Name: 세포 추적을 이용한 구강 기기 재생 중 및 이후 스텐터 의 운동성 패턴 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: 배우세요 Stentor coeruleus의 구강 기기 재생 중 운동성을 정량화하는 방법을. 시차 현미경과 자동화된 세포 추적을 통해 기능 회복과 행동 변화를 분석하는 이 실험은 단세포 재생 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

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이 연구는 부분적으로 Marine Biological Laboratory Whitman Early Career Fellowship (JYS)에 의해 지원되었습니다. 우리는 Evan Burns, Mit Patel, Melanie Melo 및 Skylar Widman이 예비 분석 및 코드 테스트 중 일부를 도운 것을 인정합니다. 토론과 제안에 대해 Mark Slabodnick에게 감사드립니다. WFM은 NIH 그랜트 R35 GM130327의 지원을 인정합니다.

주: 대략 백 개의 S. 코에룰루스 세포의 집단을 이전에 공개된 JoVE 프로토콜8에 따라 배양하였다.
1. 시료 준비
<ol><li>250 μm 두께의 실리콘 스페이서 시트 (재료 표)의 조각을 현미경 슬라이드보다 높이와 너비 모두에서 약간 작게 자릅니다. 5/16" 구멍 펀치를 사용하여 원형 웰을 만듭니다. 좋은 밀봉을 보장하기 위해 이웃 우물 사이에 충분한 공간을 남겨 두는 것에 유의하십시오. 참고: 이웃 우물 사이에 3mm의 공간이 충분한 것으로 확인되었습니다. 연습을 통해 열 개의 웰을 단일 샘플 슬라이드에 배치 할 수 있습니다.</li>
	<li>세포를 2분 동안 10% 수크로오스 또는 2% 우레아에서 인큐베이션함으로써 OA의 재생을 개시한다(도 1A). 그런 다음 신선한 배지8로 세 번 씻으십시오. 각 웰에 약 열 개의 스텐터를 부드럽게 피펫하십시오. 샘플 부피를 웰 볼륨과 가능한 한 가깝게 일치시키는 것을 조심하십시오. 참고: 여기에 사용된 웰 치수에 대해, 12.5 μL의 샘플을 각 웰 내로 피펫팅하였다.</li>
	<li>한쪽 가장자리에서 시작하여 웰 위에 커버 글라스 조각 ( 재료 표 참조)을 부드럽게 낮추어 웰을 닫습니다. 10μL 피펫 팁과 같이 좁고 약간 유연한 물체를 사용하여 실리콘 시트와 접촉하는 커버 글라스를 눌러 밀봉을 잘 하십시오.</li>
</ol>2. 가시 광선 현미경 검사 시간 경과
<ol><li>샘플을 현미경 스테이지에 놓고 배율을 사용 가능한 가장 낮은 크기로 설정하여 하나의 웰이 프레임 전체에 맞도록 합니다. 참고: 이 프로토콜의 현미경에는 1.6x 카메라 어댑터와 목표의 1x 배율이 사용되었습니다.</li>
	<li>타임랩스를 시작합니다. 각 시점에서 각 웰의 초당 30프레임에서 10초 비디오를 획득합니다. 전동 X-Y 스테이지가 있는 현미경 설정을 사용하는 경우 전체 타임랩스를 자동화합니다. 그렇지 않으면 사용자가 각 시점에 있는지 확인하여 샘플을 수동으로 변환하여 각 웰을 기록하십시오. 참고: 가열 및 증발을 피하기 위해 이미징하지 않을 때 샘플을 비추지 마십시오. 샘플 부피는 작으며 증발은 기포로 이어집니다.</li>
	<li>동영상을 TIFF, MOV 또는 AVI로 저장합니다. 참고: 가장 일반적인 비독점 비디오 파일 형식입니다. 특정 현미경 소프트웨어에 따라 비디오는 기본적으로 독점 파일 형식으로 저장 될 수 있지만 앞서 언급 한 파일 형식 중 하나로 내보낼 수 있습니다.</li>
	<li>물리적 스케일을 위해 픽셀-밀리미터 변환 계수를 사용하고, 캘리브레이션을 수행하거나 사용된 카메라에서 알려진 픽셀 크기를 사용합니다. 보정하려면 비디오와 동일한 배율 설정에서 보정 슬라이드의 선명한 이미지 또는 선명한 눈금자를 얻습니다. 이미지 보기 프로그램을 사용하여 알려진 물리적 거리의 마크 사이의 픽셀 수를 계산합니다. 참고: 예를 들어, 눈금자의 이미지에 1mm 표시와 2mm 표시가 100픽셀로 구분되는 경우 변환 계수는 100픽셀당 1mm입니다. 또는 카메라 픽셀 크기에서 이 요소를 파생시키려면 카메라 픽셀 크기에 배율을 곱하면 됩니다. 예를 들어, 사용된 카메라의 픽셀이 3.45μm이고 사용된 배율이 1.6배인 경우 변환은 1픽셀당 3.45μm * 1.6 = 5.52μm입니다.</li>
</ol>3. 세포 추적
<ol><li>TrackCells.m과 CleanTraces.m이라는 두 스크립트를 컴퓨터의 기억하기 쉬운 위치에 다운로드합니다. 데이터 비디오가 아직 이 컴퓨터에 없으면 이 컴퓨터로 전송하십시오. 참고: 데이터 비디오와 스크립트는 동일한 폴더에 있을 필요가 없습니다.</li>
	<li>데이터 비디오를 각 시간대마다 하나씩 폴더로 구성합니다. 먼저 스크립트 TrackCells.m 을 사용하여 데이터 비디오에서 자동화된 셀 추적을 수행합니다. TrackCells.m을 열고 스크립트를 실행합니다.</li>
	<li>팝업 창이 나타나면 경로에 추가 를 선택합니다.이 옵션은 일반적으로 스크립트가 지정된 폴더에서 처음 실행될 때만 발생합니다. 메시지가 표시되면 추적을 시작할 하나 이상의 데이터 비디오를 선택하고 데이터 비디오로 이동합니다(섹션 2). Shift 클릭, 컨트롤 클릭 또는 마우스 왼쪽 버튼을 누른 채 파일 위로 이동하여 강조 표시하여 여러 비디오 파일을 선택합니다.</li>
