 대 한 세포 배양 준비
	<ol>
<li>준비 로스웰 공원 기념 연구소 (RPMI) 1640 10% 태아 소 혈청으로 보충 (FBS) Jurkat T 세포에 대 한 완전 한 성장 매체로. RAW264.7 대식세포를 배양하기 위해 10%의 FBS로 덜벡코의 수정된 독수리 매체(DMEM)를 준비합니다. 세포 선별 전에 배양 후 배양에 사용되는 미디어를 제외하고 100 개의 U / mL 페니실린 및 100 μg / mL 연쇄 절제술 (Pen / Strep)으로 모든 완전한 성장 매체를 보완하십시오.</li>
		<li>공급 업체의 지침에 따라 RAW264.7 및 Jurkat T 셀의 세분화를 수행 (재료의 표참조). RAW264.7 세포를 세분화할 때 트립신-EDTA 용액(0.25%)을 사용하여 세포를 분리합니다. RAW264.7 및 Jurkat 세포에 대한 냉동 보존 배지로 10 % (v / v) DMSO로 보충 된 FBS를 사용합니다.</li>
		<li>RAW264.7 대식대식대용 5분 동안 250 × g에서 세포를 수집하고 Jurkat T 세포의 경우 8분 동안 90 × g를 수집합니다. 그런 다음 1× DPBS의 5-10 mL로 세척하십시오 (Ca2 + 또는 Mg2 + 이온제외). DPBS를 제거합니다.</li>
		<li>1× DPBS의 2mL를 사용하여 세포 펠릿을 다시 중단합니다. 세포의 10 μL을 사용하고 0.2 % 트라이팬 블루의 동일한 부피와 혼합하여 세포 수와 생존가능성을 추정합니다. 참고: 세포 배양이 >90% 생존력을 가지고 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>단일 노크-인 실험을 위해 5번의 반복으로 10μL 핵형성 팁으로 전기포공을 수행합니다. 2.0 × 106 세포에 필요한 부피를 계산하고 원심 분리에 의해 세포를 펠릿. 3.1.3 단계에서 설명된 바와 같이 1× DPBS로 셀 펠릿을 다시 세척한다. 참고: 10μL 핵형성 팁을 사용할 때는 전기기당 4.0 ×105세포가 필요합니다. 이에 따라, 1개의 노크인 실험을 위해 적어도 2.0 × 106세포를 준비한다.</li>
		<li>펜/스트렙 없이 웰당 0.5mL의 완전한 성장 매체(3.1.1단계에서 제조)로 24웰 플레이트를 준비하고 37°C 인큐베이터에 프리웜을 준비한다.</li>
	</ol></li>
	<li>CRISPR/Cas9 성분 및 표적 벡터의 전기화
	<ol>
<li>전기 기공 시스템을 켭니다. 이전 연구21에최적화된 전기포기 파라미터 사용 : RAW264.7 대식세포용 1,400 V/20 ms/2 펄스, Jurkat T 세포를 위한 1350 V/20 ms/2 펄스.</li>
		<li>파이펫팅으로 인한 시료 손실을 고려하여, 각 CRISPR/Cas9 벡터의 2.5 μg, 선형화된 표적 벡터의 2.4 μg, 및 리서스펜션 버퍼 R의 2.5 μg를 포함하는 멸균 1.5 mL 마이크로센트심심분리기 튜브에서 55 μL 전기기화 혼합물을 준비한다. 참고: 시간을 절약하기 위해 전기포기 혼합물은 원심 분리(3.1.5단계)에서 제조될 수 있다.</li>
		<li>단계 3.2.2에서 55 μL 전기 기화 혼합물에서 2.0 × 106 셀 (단계 3.1.5에서 제조)을 다시 중단합니다.</li>
		<li>파이펫을 사용하여 10 μL 핵혈제 팁을 사용하여 3.2.3 단계에서 세포/전기 포기 혼합물을 흡인한다. 참고: 파이펫팅 하는 동안, 전기 기고 장애를 일으킬 수 있는 기포를 도입 하지 마십시오.</li>
