Name: 리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (DRaCALA) (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 배우세요 DRaCALA 기법으로 Escherichia coli에서 (p)ppGpp 결합 단백질을 신속하게 식별하는 방법. 이 고감도 스크리닝 기술은 세균 신호 전달 및 생리학 연구에 활용됩니다.

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이 작품은 NNF 프로젝트 보조금(NNF19OC00058331)이 YEZ에 지원하고, MLS에 마리 Skłodowska-Curie 보조금 계약 (Nº 801199)에 따라 유럽 연합의 호라이즌 2020 연구 및 혁신 프로그램에 의해 지원됩니다.
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62331/62331img1.jpg">

1. 전체 세포 리스의 준비
<ol><li>대장균 K-12 ASKA ORFeome 컬렉션 균주15 에 1.5 mL 리소제니 국물 (LB) 포함 25 μg/mL 클로람페니콜 96 잘 깊은 우물 플레이트. 160 rpm에서 흔들리면 30 °C에서 18 시간 동안 하룻밤 (O / N)으로 성장하십시오. 다음 날, O/N 배양에 이소프로필 β-d-1-티오갈라크토피라노사이드(최종 0.5mMMM)를 첨가하여 단백질 발현을 6시간 동안 30°C로 유도한다.</li>
	<li>펠릿 셀은 500 x g에서 10 분 동안. 사용 전까지 -80°C에서 펠릿을 얼리면 됩니다. 세포를 용해하려면, 용해 버퍼 L1 (40 mM Tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2,2 mM 페닐메틸술포닐 불소 (PMSF), 40 μg /mL DNase 1, 및 0.5 mgmel을 추가하십시오.</li>
	<li>세포를 -80°C에서 30분 동안 동결한 다음 37°C에서 20분 동안 해동합니다. 이 주기를 세 번 반복하여 셀을 lyse합니다. 사용하기 전에 -80 °C에 lysates를 저장합니다.</li>
</ol>2. 렐세크와 GppA의 정화
참고: 대장균 K-12의 연쇄상구균 과키시닐리스및 GppA의 재조합 단백질 Relseq는 각각 방사성 표지ppp와 ppGpp를 합성하는 데 사용됩니다.
<ol><li>성장하고 각 단백질을 과발 현현하는 세포를 수집합니다.<ol>
<li>LB 국물에 대장균 BL21 DE3 균주를 최대 기하급수적 단계(광학 밀도(OD)~0.3-0.4)까지 늘리고, 5분 동안 6000 x g에서 1mL의 배양을 회전시한다. 상체를 데수제, 얼음-차가운 TSB 국물의 100 μL로 세포를 다시 중단 (LB 국물은 0.1 g / mL PEG3350, 0.05 mL / mL 디메틸술프리산화물, 20 mM MgCl2로보충).</li>
		<li>히스티딘 태그가 달린 릴세크와 gppA를베어링 플라스미드를 각각 100 ng, TSB의 위의 세포 현탁액과 혼합하고 30 분 동안 얼음에 배양하십시오. 40s에 대해 42°C에서 세포를 열 충격. 혼합물을 2분 동안 얼음위에 놓고, 실온에 1mL의 LB 국물을 추가하여 세포가 160 rpm에서 교반하여 37°C에서 1시간 동안 회복될 수 있도록 합니다.</li>
		<li>해당 항생제로 보충된 LB 한천 플레이트상에서 회수된 세포를 플레이트(Relseq:100 μg/mL 암피실린; GppA: 30 μg/mL 카나마이신). 다음 날, LB 국물에 있는 식민지를 접종하여 37°C에서 두 균주의 O/N 프리컬쳐를 시작합니다.</li>
		<li>18h 후, O/N 배양 및 해당 항생제의 10mL를 가진 LB 배지의 500mL를 접종하였다. 37 °C에서 160 rpm에서 흔들어 배양을 성장시다. OD600nm이 0.5-0.7에 도달하면 0.5mM IPTG를 추가하고 160 rpm에서 흔들림으로 30°C에서 3시간 동안 성장하여 단백질 발현을 유도한다.</li>
		<li>4°C에서 10분 동안 6084 x g로 회전하여 세포를 수집합니다. 4°C에서 20분 동안 20mL의 얼음-감기 1x 인산염 완충식식염(PBS)으로 펠릿을 재중단하고, 1912x g에서 재원심분리기에서 4°C에서 20분 동안 재원심분리기를 재차중단한다. 상류제를 데칭하고, 사용하기 전에 -20°C에서 펠릿을 동결한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>니켈-니트리로트리아세산(Ni-NTA) 친화성 정화 참고: 이 시점부터 샘플이 차가운지 확인합니다.<ol>
<li>얼음 냉기 용해 버퍼 L2 (50 mM Tris pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 % 글리세롤, 10 mM 이미다졸레, β 프로테아제 억제제 (EDTA 프리 태블릿; 재료의 표 참조)를추가하여 펠릿을 다시 일시 중단합니다. 초음파 처리를 통해 세포를 lyse (60% 진폭, 2 s ON / 4 S OFF 8 분 ON). 4°C에서 40분 동안 23,426 x g에서 회전하여 용액을 지우고, 정화를 위한 상퍼로 계속한다.</li>
		<li>위의 원심 분리 중에 Ni-NTA 수지를 준비하십시오.<ol>
<li>균질화된 Ni-NTA 수지 500μL을 서있는 폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼으로 옮기고 15분 동안 정착하고 저장 용액이 배출됩니다. 수지 15mL의 초순수를 두 번 세척한 다음, 리시스 버퍼 L2의 15mL로 컬럼을 세척한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>클리어된 셀 리셀러트(supersate)를 1단계에서 열에 로드하고 통과하게 합니다. 30mL의 세탁 버퍼(50m Tris pH 7.5, 150m NaCl, 5% 글리세롤, 20m imidazole)로 컬럼을 세척합니다.</li>
		<li>용출 완충제400μL(50m Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 5% 글리세롤, 500mM imidazole)로 단백질을 3회 엘ute하였다. 그런 다음 용출 버퍼의 또 다른 300 μL으로 용출을 반복합니다. 용출된 단백질을 700 μL의 최종 부피에 결합합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>젤 여과<ol>
<li>젤 여과 버퍼 (50 mM Tris, pH 7.5; 200 mM NaCl; 5 % 글리세롤)를 준비하십시오. 크기 배제 열을 젤 여과 버퍼의 하나의 열 부피(25 mL)로 세척합니다.</li>
		<li>위의 700 μL 샘플을 500 μL 루프를 사용하여 로드하고 0.5 mL/min에서 실행하고 각각 0.5 mL 부피의 2-3 분획을 수집하여 각각 단백질을 함유합니다.</li>
		<li>스핀 컬럼을 사용하여 각 단백질을 함유하는 분획을 결합하고 농축하고, 브래드포드 분석시를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 32P 라벨 pppGpp 및 ppGpp의 합성
<ol><li>나사 캡 튜브에 작은 규모의 Relseq 반응을 조립합니다(표 1참조). 참고: 허가된 장소와 개인 보호 장비에서만 방사성 시약으로 작업하십시오.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td colspan="2">부피(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>작은 규모</td>
			<td>대규모</td>
		</tr>
<tr>
<td>초순수</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Relseq 버퍼*</td>
			<td>2</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>ATP (8mM 결승)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>릴세크 (4 μ M 결승) </td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>
32 P-α-구아노신 트리호스페이트 (GTP) (최종 120 nM) (주의)</td>
			<td>0.2</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>합계</td>
			<td>20</td>