	<li>프롬프트 창 하단의 파일 이름 : 상자에있는 파일 목록에 만족하면 열기를 클릭하십시오. 먼저 한 비디오에서 테스트 실행을 수행하여 모든 매개 변수가 올바르게 설정되었는지 확인합니다(아래 설명 참조). 참고: 이 스크립트는 이제 선택한 각 비디오 파일에 대한 폴더를 만듭니다. 그런 다음 비디오의 각 프레임을 .jpg 파일과 비디오에있는 모든 흔적을 포함하는 position_estimates.mat라는 파일로이 폴더에 씁니다. 비디오 크기, 비디오 수 및 컴퓨터 속도에 따라 이 스크립트를 실행하는 데 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.</li>
</ol>4. 추적 확인
<ol><li>계속하기 전에 오류 메시지가 없는지 확인하여 섹션 3에 설명된 단계를 올바르게 수행했는지 확인합니다. CleanTraces.m 스크립트를 사용하여 변칙적이거나 잘못된 추적을 수동으로 거부합니다. 파일을 두 번 클릭하여 MATLAB 편집기 창에서 CleanTraces.m을 엽니다.</li>
	<li>프롬프트에서 TrackCells.m으로 출력 된 데이터 폴더 선택. 비디오 파일과 동일한 이름을 가지며 섹션 3에 설명 된대로 생성 된 폴더 중 하나로 이동합니다. 폴더를 하나만 선택합니다. 참고: 이 스크립트는 이제 팝업 창에 추적을 하나씩 표시합니다. 추적이 시작되는 비디오 프레임에 녹색으로 겹쳐져 있고 추적이 끝나는 비디오 프레임의 프레임에 자홍색으로 겹쳐져 있습니다. 따라서 유효한 추적은 녹색 셀과 마젠타 셀을 연결해야 합니다.</li>
	<li>메시지가 표시되면 추적을 유지하려면 1을 입력하고 추적을 거부하려면 0을 입력합니다. Enter 키를 눌러 다음 추적으로 이동합니다. 참고: 더 이상 추적이 없거나 처음 육십 개가 표시될 때까지 새 추적이 계속 표시됩니다. 이 프로세스가 완료되면 스크립트는 출력을 저장하기 위해 CLEAN TRACES 라는 폴더를 자동으로 만들고 나머지 모든 추적을 비디오의 첫 번째 프레임 위에 표시합니다(그림 1B). 이 이미지는 나중에 참조할 수 있도록 자동으로 LabeledTraces.png 로 저장됩니다. 사용자가 보관하도록 선택한 모든 추적은 clean_traces.mat 파일에 저장됩니다.</li>
	<li>계속하기 전에 한 시점의 모든 비디오에 대해이 단계를 완료하십시오. 참고: 이 원고의 데이터에 대해, 각 시점에서 각 웰에 대해 하나의 비디오를 획득하여 시간대당 총 열 개의 비디오를 획득했습니다.</li>
</ol>5. 데이터 시각화
참고: 서로 다른 시간대에 걸쳐 전체 세포 집단의 운동성을 시각적으로 비교하기 위해 섹션 4의 모든 트레이스를 원점에서 시작하여 각 시점에 대해 하나의 방사형 변위 대 시간 플롯을 생성하도록 변환되었습니다(그림 1C-F, 모든 시점에 대한 보충 그림 S1 참조).
<ol><li>SpaghettiPlots.m이라는 제목의 스크립트를 다운로드하여 시작하십시오. 스크립트를 열고 실행합니다. 그래프로 웰 데이터(clean_traces.mat)가 포함된 시간 폴더 선택 프롬프트와 함께 창 파일 브라우저 창이 나타나면 시점 중 하나의 폴더로 이동합니다. 이 폴더에는 분석된 각 비디오에 대한 폴더가 포함되어 있어야 합니다.</li>
	<li>보정: 밀리미터당 픽셀 수는 얼마입니까?라는 메시지가 표시되면 2.4단계에서 찾은 보정 값을 입력하고 Enter 키를 누릅니다. 참고: 이제 스크립트는 이 시점에서 분석된 모든 비디오의 추적을 단일 플롯으로 결합합니다(그림 1C-F). 플롯에서 희미한 점선으로 표시된 원은 1, 2, 3 및 4mm의 방사상 변위를 나타냅니다.</li>
	<li>스크립트의 행 55를 변경하여 필요에 따라 플롯의 축을 조정합니다.이 줄은 기본적으로 최대 4mm의 반지름을 포함하여 rr = 4로 설정됩니다. 플롯을 저장합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Lillie, F. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+smallest+parts+of+stentor+capable+of+regeneration%3B+a+contribution+on+the+limits+of+divisibility+of+living+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">On the smallest parts of stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter.</a> Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+proportionate+structures+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biological+Bulletin%22%5BJournal%5D)">Regeneration of proportionate structures in Stentor.</a> The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTartar%2C+V+%22The+Biology+of+Stentor%22">The Biology of Stentor</a>. Kerkut, G. A. , Pergamon Press. (1961).</li>