		<li>전자기화 키트에서 3mL의 버퍼 E로 채워진 튜브에 샘플을 추가합니다.</li>
		<li>3.2.1 단계에서 설명된 바와 같이 두 세포 유형에 대한 전기 포파라미터를 적용한다.</li>
		<li>3.1.6 단계에서 예온 된 배지로 24 웰 플레이트의 한 우물로 샘플을 옮기.</li>
		<li>다른 4개의 반복에 대해 3.2.4-3.2.7단계를 반복하고 대상 벡터만 및 CRISPR 발현 벡터만 컨트롤한다. 참고: 다른 세포 유형/플라스미드 DNA로 전환할 때 핵형성 팁과 튜브를 변경합니다.</li>
		<li>48-72h의 전염된 세포를 배양하여 전기측정 분석 또는 형광 활성화 셀 정렬(FACS) 이전에 CRISPR/Cas9 성분의 전기기화 및 발현 후 회복을 허용한다. 24시간 후 형광후에서 적색 채널을 탑재한 형광 현미경을 사용하여 DsRed2의 발현을 검사한다. 참고: DsRed2 형광 세포를 모니터링하는 이점은 전기기화의 효율을 추정할 수 있고 추가 세포 정렬에 대한 적합성을 예측할 수 있다는 것입니다.</li>
	</ol></li>
</ol>4. 세포 분류는 푸티드 노크 인 세포를 분리
<ol><li>FACS 선별하기 전에, 완전한 성장 배지로 한 번 전감염된 세포를 세척하십시오. 펠릿 세포는 3.1.3 단계에서 설명된 바와 같이 원심분리및 500 μL의 신선한 배지에서 펠릿을 재연한다.</li>
	<li>85 μm 노즐과 낮은 유량으로 셀 선별기(생물 안전 캐비닛에 위치)를 설정합니다. 20-30셀을 96웰 마이크로플레이트의 덮개에 정렬하여 단일 셀 정렬 효율과 정밀도를 분류하고 테스트하기 위한 "단일 셀" 모드를 선택합니다. 각 우물의 중앙에 국한된 한 방울은 계측기의 적절한 설정을 나타냅니다.</li>
	<li>세포 현탁액을 4.1 단계에서 멸균 FACS 튜브로 옮기고 SYTOX 레드 데드 셀 스테인을 최종 농도1 nM에 추가합니다.</li>
	<li>셀 선별기의 샘플을 분석합니다. SYTOX 레드와 EBFP2는 405 nm 레이저에 의해 흥분하고 V450 / BV421 및 APC 채널에 의해 각각 감지됩니다. DsRed2는 488 nm 레이저에 의해 흥분하고 PE 채널에 의해 검출된다. 비트랜스감염 된 세포 및 EBFP2- 및 DsRed2 단일 양성 세포를 스펙트럼 보정을 위한 컨트롤로 사용하십시오.</li>
	<li>10개의 단일 셀을 사전 따뜻하게 된 완전한 성장 배지의 웰 당 150 μL을 포함하는 96 웰 마이크로 플레이트의 각 우물에 정렬합니다. 주카트 T 세포와 같은 서스펜션 세포주 및 평평한 바닥 마이크로플레이트와 같은 서스펜션 세포주를 배양하기 위해 둥근 바닥 마이크로플레이트를 사용하여 부착된 RAW264.7 대식세포를 위해 사용하십시오. 참고: 우물당 10개의 세포를 분류하는 것은 세포 생존을 개선하고 종자해야 하는 96웰 마이크로플레이트의 수와 유동 세포측정 및 지음에 의해 가려져야 하는 시료수를 최소화하기 위한 최적화된 전략입니다. 잘 당 하나의 셀만 정렬하는 경우, 더 많은 마이크로 플레이트의 파싱은 올바르게 편집 된 세포를 얻기의 기회를 증가해야합니다.</li>
</ol>5. 양성 노크 인 세포의 선별 및 검증
<ol><li>
유동 세포측정에 의한 후보 노크인 세포 에 대한 선별
	<ol>