			<td>500</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 32P-labeled pppGpp의 소규모 및 대규모 합성 반응에 대한 정보를 조립합니다. * 10x Relseq 버퍼에는 250mM Tris-HCl, pH 8.6이 포함되어 있습니다. 1M NaCl; 80 mM MgCl2. 약어: pppGpp = 구아노신 펜타포스페이트.
<ol start="2"><li>1 시간 동안 열믹서에서 37 °C에서 튜브를 배양 한 다음 95 °C에서 5 분 동안 얼음위에 놓고 5 분 동안 얼음위에 놓습니다. 침전된 단백질을 15,700 x g에서 5분 동안 스핀다운하고, 새로운 스크류 캡 튜브로 수퍼내트(syntheed 32P-pppGpp)를 전달합니다.</li>
	<li>32P-pppGpp에서 32P-ppGpp를 합성하려면 32p-pppGpp 제품의 절반을 새로운 스크류 캡 튜브로 옮기고 1 μM GppA를 추가합니다. 튜브를 37°C에서 10분 동안, 95°C에서 5분 동안 배양한 다음 얼음 위에 5분 동안 놓습니다.</li>
	<li>침전 된 단백질을 15,700 x g에서 5 분 동안 회전시키고 수퍼나티 (합성 32P-ppGpp)를 새로운 스크류 캡 튜브로 옮긴다.</li>
	<li>1.5M KH 2 PO4,pH 3.4를 사용하여 얇은 층 크로마토그래피(TLC) 플레이트(polyethyleneimine-변형 셀룰로오스 TLC 플레이트)에서 샘플의 1μl을 실행하여 32P-pppGpp 및 32P-ppGpp를 분석한다. 참고:α-32P-라벨 구아노신 5'-triphosphate(32P-α-GTP)를 제어로 사용하십시오.</li>
	<li>TLC 플레이트를 완전히 건조하고 투명 플라스틱 폴더 사이에 놓고 5 분 동안 저장 인광판 화면에 노출하십시오. 인산화증을 사용하여 신호를 시각화하고 정량화합니다. 참고: 32P-pppGpp 및 32P-ppGpp의 비율이 85% 이상이면, 대형 반응(500 μL, 20 96웰 플레이트 스크리닝에 충분함)을 표 1을사용하여 조립및 합성할 수 있다.</li>
</ol>4. DRaCALA (p)ppGpp의 표적 단백질의 검열
<ol><li>전체 셀의 20 μL을 96웰 V-바닥 마이크로티터 플레이트로 해동 및 이송합니다. 세라티아 마르케센에서2.5 U/웰의 엔도누테스를 추가하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 용액 점도를 줄입니다. 20분 동안 얼음 위에 용사를 놓습니다.</li>
	<li>32P-pppGpp 및 32P-ppGpp를 1:1 비율로 혼합하고 1x 용해 버퍼 L1을 추가하여 (p)ppGpp의 최종 농도를 4 nM에 동일하게 만듭니다. 참고: pppGpp와 ppGpp 사이의 화학적 유사성을 감안할 때, 두 화학 물질의 혼합은 선별 과정을 단순화합니다.</li>
	<li>멀티채널 파이펫과 필터링된 파이펫 팁을 사용하여 (p) ppGpp 혼합물의 10 μL을 셀 리세테와 추가하여 혼합합니다. 실온(RT)에서 5분 동안 배양합니다.</li>
	<li>96 x 핀 공구를 30s용 비이온 세제용 0.01% 용액으로 넣고 30s의 티슈 페이퍼에 건조시하십시오. 핀 공구3배의 세척을 반복합니다.</li>
	<li>위의 96웰 샘플 플레이트에 핀 도구를 놓고 30s를 기다립니다. 핀 도구를 똑바로 들어 올리고 30s의 니트로셀룰로오스 멤브레인에 똑바로 놓습니다. 참고: 스팟이 없는 경우 파이펫과 필터링된 팁이 있는 해당 샘플의 2 μL을 발견합니다. 아래에 표시된 것과 동일한 샘플의 중복 지점을 만드는 것이 좋습니다.</li>
	<li>RT에서 멤브레인을 5분 동안 건조시킵니다. 인산화증을 사용하여 시각화합니다.</li>
</ol>5. 잠재적인 표적 단백질의 정량화 및 식별
<ol><li>인산화기와 관련된 분석 소프트웨어를 사용하여 시각화된 플레이트의 .gel 파일을 엽니다. 배열 분석 함수를 사용하여 12개의 열 x 8열의 그리드를 설정하여 96개의 스팟을 정의합니다.</li>
	<li>큰 원을 정의하여 전체 반점의 바깥쪽 가장자리를 돌례합니다(그림 1B참조). 정의된 큰 원의 볼륨 +배경 및 영역을 내보내고 스프레드시트에 저장합니다. 참고: 필요한 경우 각 개별 원을 재배치하여 반점과 완벽하게 겹치고 각 개별 원을 조정하여 실제 스팟보다 약간 더 크게 만듭니다.</li>
	<li>정의된 원을 아래로 크기로 조정하여 작은 내부 점을 돌례합니다. Volumn+Background및 정의된 작은 원의 영역을 내보내고 스프레드시트에 저장합니다.</li>
	<li>도 1B의방정식을 사용하여 스프레드시트의 바인딩 분수를 계산하고 데이터를 플롯합니다. 다른 우물의 대다수에 비해 높은 결합 분수를 보여주는 우물에서 잠재적인 결합 단백질을 확인합니다.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig02.jpg"> 그림 2: DRaCALA 심사 프로세스의 전체 워크플로우. 에체리치아 대장균 ASKA 수집으로부터단백질 생산이 유도되고, 세포가 리세이드된다. 한편, 재조합 단백질 Relseq-His와 GppA-His는 32P-α-GTP에서 32P 라벨 pppGpp 및 ppGpp를 합성하는 데 사용됩니다. 방사성 표지(p)ppGpp 분자는 용액과 혼합된 다음, 96핀 툴이 질소셀룰로오스 막에 혼합물을 발견하여 인광저장 스크린, 이미징 및 방사성 신호의 정량화를 위해 사용된다. 약어: DRaCALA = 리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용; (p)ppGpp = 구아노신 펜타 및 테트라포산염; RT = 실온; IPTG = 이소프로필 β-d-1-티오갈라크토피라노사이드; GTP = 구아노신 5'-triphosphate; SDS-PAGE = 나트륨 도데킬설페이트-폴리아크라이알라미드 젤 전기포고증; TLC = 얇은 층 크로마토그래피. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol><li>Kalia, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleotide%2C+c-di-GMP%2C+c-di-AMP%2C+cGMP%2C+cAMP%2C+%28p%29ppGpp+signaling+in+bacteria+and+implications+in+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Society+Reviews%22%5BJournal%5D)">Nucleotide, c-di-GMP, c-di-AMP, cGMP, cAMP, (p)ppGpp signaling in bacteria and implications in pathogenesis.</a> Chemical Society Reviews. 42 (1), 305-341 (2013).</li>
<li>Camilli, A., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+small-molecule+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial small-molecule signaling pathways.</a> Science. 311 (5764), 1113-1116 (2006).</li>
<li>Luo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cAMP+capture+compound+mass+spectrometry+as+a+novel+tool+for+targeting+cAMP-binding+proteins%3A+from+protein+kinase+A+to+potassium%2Fsodium+hyperpolarization-activated+cyclic+nucleotide-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">The cAMP capture compound mass spectrometry as a novel tool for targeting cAMP-binding proteins: from protein kinase A to potassium/sodium hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channels.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 8 (12), 2843-2856 (2009).</li>
