극저온 전자 단층 촬영을 위한 이중 빔 주사 전자 현미경을 사용하여 유리체 생물학적 샘플에서 라멜라 준비

이 프로토콜은 초저온 전자 단층 촬영을 위한 Plasmodium-falciparum에 감염된 적혈구의 유리체 라멜라 제조를 간략하게 설명합니다. 이를 통해 기생충이 말라리아를 유발하는 방법에 대한 자세한 구조 정보를 직접 관찰할 수 있습니다. 초저온 전자 단층 촬영은 세포 내부에 대한 고해상도 정보를 기록합니다.

단일 단백질 복합체를 현장에서 관찰할 수 있을 만큼 강력하며, 이를 계산적으로 추출하고 평균화하여 단백질에 대한 3차원 구조 정보를 밝힐 수 있습니다. 이 프로토콜은 다양한 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 초저온 전자 단층 촬영을 위한 유리체 라멜라를 처음 생산하는 사람에게 출발점이 될 수 있습니다. 이것은 오늘 프로토콜을 수행 할 Alejandra Carbajal입니다.

시작하려면 CryoStage를 사용하여 냉동 구리 그리드를 스크리닝하고 그리드를 가로지르는 얼음의 구배에 특히 주의를 기울이는 광학 현미경을 사용합니다. 얼음의 더 얇은 영역에서 셀 범위에 대해 개별 그리드 사각형을 확인하십시오. 지워지지 않는 검은색 마커를 사용하여 Cryo-FIB-SEM 전용 오토그리드 림의 전면과 반대쪽을 표시합니다.

잘린 그리드를 탄소면이 위로 향하게하여 Cryo-FIB-SEM 셔틀에 넣고 4 나노 미터 두께의 탄소 또는 백금 전자 빔 회전 코팅을 셀 표면에 적용합니다. 셔틀을 Cryo-FIB-SEM에 로드하고 5킬로볼트에서 SEM으로 각 그리드의 셀 분포를 평가합니다. 100 전력에서 저배율 개요를 통해 그리드 전체의 얼음 그라데이션을 살펴보십시오.

그런 다음 5, 000 전력에서 더 높은 배율의 이미지를 찍어 개별 그리드 사각형을 봅니다. 가스 주입 시스템 바늘을 그리드 위의 챔버에 삽입하고 유기 백금 소스를 설정된 시간 동안 설정 온도로 가열하여 증기 흐름을 생성하여 각 그리드의 표면에 2마이크로미터 유기백금 코팅을 적용합니다. 샘플을 관찰하기 위해 그리드의 평면이 이온 빔의 입사각에서 약 10도가되도록 샘플을 기울이고 SEM 및 FIB 이미지 모두에서 볼 수있는 적절한 그리드 사각형의 중심을 이동하십시오.

낮은 전류에서 이온 빔을 사용하여 그리드를 고배율로 조사하여 그리드 사각형의 중심에 있는 셀을 시각화합니다. 밀링할 직사각형 패턴 2개를 표시하는데, 하나는 3마이크로미터 두께의 보호 영역 위와 아래에 있습니다. 그런 다음 빔 설정을 선택하고 밝기와 대비를 조정하여 난시를 교정합니다.

설정이 완료되면 300피코암페어의 전류에서 밀링을 시작하면서 이온 빔 보기에서 실시간 진행 상황을 모니터링하고 SEM으로 간헐적으로 모니터링합니다. SEM에서 샘플을 확인하고 첫 번째 밀링 후 이온 빔이 보호 영역 위와 아래의 샘플을 통과하지 않은 경우 직사각형 패턴의 높이를 높여 더 많은 재료를 제거합니다. 라멜라 위와 아래의 표면이 이온 빔 보기에서 완전히 매끄러우면 밀링을 중지합니다.

밀링 공정을 단계적으로 반복하여 두께가 300나노미터에 도달할 때까지 매번 이온빔 전류를 줄입니다. 각 라멜라의 X, Y, Z 위치를 기록합니다. 실험이 끝날 때 라멜라를 연마하려면 저배율 SEM 개요를 사용하여 연마할 라멜라 그룹을 선택하고 연마 루트를 표시합니다.

연마 루트가 표시되면 두 직사각형 패턴 사이의 공간을 100-200 나노 미터로 줄이고 30 피코 암페어의 이온 빔 전류에서 연마를 시작합니다. 2-3킬로볼트에서 SEM으로 진행 상황을 모니터링합니다. 라멜라의 대비가 SEM에 의해 손실되거나 유기백금 코트 또는 라멜라 자체가 무결성을 잃기 시작하면 연마를 중지하십시오.

각 라멜라의 저배율 SEM 이미지를 획득하고 저장합니다. 실험 완료 후 현미경에서 셔틀을 제거합니다. 라멜라로 그리드를 제거하고 액체 질소 아래에 보관하십시오.

그리드를 주의해서 다루십시오. 형태학을 연구하기 위해, 분열증은 E-64 억제제의 화합물 2를 사용하여 출구의 다른 단계에서 멈췄습니다. 화합물 2의 존재 하에서, 숙주 적혈구에서 기생하는 막과 주변 헤모글로빈 사이의 경계가 잘 정의되었다.

온전한 기생 액포 또는 PV는 헤모조인 결정의 단일 클러스터에 메로조이트로 가득 차 있었습니다. 화합물 2 개의 동기화 된 schizonts가 E-64로 세척되었을 때, PV 막이 파열되고 메로 조이트가 RBC 내에서 퍼졌습니다. 구리 그리드에서 좋은 세포 분포의 전형적인 예는 잘 정의된 주변부와 손상되지 않은 액포 막을 가진 큰 적혈구를 보여줍니다.

부분적으로 붕괴된 숙주 적혈구 내에서 개별 메로조이트는 작은 세포 클러스터로 시각화되었습니다. 각 정신 분열증은 중앙에 검은 반점이 있어 헤모조인 결정의 위치를 나타냅니다. 밀링 후, 그리드를 TEM에 로드하여 라멜라의 위치를 식별하고 단층 촬영으로 표적화하기에 적합한 영역을 찾았습니다.

샘플 현미경 사진에서 최근에 메로조이트에 의해 침범된 적혈구를 볼 수 있습니다. 숙주 세포 유래 막으로 둘러싸인 메로조이트는 RBC의 경계 내에서 볼 수 있습니다. 메로조이트의 꼭대기 끝에서 세포를 둘러싸고 있는 2개의 막과 전자 밀도가 높은 버섯 모양의 특징과 관련된 메로조이트의 꼭대기에 쌓인 4개의 막이 명확하게 보였습니다.

메로조이트의 세포질 내에서, 메로조이트 원형질막과 다층 소포 사이의 융합 사건이 확인되었다. 230 나노 미터 두께의 라멜라에 대한 추가 TEM 분석에서, E-64로 처리 된 성숙한 메로 조이트의 전형적인 형태가 관찰되었다. 적혈구막 내에서 메로조이트 원형질막은 내막 복합체, 극성 고리, 미벅, 립트리 및 핵막과 같은 세포 소기관과 함께 볼 수 있습니다.

이 기술의 가장 중요한 부분은 얇은 라멜라를 재현 가능하고 효율적으로 생산할 수 있도록 그리드를 최적화하는 것입니다. 이 기술의 추가 개발을 통해 연구자들은 말라리아 기생충 내에서 단일 단백질 분자를 시각화하고 말라리아 탈출에서 그 역할을 결정할 수 있습니다.