<li>10-15일 동안 4.5단계에서 세포를 배양하고 3일마다 완전한 성장 배지를 추가하여 증발을 통해 잃어버린 액체를 대체합니다. Jurkat T 세포의 경우, 둥근 바닥 96 웰 플레이트에서 성장한 세포를 평평한 바닥 플레이트로 이송하여 세포 증식을 최적화합니다.</li>
		<li>확장된 정렬된 셀을 48웰 플레이트로 이송하여 추가 확장을 합니다.</li>
		<li>세포가 합류에 가까우면 배양의 절반을 사용하여 유동 세포측정(그림3)에의해 EBFP2 발현을 검사한다. 일반적으로, 컨물성장 후 48웰 플레이트내의 배양의 절반은 0.5-1.0 ×105세포와 동일하며, 이는 유동 세포측정에 의한 하나의 샘플의 분석에 적합하다.</li>
		<li>추가 증식을 위해 나머지 세포를 24웰 플레이트로 이송합니다.</li>
		<li>추가 지평 실험을 위한 EBFP2 양성 세포의 높은 비율을 소유하는 후보 세포 인구를 유지합니다. 참고: 10개의 세포가 96웰 마이크로플레이트의 각 우물로 분류되기 때문에, 노크인 세포가 녹인 유전자를 발현하지 않는 세포로 성장할 수 있다. 따라서 EBFP2 양성 세포를 음의 세포로부터 분리하기 위해 추가 적인 세포 분류 라운드를 수행하는 것이 정상이다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
PCR 및 시퀀싱에 의한 후보 노크 인 세포 에 대한 선별
	<ol>
<li>2 × 105 후보 셀을 수집합니다. DNA 준비 키트를 사용하여 게놈 DNA를 추출하십시오(재료 표참조).</li>
		<li>정확한 상동성 지향 수리(HDR)가 mRosa26 메큐에서 발생했는지 확인하기 위해, 후보 노크인 세포의 게놈내의 임의 부위가 아닌 M Rosa26 메큐에서 발생했으며, HA의 각 측면에 걸친 프라이머로 PCR을 수행한다(도4). 표적 벡터(외부 올리고) 외부게놈 영역에 위치한 프라이머 1개 및 표적 벡터(내부 올리고) 내부에 있는 다른 프라이머를 선택한다. 참고: hROSA26 궤적에서 HDR을 확인하는 데 유사한 디자인이 사용됩니다. PCR 프라이머는 POI 서열의 삽입을 검출하기 위해 쉽게 설계할 수 있습니다. 또한, 야생형 및 노크인 유전자형은 3프라이머 PCR을 사용하여 동시에 검출될 수 있다(보충 파일, 도S2참조).</li>
		<li>빠른 복제 키트를 사용하여 양수 PCR 제품을 복제합니다(재료 표참조). 반응 혼합물을 DH5α 유능한 세포로 변환합니다.</li>
		<li>무작위로 변환 당 8-10 개별 세균 성 식민지를 선택하고 Sanger 시퀀싱에 의해 단계 5.2.3에서 PCR 제품을 시퀀스.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
면역블롯 분석 및 선호도 정제에 의한 양성 노크 세포의 검증 참고: 후보 세포는 단백질-단백질 상호 작용연구를 위한 POI 의 삽입 또는 친화성 정제(AP)의 유효성검사를 위한 면역블롯 분석을 실시한다.<ol>
<li>항체 제조업체의 지침에 따라 면역블롯 분석을 수행합니다. 1 차적인 항체 및 이차 항체의 사용에 관하여 정보에 대한 재료의 표를 참조하십시오.</li>
		<li>제조업체의 지침에 따라 스트렙-택틴 세파로즈 구슬을 사용하여 OST 태그POI를 AP에 표현하는 노크 인 세포의 용액을 피사체(재료 표참조).</li>
		<li>이미저를 사용하여 화학 발광을 감지합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