<li>Nesper, J., Reinders, A., Glatter, T., Schmidt, A., Jenal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+capture+compound+for+the+identification+and+analysis+of+cyclic+di-GMP+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A novel capture compound for the identification and analysis of cyclic di-GMP binding proteins.</a> Journal of Proteomics. 75 (15), 4874-4878 (2012).</li>
<li>Laventie, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+compound+mass+spectrometry--a+powerful+tool+to+identify+novel+c-di-GMP+effector+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Capture compound mass spectrometry--a powerful tool to identify novel c-di-GMP effector proteins.</a> Journal of Visual Experiments. (97), e51404(2015).</li>
<li>Roelofs, K. G., Wang, J., Sintim, H. O., Lee, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+radial+capillary+action+of+ligand+assay+for+high-throughput+detection+of+protein-metabolite+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15528-15533 (2011).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+adaptation+of+the+essential+tRNA+methyltransferase+TrmD+to+the+signaling+molecule+3+%27%2C5+%27-cAMP+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Evolutionary adaptation of the essential tRNA methyltransferase TrmD to the signaling molecule 3 ',5 '-cAMP in bacteria.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (1), 313-327 (2017).</li>
<li>Corrigan, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+conserved+bacterial+c-di-AMP+receptor+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of conserved bacterial c-di-AMP receptor proteins.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 9084-9089 (2013).</li>
<li>Roelofs, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+cyclic-di-GMP+binding+proteins+in+Vibrio+cholerae+reveals+a+novel+class+of+cyclic-di-GMP-binding+ATPases+associated+with+type+II+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of cyclic-di-GMP binding proteins in Vibrio cholerae reveals a novel class of cyclic-di-GMP-binding ATPases associated with type II secretion systems.</a> PLoS Pathogen. 11 (10), 1005232(2015).</li>
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<li>Corrigan, R. M., Bellows, L. E., Wood, A., Grundling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ppGpp+negatively+impacts+ribosome+assembly+affecting+growth+and+antimicrobial+tolerance+in+Gram-positive+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">ppGpp negatively impacts ribosome assembly affecting growth and antimicrobial tolerance in Gram-positive bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1710-1719 (2016).</li>
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<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nucleotide+pGpp+acts+as+a+third+alarmone+in+Bacillus%2C+with+functions+distinct+from+those+of+%28p%29+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The nucleotide pGpp acts as a third alarmone in Bacillus, with functions distinct from those of (p) ppGpp.</a> Nature Communications. 11 (1), 5388(2020).</li>
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<li>Hochstadt-Ozer, J., Cashel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+purine+utilization+in+bacteria.+V.+Inhibition+of+purine+phosphoribosyltransferase+activities+and+purine+uptake+in+isolated+membrane+vesicles+by+guanosine+tetraphosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of purine utilization in bacteria. V. Inhibition of purine phosphoribosyltransferase activities and purine uptake in isolated membrane vesicles by guanosine tetraphosphate.</a> Journal of Biological Chemistry. 247 (21), 7067-7072 (1972).</li>
<li>Zhang, Y. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p%29ppGpp+regulates+a+bacterial+nucleosidase+by+an+allosteric+two-domain+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">p)ppGpp regulates a bacterial nucleosidase by an allosteric two-domain switch.</a> Molecular Cell. 74 (6), 1239-1249 (2019).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+capture+and+identification+of+protein+effectors+of+the+growth+regulator+ppGpp%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Affinity-based capture and identification of protein effectors of the growth regulator ppGpp.</a> Nature Chemical Biology. 15 (2), 141-150 (2019).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해상충이 없습니다.