<li>Tartar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactions+of+Stentor+coeruleus+to+certain+substances+added+to+the+medium%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Reactions of Stentor coeruleus to certain substances added to the medium.</a> Experimental Cell Research. 13 (2), 317-332 (1957).</li>
<li>Kelleher, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinetic+model+for+microtubule+polymerization+during+oral+regeneration+in+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Biosystems%22%5BJournal%5D)">A kinetic model for microtubule polymerization during oral regeneration in Stentor coeruleus.</a> Biosystems. 9 (4), 269-279 (1977).</li>
<li>Slabodnick, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+kinase+regulator+Mob1+acts+as+a+patterning+protein+for+Stentor+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Biology%22%5BJournal%5D)">The kinase regulator Mob1 acts as a patterning protein for Stentor morphogenesis.</a> PLOS Biology. 12 (5), 1001861(2014).</li>
<li>Wan, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reorganization+of+complex+ciliary+flows+around+regenerating+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Reorganization of complex ciliary flows around regenerating Stentor coeruleus.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 375 (1792), 20190167(2020).</li>
<li>Lin, A., Makushok, T., Diaz, U., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+the+study+of+regeneration+in+Stentor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments+JoVE%22%5BJournal%5D)">Methods for the study of regeneration in Stentor.</a> Journal of Visualized Experiments JoVE. (136), e57759(2018).</li>
<li>Sood, P., McGillivary, R., Marshall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+program+of+regeneration+in+the+giant+single+cell%2C+Stentor+coeruleus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The transcriptional program of regeneration in the giant single cell, Stentor coeruleus.</a> bioRxiv. , 240788(2017).</li>
<li>Onsbring, H., Jamy, M., Ettema, T. J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+sequencing+of+Stentor+cell+fragments+reveals+transcriptional+changes+during+cellular+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA sequencing of Stentor cell fragments reveals transcriptional changes during cellular regeneration.</a> Current Biology. 28 (8), 1281-1288 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