우리의 실험에서, 우리는 예를 예로 인간 Jurkat T 세포 및 murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 노크세포 검열 및 검증에 구조 설계에서 면역 세포에서 노크에 편집을 수행하는 방법을 보여주었습니다. T 세포및 대식세포주 모두 형질36,37에내성이 있다; 그러나 CRISPR/Cas9 전달의 저효율 문제는 세포 분류와 결합된 형광 기자의 도움으로 극복할 수 있다. 이 프로토콜은 유전자 구조 실험 및 단백질 단백질 상호 작용 실험에 적합하지만, Rosa26 궤적의 노크 인 변형을 위해 프로토콜이 개발되었기 때문에 전사 인자의 결합 부위와 같은 규제 DNA 서열연구에는 적용할 수 없다.
이중 형광 기자는 CRISPR / Cas9 노크 인 편집을 도왔습니다. 면역 세포에서 CRISPR/Cas9 벡터의 독립적인 세트를 ...

면역 세포는 병원체에 대한 방어를 위해 중요합니다. 선천성 면역은 감염제의 통관 및 조직 항상성1,2의유지보수에필요합니다. 세포주 모형은 포유류 면역 계통의 분자 기초를 이해하기 위한 필수적인 공구입니다; 그(것)들은 인간 T 세포 활성화를 모델링하는 것과 같은 체외 기능적인 소사에서 이용되고, 면역 반응3,4를활성화하거나 감쇠에 있는 유전 요인의 기능을 결정하는 에서. 포유류 면역 계통은 엄청나게 이질적이며, 동등하게 중요한, 분자의 거대한 숫자는 주어진 세포유형의분화, 이동 및 기능을 제어한다는 것을 주의하는 것이 중요합니다5,6.
클러스터링 정기적으로 간격짧은 Palindromic 반복 (CRISPR)/Cas9 게놈 편집 도구는 정확한 방식으로 유전자의 기능성 기여를 용이하게 특정 세포 유형의 유전자 조작을 허용7,8. 여러 개의 출판 된 프로토콜은 HEK293 세포에서 리보뉴클레오 단백질 (RNPs)으로 알려진 Cas9 가이드 RNA 복합체의 형태로 CRISPR / Cas9의 전달을 설명했습니다, Jurkat 세포주, 1차 T 세포9,10,대식세포11,12, 13,줄기 세포14,및 기타15,16. 이들 프로토콜에서, 유전자 태깅은 일반적으로 내인성단백질(17,18)에형광 태그를 융합시킴으로써 달성된다. 그러나 특히 면역 세포에서 노크 인 실험19,20을용이하게하기 위해 단일 세포 분류와 호환되는 이중 형광 기자를 사용하는 시도는 거의 이루어지지 않았습니다.
면역 세포에 있는 새로운 유전 인자의 기능을 이해하기 위한 심층 기계분석은 일반적으로 유전자의 세포 형 특정 삭제, 유전 구조 실험 및 그것의 상호 작용자의 이상적으로 확인을 요구합니다. 면역 세포에서 유전자의 유전 삭제를 최적화하는 방법이9,15,21에발표되었음에도 불구하고 면역 반응을 이해하기 위해 다재다능한 기능을 가진 노크 인 알레를 도입하는 방법은 훨씬 적습니다. 따라서, 이 프로토콜에서 우리는 인간과 뮤린 면역 세포주 모두에서 안전한 항구 궤엽로26에서 관심있는 단백질 (POI)을 표현하는 효율적이고 매우 재현 가능한 프로토콜을 자세히 설명하는 것을 목표로합니다. CRISPR/Cas9(DsRed2)를 발현하는 플라스미드와 세포 분류에 의해 격리될 수 있는 재조합 DNA 템플릿(EBFP2)을 발한 플라스미드로 감염된 세포를 보강하기 위해 2색 리포터 시스템을 설계했습니다. 이 프로토콜에 따라, 우리는 제대로 연구된 단백질의 기능적 분석을 위해 인간 T 세포주 Jurkat 및 뮤린 대식세포 RAW264.7의 다중 노크-인 라인을 획득했습니다.
예를 들어, 우리는 인간 ACE2 (SARS-Cov-2의 수용체)22를안정적으로 표현하는 노크인 RAW264.7 대식세포를 얻는 방법을 이 프로토콜에서 보여준다. 선천성 면역 세포는 Covid-1923,24 및 인간 ACE2의 병인에 관여하기 때문에 복제 전에 세포로 바이러스 성 진입에 필요한 주요 수용체로 간주되기 때문에, 인간 ACE2의 노크와 대식세포는 대식세포 내부의 바이러스 증식 연구의 기계형 연구를위한 유용한 도구로 사용될 수 있습니다. 병행하여, 우리는 또한 친화성 트윈 스트렙 태그 (OST)와 그것의 아미노산 종결에서 융합된 RASGRP1 단백질을 표현하기 위하여 인간 ROSA26 메뚜기에서 유전자의 노크인의 예를 제시합니다. T 세포는 면역 요법에서 주요 표적 세포이며, 연구의 증가는 암에 그들의 반응성의 조작에 초점을맞추고있다 25,26. Rasgrp1은 T 세포 수용체의 주요 신호 분자 하류로 알려져 있으며 그 인터액터는 잘 해명되지 않는27,OST-RASGRP1 노크 -인 모델은 종양 및 감염에 T 세포의 반응을 조절하는 상호 작용을 식별하기위한 기초를 제공합니다. 종합하면, 이 공구는 Covid-19 연구 및 Rasgrp1와 상호 작용하는 새로운 분자의 발견에 이용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>Ge Healthcare</td><td></td><td>화학 발광</td></tr><tr><td>암피실린, 나트륨 염</td><td>MP Biomedicals</td><td>194526</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, HRP 관련 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>7074</td><td>at 1/5000 희석</td></tr><tr><td>Anti-RasGRP1 항체, 클론 10.1</td><td>Merck</td><td>MABS146</td><td>1.0 &mu; 작업 농도의 g/mL</td></tr><tr><td>AscI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0558S</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Actin (D6A8) Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>8457</td><td>at 1/1000 dilution</td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3136S</td><td></td></tr><tr><td>BbsI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3539S</td><td></td></tr><tr><td>셀로미터 미니 자동 세포 계수기</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>대장균 DH5&alpha; 유능한 세포</td><td>Takara</td><td>9057</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl Sulfoxide)</td> <td>MP Biomedicals</td><td>196055</td><td></td></tr><tr><td>DNeasy Blood & 조직 키트</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>세포 배양 시약</td></tr><tr><td>DPBS (10X), 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) with high glucose</td><td>HyClone</td><td>SH30022.01</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria&trade; Fusion</td><td>BD