DRaCALA 스크리닝을 수행하는 중요한 단계 중 하나는 좋은 전체 세포 리스를 얻는 것입니다. 첫째, 테스트된 단백질은 다량과 수용성 형태로 생산되어야 합니다. 둘째, 세포의 용해가 완료되어야하며, 용물의 점도는 최소화해야합니다. 리소지메의 포함과 동결 해동의 세 주기의 사용은 종종 완전히 세포를 lyse 충분하다. 그러나, 방출된 염색체 DNA는 용액점성 및 높은 배경 결합 신호를 생성하여 도 3B,C에도시된 바와 같이 거짓 긍정의 결과로 생성된다. 이를 완화하기 위해, S. 마르세센의 DNase 1 및/또는 엔도누리스를 사용할 수 있으며, 샘플을 DNA를 저하시키기 위해 더 오랜 시간 동안 배양될 수 있다.
음수(빈 플라스미드 벡터) 및 양성(공지된 표적 단백질) 대조군모두 대규모 스크리닝을 수행하기 전에 전체 세포 용해 제제 및 DRaCALA 결합 분석의 조건을 최적화하기 ...

박테리아는 끊임없이 변화하는 환경에 적응하기 위해 여러 개의 작은 신호 분자를 사용1,2. 예를 들어, 자가유도기, N-아실모케린 락톤 및 수정된 올리고펩티드, 박테리아 간의 세포간 통신을 중재하여 인구 거동, 쿼럼 센싱2로알려진 현상을 조정한다. 작은 신호 분자의 또 다른 그룹은 널리 연구 된 순환 아데노신 모노 포스 페이트 (cAMP), 순환 디-AMP, 순환 디 구아노신 모노 인산염 (순환 디-GMP), 및 구아노신 펜타 및 테트라 인산염(ppp)을 포함하여 NSM입니다. 박테리아는 다양한 스트레스 조건에 대한 응답으로 이러한 NSM을 생산합니다. 일단 생성되면, 이 분자는 그들의 표적 단백질에 결합하고 만나는 응고에 대처하고 세균성 생존을 강화하기 위하여 몇몇 다른 생리적이고 신진 대사 통로를 조절합니다. 따라서, 표적 단백질의 식별은 이 작은 분자의 분자 기능을 해독하기 위한 피할 수 없는 전제 조건이다.
지난 10 년은 이 작은 분자의 표적 단백질을 공개한 몇몇 기술 혁신 때문에 주로 이 작은 신호 분자의 지식의 붐을 목격했습니다. 이들 로는 이 논문에서 논의될 리간 분석(DRaCALA)6의 포획 화합물 기술3,4,5,및 차동 방사형 모세관 작용을 포함한다.
2011년6년빈센트 리와 동료들이 발명한 DRaCALA는 니트로셀룰로오스 막의 능력을 차별화적으로 분리하여 무료 및 단백질 바운드 리간드에 배치합니다. 단백질과 같은 분자는 니트로셀룰로오스 막에서 확산될 수 없으며, NSM과 같은 작은 리간드는 확산될 수 있습니다. NSM(예를들어,ppGpp)을 시험할 단백질과 혼합하여 멤브레인에서 이를 발견하면 2가지 시나리오를 기대할 수있습니다(그림 1):(p)ppGpp가 단백질에 결합하면, 방사성 라벨(p)ppGpp는 단백질에 의해 그 자리의 중앙에 유지되고, 강렬한 작은 점(i.i.) 강한 방사성 신호) 인산화증하에서. 그러나(p)ppGpp가 단백질에 결합하지 않으면, 균일한 배경 방사성 신호로 큰 지점을 생성하기 위해 자유롭게 바깥쪽으로 확산된다.
더욱이, DRaCALA는 단백질이 충분한 양으로 존재하는 경우에 전체 세포 용액에 있는 작은 분자와 불정제 단백질 사이 상호 작용을 검출할 수 있습니다. 이러한 단순성으로 ORFeome 발현 라이브러리를 사용하여 단백질 표적을 빠르게 식별할 수 있는 DRaCALA를 사용할 수 있습니다. 실제로, cAMP7,순환 디-암8,순환 디-GMP9,10,및 (p)ppGpp11,12,13의 표적 단백질은 DRaCALA를 사용하여 체계적으로 확인되었다. 이 비디오 문서에서는 (p) ppGpp를 예로 사용하여 성공적인 DRaCALA 스크리닝을 수행하는 데 중요한 단계와 고려 사항을 설명하고 설명합니다. 참고, DRaCALA의 더 철저한 설명14 는 DRaCALA를 수행 하기 전에이 문서와 함께 읽는 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62331/62331fig01.jpg"> 그림 1: DRaCALA의 원리. (A)DRaCALA 분석의 회로도. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. (B)바인딩 분획의 정량화 및 계산. 자세한 내용은 텍스트를 참조하십시오. 간단히, DRaCALA 반점은 전체 반점과 내부 다크닷(즉,테스트된 단백질의 결합으로 인해 유지된(p)ppGpp를 둘레에 두 개의 원을 그려 분석될 것이다. 특이적 결합 신호는 비특이적 배경 신호(A1 ×(S 2-S 1)/(A2-A1)에의해계산된)를 빼낸 후 내부 원(S1)의 방사성 신호이다. 결합 분획은 총 방사성 신호(S2)로 나눈 특정 결합 신호이다. 약어: DRaCALA = 리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용; (p)ppGpp = 구아노신 펜타 및 테트라포산염; RT = 실온. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62331/62331fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>32P-&alpha;-GTP</td><td>Perkinelmer</td><td>BLU006X250UC</td><td></td></tr><tr><td>96 x 핀 도구</td><td>V& P Scientific</td><td>VP 404</td><td>96 볼트 리플리케이터, 9mm 센터, 4.2mm 볼트 직경, 24mm 길이</td></tr><tr><td>96웰 V-하단 마이크로타이터 플레이트</td><td>Sterilin</td><td>MIC9004</td><td>Sterilin Microplate V Well 611V96</td></tr><tr><td>Agar</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>LP0011</td><td>Agar no. 1</td></tr><tr><td>ASKA collection strain</td><td>NBRP, SHIGEN, 일본</td><td></td><td>참조: DNA Research, Volume 12, Issue 5, 2005, pages 291&ndash;299. https://doi.org/10.1093/dnares/dsi012</td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>SIGMA</td><td>E1014-25KU</td><td>유전자 조작 엔도뉴클레아제 Serratia marcescens</td></tr><tr><td>Bradford 단백질 분석 