많은 입자 및 세포 추적 알고리즘이 현재 존재하며 일부는 완전히 무료입니다. 비용과 사용자 친화성은 종종 타협이 필요한 절충안입니다. 또한, 기존의 많은 세포 추적 프로그램은 수영하는 동안 회전하고 갑작스런 방향 변화를 겪을 수있는 스텐터의 빠른 수영 운동보다는 조직 배양 세포의 느린 크롤링 움직임을 추적하도록 설계되었습니다. 이러한 많은 옵션을 테스트 한 후 여기에 제시된 프로토콜은 저비용 장비와 단일 과학 소프트웨어 패키지 (Table of Materials)만을 사용하여 데이터 수집에서 데이터 시각화에 이르기까지 모든 과정을 진행할 수있는 원 스톱 솔루션이되도록 고안되었습니다. 이것은 학생들이 자신의 질문을하고 짧은 시간 내에 양적 결과에 도달하는 장벽을 낮추기 때문에 필요한 장비의 대부분이 이미 사용 가능한 교육 중심 기관 또는 생물 물리학 교육 실험실의 연구 실험실에 특히 중요합니다.
이 원고에 제시된 방법은 수백 미크론에서...

스텐터 코에룰루스(Stentor)는 크기가 크고, 여러 미세수술 기술을 견딜 수 있는 능력, 실험실 세팅 1,2,3에서 배양의 용이성으로 인해 단세포 재생을 연구하는 데 사용되어 온 잘 알려진 모델 유기체이다. 초기 재생 연구는 스텐터 (Stentor)에서 가장 크고 형태 학적으로 구별되는 특징 인 OA에 초점을 맞추 었으며, 이는 화학 충격 4,5,6에 완전히 흘려집니다. 잃어버린 OA의 De novo 대체는 새로운 막질 밴드의 출현으로 시작됩니다 - 여덟 가지 형태 학적 단계3에 걸쳐 기능적 OA를 형성하기 전에 점차적으로 세포의 앞쪽으로 이동하는 섬모 배열. 이들 단계는 온도에 관계없이 순차적으로 관찰되었으며, 거의 모든 연구5에 대한 보편적인 기준점을 제공한다.
스텐터 재생의 기계론적 분석에는 화학 또는 분자 스크린의 일부로 여러 샘플에 적용할 수 있을 만큼 견고하고 간단한 재생 타이밍을 측정하기 위한 도구가 필요합니다. 세포 기반 분석을 수행하기 위한 표준 방법은 영상화이며, 이 경우, 재생 동안 새로운 OA의 형성을 이미징한다. 그러나, 이러한 영상-기반 분석은 재생성 구조가 마커로 사용될 수 있는 별개의 분자 성분을 함유할 때 가장 효과적이어서, 이들이 형광 이미지에서 쉽게 검출될 수 있도록 한다. 스텐터 OA의 경우에, 공지된 성분들(섬모, 기저체)은 또한 세포 표면의 나머지 부분에 존재한다; 따라서, OA의 복원을 인식하는 것은 단순히 구성요소의 존재 또는 부재를 찾는 것만으로는 달성될 수 없다.
오히려, OA를 검출하기 위해서는 어떤 형태의 형상 인식이 필요할 것이며, 스텐 터 세포가 종종 빠른 수축 과정을 통해 형태를 변화시킨다는 사실을 감안할 때 이것은 잠재적으로 매우 도전적입니다. 이 논문은 신체 및 OA 섬모의 운동성 활성에 의존하는 재생을위한 대체 분석을 제시합니다. OA가 재생됨에 따라, 새로 형성된 섬모는 위치와 활성의 재현 가능한 변화를 겪으며, 이는 차례로 세포의 수영 운동성에 영향을 미칩니다. 운동성을 분석함으로써, 재생된 구조물의 기능을 정량화함으로써 재생을 정량화하는 "기능적 재생"에 대한 분석을 수행할 수 있다. 재생 중 스텐터 섬모 함수의 이전 분석은 재생7의 여러 단계에서 흐름 패턴의 변화를 관찰하기 위해 외부 매체에 추가 된 트레이서 비드와 결합 된 입자 이미지 속도 측정을 사용했습니다. 그러나이 접근법은 개별 세포 및 관련 유동 필드를 한 번에 하나씩 힘들게 이미징해야합니다.