Biosciences</td><td></td> 생물 <td>안전 캐비닛</td></tr><tr><td>장착 FACS Canto 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 ml 폴리스티렌 원형 바닥 시험관</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo version 10.7</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>갭디(D16H11) XP&nbsp; Rabbit mAb</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>5174</td>, <td>1/1000 희석,</td></tr><tr><td>염소 anti-Mouse IgG(H+L), 2차 항체, HRP,</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31430</td>, <td>1/5000 희석,</td></tr><tr><td>Immobilon ECL, Ultra Western HRP Substrate</td>, <td>Millipore</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr>, <tr><td>Immobilon-PSQ, PVDF Membrane</td>, <td>Millipore</td><td>ISEQ00010</td><td></td></tr><tr><td>Jurkat</td>, <td>ATCC</td>, <td>TIB-152</td><td>https://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>MP Biomedicals</td><td>194531</td><td></td></tr><tr><td>LB 한천 분말</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>다중 채널 피펫 (30-300 &mu; L)</td><td>Eppendorf 또는 이와 유사한</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK5000</td><td></td></tr><tr><td>Neon Transfection System, 10 &mu; L 키트</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MPK1096</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15 mL 원추형 멸균 원심분리기 튜브</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq&reg; 핫 스타트 퀵-로드&reg; 2X Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>(M0489)</td> <td>고농도 GC% 템플릿</td></tr><tr><td>PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 to 180 kDa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 0.1-20&micro; l</td><td>Eppendorf 또는 이와 유사한</td><td>0030 075.005</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 2-200&micro; l</td><td>Eppendorf 또는 이와 유사한</td><td>0030 075.021</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 50-1000&micro; l</td><td>Eppendorf 또는 유사</td><td>제품 0030 075.064</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td></td></tr><tr><td>pX458-DsRed2</td><td>Addgene</td><td>112219</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>purify plasmid from restriction digestion</td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix</td><td>New England BioLabs</td><td>M0494S</td><td></td></tr><tr><td>RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td>https://www.atcc.org/</td></tr> <tr><td>재조합 Anti-ACE2 항체 [EPR4435(2)]</td><td>Abcam</td><td>ab108252</td><td>at 1/1000 dilution</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>HyClone</td><td>SH30027.01</td><td></td></tr><tr><td>Strep-Tactin Sepharose beads</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1201-010</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>사이톡스&트레이드; 적색 사세포 염색, 633 또는 635 nm 여기용</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S34859</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 리가제</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 폴리뉴클레오티드 키나아제</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 용액, 0.4%</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA 용액(0.25%), 페놀 레드</td><td>ThermoFisher 포함 Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>ZOE 형광 세포 이미저</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로튜브, PCR-clean</td><td>Eppendorf 또는 유사</td><td>0030 125.215</td><td></td></tr><tr><td>24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>96-well Clear Flat Bottom 폴리스티렌 TC-treated Microplates</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>96웰 투명 원형 바닥 TC 처리된 마이크로플레이트</td><td>Corning</td><td>3799</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9 및 대식세포 및 t 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