염료</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td>시약 농축</td></tr>액 <tr><td>DMSO</td><td>SIGMA</td><td>D8418</td><td>&ge; 99.9%</td></tr><tr><td>DNase 1</td><td>SIGMA</td><td>DN25-1G</td><td></td></tr><tr><td>겔 여과10x300 컬럼</td><td>GE 헬스케어</td><td>28990944</td>는 <td>방부제로 20% 에탄올을 함유</td></tr>합니다. <tr><td></td><td>PanReac AppliChem</td><td>122329.1214</td><td>분석용 글리세롤 87%</td></tr><tr><td>Hypercassette</td><td>Amersham</td><td>RPN 11647</td><td>20 x 40 cm</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>SIGMA</td><td>56750</td><td>puriss. p.a., &지; 99.5% (GC)</td></tr><tr><td>IP 스토리지 형광체 스크린</td><td>FUJIFILM</td><td>28956474</td><td>BAS-MS 2040 20x 40 cm</td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-d-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)</td><td>SIGMA</td><td>I6758</td><td>이소프로필 &베타;-D-티오갈락토시드</td></tr><tr><td>용해성 육수 (LB)</td><td>Invitrogen - Thermo Fisher</td><td>12795027</td><td>Miller's LB Broth Base</td></tr><tr><td>Lysozyme</td><td>SIGMA</td><td>L4949</td><td>닭고기 달걀 흰자위에서; BioUltra, 동결건조 분말, &ge; 98%</td></tr><tr><td>MgCl2 (염화마그네슘)</td><td>SIGMA</td><td>208337</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ 물</td><td></td><td></td><td>초순수</td></tr><tr><td>멀티채널 피펫</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661110</td><td>F1 - 클립 팁; 1-10 ul, 8 x 채널</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals</td><td>27810</td><td>AnalaR NORMAPUR, ACS, Reag. Ph. Eur.</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30230</td><td></td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 블로팅 멤브레인</td><td>Amersham Protran</td><td>10600003</td><td>Premium 0.45 um 300 mm x 4 m</td></tr><tr><td>PBS</td><td>OXOID - Thermo Fisher</td><td>BR0014G</td><td>Phosphate 완충 식염수(Dulbecco A), 정제</td></tr><tr><td>PEG3350(폴리에틸렌 글리콜 3350)</td><td>SIGMA</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>페닐메틸설포닐 플루오라이드(PMSF)</td><td>SIGMA</td><td>93482</td><td>페닐메탄설포닐 플루오라이드 용액 - 에탄올 (T)의 0.1 M</td></tr> <tr><td>형광체 이미저</td><td>GE Healthcare</td><td>28955809</td><td>Typhoon FLA-7000 형광체 이미저</td></tr><tr><td>피펫 팁, 여과된</td><td>Thermo Scientific</td><td>94410040</td><td>ClipTip 12.5 &mu; l 비멸균</td></tr><tr><td>Poly-Prep 크로마토그래피 컬럼</td><td>Bio-Rad</td><td>7311550</td><td>폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼</td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 Mini</td><td>Pierce</td><td>A32955</td><td>정제, EDTA 무료</td></tr><tr><td>스크류 캡 튜브</td><td>Thermo Scientific</td><td>3488</td><td>Microcentifuge Tubes, 나사 캡 포함 2.0 ml, 비멸균</td></tr><tr><td>SLS 96-deep Well plates</td><td>Greiner</td><td>780285</td><td>MASTERBLOCK, 2 ML, PP, V-Bottom, 천연</td></tr><tr><td>스핀 컬럼</td><td>Millipore</td><td>UFC500396</td><td>Amicon Ultra -0.5 ml 원심 필터</td></tr><tr><td>써모믹서</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>써모믹서 C</td></tr><tr><td>TLC 플레이트(PEI-셀룰로오스 F TLC 플레이트)</td><td>Merck Millipore</td><td>105579</td><td>DC PEI-셀룰로오스 F(20 x 20 cm)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>SIGMA</td><td>BP152</td><td>분자생물학용 Tris 베이스</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>SIGMA</td><td>P1379</td><td>점성 비이온 세제</td></tr><tr><td>&베타;-메르캅토에탄올</td><td>SIGMA</td><td>M3148</td><td>99% (GC/적정)</td></tr></tbody></table>