세포 자체의 움직임을 섬모 생성 흐름의 프록시로 사용함으로써, 고처리량 스크리닝 플랫폼과 호환되는 저해상도 이미징 시스템을 사용하여 더 많은 수의 세포를 병렬로 분석할 수 있을 것이다. 이 분석은 원칙적으로 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 다른 수영 생물에서 발달 및 기능적 재생을 연구하는 데 사용될 수 있습니다. 프로토콜의 섹션 1은 멀티웰 샘플 슬라이드의 구축을 설명하며, 이는 최대 하루 종일 세포 집단의 높은 처리량 이미징을 허용합니다. 다른 세포 유형과 함께 사용하기 위해 조정하는 방법에 대한 세부사항이 제공된다. 프로토콜의 섹션 2는 디지털 단일 렌즈 반사 카메라를 사용하여 해부 현미경에서 수행 할 수있는이 분석을위한 비디오 데이터의 수집을 다룹니다. 프로토콜의 섹션 3에서는 MATLAB 코드(추가 정보)를 사용한 셀 추적 및 셀 속도 계산에 대한 연습을 제공합니다. 프로토콜의 섹션 4에서는 결과를 쉽게 해석할 수 있도록 그림 1C-F 및 그림 2C와 같이 수치 결과를 플롯으로 변환하는 방법을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>0.25mm 두께의 실리콘 시트</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>CWS-S-0.25</td><td></td></tr><tr><td>24 x 50mm, #1.5 커버글라스</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1034527</td><td>논의에서 언급했듯이 하나의 슬라이드에 더 적은 수의 샘플 웰을 배치하면 더 작은 커버글라스를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td></td><td></td>: TrackCells.m 및 CleanTraces.m에 필요한 <td>Nikon D750</td></tr>, <tr><td>Chlamydomonas 137c, WT strain</td><td>Chlamydomonas Resource Center</td>, <td>CC-125</td><td></td></tr>, <tr><td>MATLAB</td>, <td>MATHWORKS</td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>MATLAB, Image Processing Toolbox</td>, <td>MATHWORKS</td><td></td><td>를 사용했습니다.</td></tr></tbody></table>