Gene Knock-in by CRISPR/Cas9 and Cell Sorting in Macrophage and T Cell Lines

면역 계통의 기능적인 유전체학 연구 결과는 표적 유전자의 삭제 및 관심있는 단백질에 요소의 추가를 둘 다 관련시키는 유전 조작을 요구합니다. 세포주 모형에 있는 유전자 기능의 확인은 세포 본질적인 기계장치의 유전자 발견 그리고 탐구를 위해 중요합니다. 그러나 CRISPR/Cas9 매개 노크인을 사용하여 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포의 유전자 조작은 특히 정지 상태에서 이러한 세포의 낮은 경질 효율 때문에 어렵습니다. 면역 세포에서 유전자를 수정하기 위해 약물 내성 선택 및 바이러스 벡터는 전형적으로 CRIPSR/Cas9 시스템을 발현하는 세포를 보강하는 데 사용되며, 이는 필연적으로 세포의 바람직하지 않은 개입을 초래합니다. 이전 연구에서는 전기기화 후 일시적으로 표현된 CRISPR/Cas9에 결합된 이중 형광 기자를 설계했습니다. 이 기술적인 해결책은 면역 세포에 있는 급속한 유전자 삭제로 이끌어 냅니다; 그러나, 약물 내성 선택 또는 바이러스 벡터를 사용하지 않고 T 세포 및 대식세포와 같은 면역 세포에서 유전자 노크인은 더욱 도전적이다. 본 기사에서는, 당사는 세포 선별을 사용하여 기증자 플라스미드와 함께 Rosa26 궤적을 대상으로 CRISPR/Cas9 구조를 과도하게 표현하는 세포의 선택을 지원함으로써, 유전자 노크-인은 약물 저항 농축 없이 T 세포 및 대식세포 모두에서 달성될 수 있다는 것을 보여준다. 예를 들어, 우리는 인간 ACE2를 발현하는 방법을 보여줍니다, SARS-Cov-2의 수용체, 이는 현재 Covid-19 전염병에 대한 책임이, RAW264.7 대식세포에서 노크 -인 실험을 수행하여. 이러한 유전자 노크 세포는 기계학 연구에 널리 사용될 수 있다.

murine RAW264.7 대식세포를 사용하여 mRosa26 궤적에서 노크-인 실험을 수행하기 위해 전술한 프로토콜에 따라, SARS-Cov-2바이러스(도 2A)의수용체인 인간 ACE2를 발현하기 위한 표적 벡터를 설계하였다. 유사한 설계를 사용하여, 우리는 OST 태그 RASGRP1 융합 단백질(도 2C)의노크인인간 Jurkat T 세포를 생성했다. 3개의 플라스미드의 전환 후, 그 중 2개는 CRISPR/Cas9(DsRed2; pDsR-mR26-sg1 및 pDsR-mR26-sg2용 mRosa26-sg2)의 발현에 사용되었다. hROSA26 노크인을 위한 pDsR-hR26-sg1 및 pDsR-hR26-sg2및 상동성 재조합(EBFP2)을 위한 DNA 템플릿으로 사용되는 또 다른 원소, 두 개의 형광 기자를 발현하는 이중 양성 세포가 96웰 플레이트로 분류되었다. 단일 셀 ...