리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (dracala)

Identifying the Binding Proteins of Small Ligands with the Differential Radial Capillary Action of Ligand Assay (DRaCALA)

지난 10 년 세균성 생리학에 있는 작은 신호 분자의 이해에 있는 엄청난 진전을 보았습니다. 특히, 여러 뉴클레오티드 유래 이차 메신저(NSM)의 표적 단백질은 모델 유기체에서 체계적으로 확인되고 연구되었다. 이러한 성과는 주로 이러한 소분자의 표적 단백질을 체계적으로 식별하는 데 사용되었던 리간드 분석시(DRaCALA)의 포획 화합물 기술과 차동 적대모세 혈관 작용을 포함한 몇 가지 새로운 기술의 개발 때문입니다. 이 논문은 DRaCALA 기술의 예 및 비디오 데모로 NSM, 과노신 펜타 및 테트라포산염(p)ppGpp의 사용을 설명합니다. DRaCALA를 사용하여, 20명 중 9개 및 12개의 새로운 표적 단백질(p)ppGpp가 모델 유기체, 대장균 K-12에서 확인되었으며, 이 분석의 힘을 입증하였다. 원칙적으로, DRaCALA는 방사성 동위원소 또는 형광 염료에 의해 표시될 수 있는 작은 리간드를 공부하기 위하여 이용될 수 있었습니다. DRaCALA의 중요한 단계, 장단점 및 단점은 이 기술을 추가로 적용하기 위해 여기에서 논의됩니다.

전술한 프로토콜에 따라 일반적으로 두 가지 유형의 결과를 산출한다(그림3).
도 3A는 대부분의 우물에서 상대적으로 낮은 배경 바인딩 신호(바인딩 분획 &lt; 0.025)를 가진 플레이트를 나타낸다. 웰 H3의 양수 결합 신호는 다른 우물에서 관찰된 것보다 훨씬 높은 ~0.35의 결합 분획을 제공합니다. 정량화없이도, 잘 H3는 놀라운, 잘 H3에서 발현 된 대상 단백질pppGpp에 바인딩 제안, ppGpp, 또는 둘 다. 실제로, 잘 H3에서 과발현된 단백질은 (p)ppGpp12,16을결합하는 것으로 알려진 저산소산틴 인지질 전달성 Hpt이다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="...

리간드 분석(DRaCALA)의 차동 적개 모세관 작용은 ORFeome 라이브러리를 사용하여 유기체의 작은 리간 결합 단백질을 식별하는 데 사용될 수 있다.

리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (DRaCALA)

The past decade has seen tremendous progress in the understanding of small signaling molecules in bacterial physiology. In particular, the target proteins ...