이 프로토콜은 형광 기자 및 세포 분류를 사용하여 대식세포 및 T 세포주에서 노크-인 실험을 단순화합니다. 2개의 플라스미드는 면역 세포에 있는 Rosa26 메뚜기에서 영구적으로 통합되는 EBFP2를 표현하는 EBFP2를 표현하는 상동성 재조합 기증자 플라스미드와 CRISPR/Cas9- 및 DsRed2 표현 플라스미드와 균등하게 재조합 기증자 플라스미드인 이러한 단순화된 노크-인 실험에 사용됩니다.

CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

Functional genomics studies of the immune system require genetic manipulations that involve both deletion of target genes and addition of elements to ...

이 프로토콜의 목표는 형광 기자의 도움으로 대식세포 및 T 세포주에서 CRISPR/Cas9 매개 노크-인 실험을 단순화하고 세포 분류에 영향을 미치는 것입니다. ROSA26 로커스는 게놈의 삽입을 위한 유전체 안전 항구 사이트로 알려져 있습니다. 26개의 궤적 또는 인간 직교 로그에 대한 마우스 세계 또는 공격 없이 관심 있는 단백질을 표현하는 것이 보통입니다.Part 1: 디자인 및 SgRNAs의 플라스미드 건설로 로사26 로커스를 타겟팅합니다. 먼저 마우스 Rosa26 궤적으로부터 sgRNAs를 설계하고 마우스 게놈 정보학 및 앙상블 게놈 브라우저의 서열을 사용하여 마우스 Rosa26 유전자의 게놈 서열을 다운로드합니다. 온라인 웹 도구인 CRISPOR로 이동하여 Rosa26 Locus의 입력 시퀀스 100쌍을 붙여넣습니다.그런 다음 게놈을 선택, 예를 들어, 머스 근육 마우스 참조 게놈 2011. 다음으로, PAM의 유형을 선택합니다.제출을 클릭합니다. 높은 특이성 점수, 높은 수행 점수, 적은 오프 대상가이드를 선택합니다. 비효율적인 것으로 표시된 가이드는 피해야 합니다.특히, 중복 시퀀스를 가진 두 개의 가이드를 선택하는 것이 바람직하며, 이는 보고된 대로 노크인 효율을 높일 수 있습니다. 따뜻한 식사 순서를 위해, 앞으로 불법 및 반전 불법 합성, 인과 요인에 복제에 대 한 준비. 발액사당 선형화된 감소를 준비하여, 닐을 얻는 것과 같이 BBS 1회 소화에 의해 리포터를 해야 하며, 최종 구조를 생성하는 선형 벡터에 대한 법적, 즉 가이드 RNA와 DSRIP 2개의 형광 리포터와 연결된 CAS 9핵을 동시에 표현한다.2부:대상 벡터를 동종 재조합 템플릿으로 구성합니다. 관심 있는 단백질의 발현을 위해. 예를 들어, 인간은 계속되었습니다.상용 소스 및 친화성 OST 태그 또는 다른 일반적으로 사용되는 공격으로 cDNA 서열을 합성할 수 있으며, 단백질의 정제를 위한 다른 일반적으로 사용되는 공격은 cDNA 서열에 융합될 수 있다. cDNA가 시작되기 전에 카자크 합의 서열을 포함해야 합니다. Asc1 제한 효소에 의해 소화되고, CD와 삽입을 백본에 넣는 것과 같습니다.Vactor, 즉 pKhR26-IBFP IBP는 최종 타겟팅을 산출하여 컨테이너, 각각 5개의 프라임 및 3개의 프라임 동상무기의 KB를 농축합니다. 표현 캐스트 세트에는 VFD 리포터와 폴리 AC 펀드의 경우 Iis에 연결된 Kooni

gene-knock-crisprcas9-cell-sorting-macrophage-t-cell

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오에서는 Cas9 및 sgRNA가 세포에 단일 플라스미드 구조로 제공되는 배양 세포에서 올인원 CRISPR-Cas9 기반 게놈 편집을 시연합니다. CRISPR-Cas9 시스템과 삽입하고자 하는 유전자는 전기천공법을 통해 세포에 도입되어 성공적인 유전자 편집을 가능하게 했습니다.