작은 신호 분자는 세균성 독성 및 인간 생물학을 통제하기 위하여 각종 이펙터 단백질을 표적으로 합니다. 그러나, 이 효력제 단백질은 확인하기 어렵습니다. 시스템 생물학 도구로서 DRaCALA는 OVium 라이브러리를 사용하여 알 수 없는 이펙터 단백질을 실현 가능하고 빠르며 매우 민감한 식별할 수 있습니다.DRaCALA는 방사성 동위원소 또는 형광염으로 표시될 수 있는 한 작은 신호 분자를 연구하는 데 사용될 수 있습니다. E.coli를 LB의 1.5 밀리리터로 접종하여 96°C의 각 웰에서 밀리리터 클로람페니콜당 25마이크로그램으로 보충하여 1박 배양시 30도, 분당 160회 회전합니다. 다음날 아침, 단백질 발현을 유도하기 위해 섭씨 30도에서 6시간 동안 500 마이크로몰라 IPTG로 야간 배양을 치료한다.인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 세포를 펠릿, 상체를 제거하고, 영하 80도에서 샘플을 동결. 용해를 시작하려면, 37섭씨에서 20분 동안 세포를 해동하기 전에 30분 간 영하 80도에서 30분 간 잠복하는 동안 잘 150마이크로리터의 용해 완충제에서 펠릿을 다시 분리한다. 그런 다음 lysate를 사용하기 전에 영하 80도에 보관해야합니다.과발현 된 단백질로 세포의 용액을 완료하려면, 얼음 차가운 용해 버퍼 2의 40 밀리리터에서 샘플을 다시 중단하고 8 분 동안 4 초 에 60 %진폭에서 샘플을 초음파 처리 한 다음 원심 분리에 의해 lysates를 취소합니다. 시료가 원심분리되는 동안, 상질화된 니켈-NTA 수지 500마이크로리터를 서있는 폴리프로필렌 크로마토그래피 컬럼에 추가합니다. 15분 후, 정착수지15밀리리터의 초순수로 2회, 1회 15밀리리터의 리시스 버퍼 2로 세척합니다.원심 분리가 끝나면 클리어된 리자테 상체를 열에 로드합니다. 모든 lysate가 컬럼을 통해 흐르는 경우, 세척 버퍼의 30 밀리리터로 열을 세척. 단백질을 용인하기 위해, 열에 용출 버퍼의 400 마이크로 리터 볼륨을 추가하고 세 번 용출을 반복합니다.용출 버퍼의 또 다른 300 마이크로 리터 부피는 용출을 세 번 반복하고 700 마이크로 리터의 최종 부피로 용출 단백질을 결합합니다. 용출된 시료의 겔 여과를 위해, 갓 준비된 젤 여과 버퍼25밀리리터로 크기 배제 컬럼을 세척한 후, 500 마이크로리터 루프를 사용하여 용출된 단백질의 전체 부피를 컬럼에 적재한다. 분당 500 마이크로리터로 실행하고 각 단백질의 2~3개의 500마이크로리터 부피 분획을 수집합니다.그런 다음 개별 스핀 컬럼을 사용하여 각 단백질을 농축하고 브래드포드 분석 키트를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 단백질 농도를 측정합니다. 구아노신 펜타포스페이트(guanosine pentaphosphate)라고 표시된 인(32)을 합성하기 위해 테이블에 설명된 대로 나사 로크 튜브에 작은 규모의 Relseq 반응을 조립하고 온도 섭씨 37도에서 1시간, 섭씨 95도에서 5분 동안 ThermoMixer에서 반응을 배양하고 얼음에서 5분 간 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 침전된 단백질을 스핀다운하고 새로운 나사 캡이 덮인 튜브에 초신을 함유하는 구노신 펜타포스페이트(guanosine pentaphosphate)로 표기된 합성인(32)을 전달한다.인 32 과노신 테트라포산염 합성의 경우, 새로운 나사 로크 튜브에 인 32 라벨과노신 펜타포스페이트 제품의 절반에 마이크로몰라 GppA 를 추가하고 10 분 동안 반응을 배양 37 섭씨, 섭씨 95도에서 5 분, 얼음에 5 분. 인큐베이션의 끝에서, 원심분리에 의해 침전을 회전하고 새로운 튜브에 상류체를 포함하는 구아노신 테트라포산염을 포함하는 인 32 를 전송한다. 격리된 표적 단백질을 분석하려면, 1.5개의 어금반 모노포타슘 인산염을 이동상으로 사용하여 얇은 층 크로마토그래피 플레이트에 각 샘플의 마이크로리터 1개를 실행한다.분석 후, 말린 플레이트를 투명 플라스틱 폴더에 놓고 피광기 이미저에서 데이터를 시각화하고 정량화하기 전에 5 분 동안 저장 인광판 화면에 플레이트를 노출합니다. 표적 단백질의 DRaCALA 스크리닝의 경우, 해동 된 도매 용액 20 마이크로 리터를 95 웰 V-바닥 마이크로티터 플레이트의 개별 우물에 추가하고 각 우물에 세라티아 마르세센 엔토너리스 2.5 단위를 추가합니다. 섭씨 37도에서 15분 후, 20분 동안 얼음 위에 용사를 놓습니다.다음으로, 동일한 부피 32개의 구아노신 펜타포산염과 구노신 테트라포산염을 혼합하고 혼합물에 1X 리시스 버퍼 1개를 추가하여 4나노몰라 관타나모 펜타포스페이트 용액을 획득한다. 다중 채널 파이펫과 여과된 파이펫 팁을 사용하여 구아노신 펜타포스페이트 혼합물의 10마이크로리터를 실온에서 5분간 잠복할 수 있는 셀 리자이트와 혼합합니다. 인큐베이션이 끝나면 96X 핀 공구를 30초 동안 논이온 세제용 0.01%의 용액으로 3회 세척한 후, 96웰 샘플 플레이트에 핀 툴을 넣기 전에 세척당 종이 타월에서 30초 건조를 합니다.30초 후 핀 도구를 똑바로 들어 올려 니트로셀룰로오스 멤브레인에 30초 동안 똑바로 놓습니다. 건조 5분 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인을 투명 플라스틱 폴더에 배치하여 인광화상 영상에 의한 저장 형광식 스크린 노출 및 시각화를 입증하였다. 잠재적인 표적 단백질을 정량화하고 식별하려면 인광선 과 관련된 분석 소프트웨어에서 시각화 된 플레이트의 젤 파일을 엽니 다.분석할 스팟을 정의하려면 배열 분석 함수를 사용하여 12열을 8열 그리드로 설정합니다. 구멍 반점의 바깥쪽 가장자리를 돌례하려면 큰 원을 정의하고 정의된 큰 원의 볼륨과 배경 과 영역을 스프레드시트에 내보냅니다. 작은 내부 점을 할당하려면 정의된 원 아래로 크기를 조정하고 정의 된 작은 원의 볼륨과 배경 및 영역을 내보내고 스프레드 시트에 있는 모든 데이터를 저장합니다.필요에 따라 스팟과 겹치는 위치 원이 실제 반점보다 약간 큰 크기를 조정합니다. 방정식을 사용하여 스프레드시트의 바인딩 분수를 계산하고 데이터를 플롯합니다. 그런 다음 다른 우물의 대다수에 비해 높은 결합 분수를 보여주는 우물에서 잠재적인 결합 단백질을 식별합니다.본 대표적인 분석에서는 대부분의 우물에서 백그라운드 바인딩 신호가 상대적으로 낮은 플레이트를 관찰할 수 있다. 잘 H3에서 양성 결합 신호는 구아노신 펜타포스페이트 결합 단백질 Hpt의 과발현으로 인해 다른 우물에 대해 관찰된 것보다 훨씬 높은 결합 분획을 나타냈다. 대표 판에서, 몇몇 우물은 많은 우물에서 관찰된 상대적으로 강한 내부 점에 의해 표시된 바와 같이 상대적으로 높은 배경 결합 신호를 보여주었으며, 정량화 후에 관찰되는 일관되게 높은 결합 분획을 보였다.특히 일부 대상은 거짓 긍정과 같은 가변 바인딩 분수도 제공했습니다. 추가 명확히 하기 위해, 연구원은 다시 결합을 시험하기 위하여 정제된 단백질을 이용했습니다. 표적 단백질이 확인되면, DRaCALA, 이더탈 적정 열량또는 다른 방법을 사용하여 상호 작용 강도 와 특이성을 균일하게 정화하고 상호 작용 강도 와 특이성을 확인할 수 있습니다.작은 신호 분자의 표적 단백질을 식별하는 것은 인간 생물학에 세균 독성에서 나오는 역할에 대한 심층적인 이해로 가는 길을 열어줍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 이동성-이동 친화성 모세관 전기영동을 통해 단백질-리간드 상호 작용을 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 다양한 하전 리간드를 가진 단백질의 결합 거동을 특성화하는 데 사용할 수 있습니다.