All-in-one CRISPR 게놈 편집: CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 배양된 세포에서 상동성 유도 복구 기반 유전자 knock-in 방법

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체세포를 유 전적으로 조작하는 능력의 최근 진보는 기본 및 응용 연구에 큰 가능성을 안겨줍니다. 여기, 우리는 선택 마커의 사용 여부에 관계없이 포유류 세포주에서 CRISP / Cas9 생성 녹아웃 생산 및 스크리닝을위한 두 가지 접근법을 제시한다.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

타겟된 유전자 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 편집 크게 유전자의 생물 학적 기능에 대 한 이해를 촉진 했다. 여기, 우리가 그들의 종양 활동을 공부 하기 위하여 모델 calreticulin 돌연변이 cytokine 종속 조 혈 모 세포에서에 CRISPR/Cas9 방법론을 활용 합니다.

CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 돌연변이 Calreticulin Cytokine 종속 조 혈 모 세포에서의 종양 활동을 조사 하기 위해 편집

CRISPR-Cas는 식물과 동물의 복잡 한 유전자를 강력한 기술. 여기, 우리는 효율적으로 다른 Cas endonucleases를 사용 하 여 인간 게놈을 편집 하려면 프로토콜 선발. 우리는 중요 한 고려 사항 및 설계 매개 변수 편집 효율 최적화를 강조 표시 합니다.

포유류 세포 라인 CRISPR Cas를 사용 하 여 게놈 편집

이 프로토콜은 단일 실험 내에서 35kb만큼 큰 고유한 miRNA 클러스터 부재 결실 조합을 운반하는 유전자 변형 세포주 패널의 신속한 생성을 가능하게 하는 마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 고처리량 클러스터 규칙적인 간격 간 짧은 팰린드로믹 반복(CRISPR) 유전자 편집 워크플로우를 기술합니다.

마이크로RNA 클러스터 네트워크 분석을 위한 CRISPR 유전자 편집 도구

이 프로토콜은 시험관내에서 조립되고 전기천공법으로 전달되는 Cas9-sgRNA 리보핵단백질 복합체를 사용하여 마우스 골수 유래 대식세포에서 게놈 편집 절차를 설명합니다.

전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 일차 골수 유래 대식세포의 고효율 유전자 파괴

CRISPR 관련 프로토콜이 점점 더 유용해지고 접근성이 높아짐에 따라 특정 실험 조건에서 복잡성과 장애물이 여전히 발생할 수 있습니다. 이 프로토콜은 CRISPR/Cas9을 사용하여 수용체 상호 작용 세린/트레오닌-단백질 키나아제 1(RIPK1/RIP1) 녹아웃 인간 세포주를 생성하는 방법을 간략하게 설명하고 이 과정에서 직면할 수 있는 잠재적인 문제를 강조합니다.

CRISPR-Cas9 시스템을 사용한 RIP1 Knockout U937 세포주 생성

THP-1 세포주는 다양한 생물학 관련 연구 분야에서 인간 단핵구/대식세포의 기능을 조사하기 위한 모델로 널리 사용됩니다. 이 논문에서는 효율적인 CRISPR-Cas9 기반 엔지니어링 및 단일 세포 클론 분리를 위한 프로토콜에 대해 설명하여 강력하고 재현 가능한 표현형 데이터를 생성할 수 있습니다.

THP-1 세포의 전기천공법 기반 CRISPR-Cas9 매개 유전자 녹아웃 및 단일 세포 클론 분리

배우세요 CRISPR/Cas9 유전자 노크인 방법을 대식세포 및 T 세포주에서 형광 리포터와 세포 분류를 이용해 적용하는 법을. 약물 내성 선택 없이 Rosa26 유전자좌에 효율적으로 유전자를 삽입하여 면역세포 기능 유전체 연구에 활용할 수 있습니다.

CRISPR/Cas9 및 대식세포 및 T 세포주에서 세포 분류에 의한 유전자 노크인

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