Mobility Shift Affinity Capillary 전기영동: 단백질-리간드 복합체의 차등 이동에 따른 샘플-리간드 상호 작용을 분석하는 방법

이 동영상은 세포 내 뉴클레오티드 2차 메신저 결합 단백질의 체계적인 고처리량 스크리닝 기술인 리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용을 보여줍니다. 이 기술은 세포 용해물에서 과발현된 표적 단백질에 메신저를 직접 결합할 수 있게 하여 단백질 정제의 필요성을 우회할 수 있습니다.

리간드 분석의 차등 방사형 모세관 작용: 박테리아 뉴클레오티드 2차 메신저 결합 세포 내 단백질을 식별하기 위한 고처리량 기술

마이크로 thermophoresis (MST)은 널리 세포 용 해물에서 대상 단백질의 정제없이 결합력 결정에 사용할 수 있습니다. 프로토콜은 GFP 융합 단백질, 비 변성 조건에서 세포 용해 및 리간드의 농도를 변화의 존재 MST 신호의 검출 발현을 포함한다.

미세 규모 Thermophoresis에 의한 결합력 결정 단백질 정제 - 무료 방법

시차 주사 형광 측정법은 단백질과의 상호 작용을 위해 작은 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 데 널리 사용되는 방법입니다. 여기에서는 이러한 분석을 확장하여 작은 분자와 단백질 파트너 사이의 해리 상수를 추정하는 간단한 방법을 제시합니다.

시차 주사 Fluorimetry를 사용하여 단백질 - 리간드 상호 작용의 결정

제시된 프로토콜은 리간드-수용체 상호작용의 신속한 조사를 위한 두 가지 효소 결합 면역흡착 시험(ELISA) 기반 기술을 설명합니다: 첫 번째 시험은 리간드와 수용체 간의 해리 상수를 결정할 수 있습니다. 두 번째 시험은 리간드-수용체 상호작용에 대한 차단 펩타이드의 신속한 스크리닝을 가능하게 합니다.

ELISA 기반 바인딩과 경쟁 방법은 신속 리간드 - 수용체 상호 작용을 확인하는 방법

여기에서는 광친화성 라벨링을 사용하여 소분자 결합 단백질을 식별하는 방법을 설명합니다. 이 기술의 장점은 살아있는 세포 환경 내에서 표적 단백질의 결합 및 공유 라벨링이 발생하여 세포 용해 시 네이티브 단백질 구조 및 결합 조건을 파괴할 위험을 제거한다는 것입니다.

라이브 셀 Photoaffinity 라벨에 의해 기본 셀룰러 환경에서 작은 분자 결합 단백질의 식별

여기에 프로토콜 작은 분자 지질 ligand phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2)을 정제 hEAG1 이온 채널 단백질의 상호 작용을 설명합니다. 측정 씨 소설 작은 분자 이온 채널 ligand 심사에 대 한 잠재적인 방법이 될 수 보여 줍니다.

바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

자세한 프로토콜 ELISA 적정 수행을 설명 합니다. 또한, 새로운 알고리즘 적정 ELISAs를 평가 하 고 결정 플레이트 움직일 수용 체 성 ligand의 바인딩의 분리 상수를 제공 됩니다.

적정 수용 체 Ligand 상호 작용의 분리 상수를 결정 하는 방법으로 ELISA

여기, 안정 동위 원소와 핵 자기 공명 (NMR) 분광학 및 눈금을 사용 하 여 단백질 단백질 상호 작용의 후속 묘사는 생산 및 분류는 단백질의 정화에 대 한 프로토콜 선물이 Thermophoresis (MST) 실험입니다.

핵 자기 공명 분광학 (NMR)와 미 Thermophoresis (MST) 구형 및 Filamentous 단백질의 상호 작용을 측정

Autoradiography 하는 방법은 정기적으로 질적 또는 양적 약리학의 결정에 대 한 바인딩을 radioligands 조직 단면도를 공부 하는 데 사용 됩니다.

시각화 및 약리 대상의 특성에 대 한 간단 하 고 강력한 방법으로 autoradiography

배우세요 DRaCALA 기법으로 Escherichia coli에서 (p)ppGpp 결합 단백질을 신속하게 식별하는 방법. 이 고감도 스크리닝 기술은 세균 신호 전달 및 생리학 연구에 활용됩니다.

리간드 분석의 차동 방사형 모세관 작용으로 작은 리간드의 결합 단백질 식별 (DRaCALA)

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