세포 추적을 이용한 구강 기기 재생 중 및 이후 스텐터 의 운동성 패턴 분석

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

스텐터 코에룰루스 는 단세포 재생 연구를 위한 잘 알려진 모델 유기체이다. 개별 세포에 대한 전사체 분석은 재생 과정 전반에 걸쳐 단계적으로 차별적으로 조절되는 수백 개의 유전자 (많은 구강 장치 (OA)와 관련이없는 것으로 나타났습니다. 새로운 OA의 성장을 향한 세포 자원의 이러한 전신 재구성 및 동원이 차등 유전자 발현의 단계에 시간에 상응하는 이동 및 행동의 관찰 가능한 변화를 초래할 것이라는 가설이 제기되었다. 그러나 S. coeruleus 의 형태 학적 복잡성으로 인해 통계와 시간 척도를 포착하기위한 분석의 개발이 필요했습니다. 사용자 지정 스크립트를 사용하여 짧은 비디오에서 셀을 추적하고 통계가 많은 인구 (N ~ 100)에 걸쳐 컴파일되었습니다. OA를 잃으면 S. coeruleus 는 처음에는 지시 된 움직임에 대한 능력을 상실합니다. 그런 다음 ~ 4 h에서 시작하여 ~ 8 시간까지 속도가 크게 떨어집니다. 이 분석은 운동성 표현형의 스크리닝에 유용한 도구를 제공하며 다른 유기체의 조사에 적합 할 수 있습니다.

이 분석의 목표는 큰 (N ~ 100) 재생 스텐터 집단 내에서 세포로부터의 이동 패턴의 점진적 변화와 이동 속도의 단계적 증가를 정량화하는 것입니다. 결과 해석을 돕기 위해 이 프로토콜에 포함된 사용자 지정 코드는 비디오 데이터 집합의 모든 셀 이동 추적의 오버레이(그림 1C-F 및 그림 S1)와 재생성 시작 이후 시간별 수영 속도 플롯의 두 가지 유형의 플롯을 생성합니다(그림 2C). 정상적으로 재생되는 스텐터 인구는 방향없는 수영에서 방향 수영으로의 꾸준한 전환을 입증해야합니다 (그림 1G). 각 세포는 ~ 8 h에 걸친 OA 재생 과정 동안이 전이를 완전히 겪지 만, 개인 간의 변화는 추세가 명확 해지기 위해 총체적으로 큰 집단의 움직임을 볼...

우리는 밝은 필드 현미경 검사 및 세포 추적을 사용하여 수백 미크론에서 밀리미터 크기의 세포 집단의 운동성과 행동을 특성화하기위한 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 Stentor coeruleus 가 잃어버린 구강 장치를 재생할 때 네 가지 행동 적으로 별개의 단계를 통해 전환한다는 것을 보여줍니다.

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

스텐터 코에룰루스는 오랫동안 단세포 재생을 이해하기 위한 모델 유기체로 사용되어 왔다. 시각적 형태학적 재생을 위한 타임라인은 알려져 있지만, 기능적 재생을 위한 타임라인은 알려지지 않은 채로 남아 있다. 이 분석은 손실 기능의 회복이 정량화될 수 있도록 동기화된 재생을 겪는 중심 집단의 운동성을 추적한다.다른 세포 유형과 함께 사용하기 위해 적응될 수 있다. 이미징 챔버의 안전한 씰이 없으면 웰이 서로 누출되거나 웰 내부에 기포가 형성됩니다. 실리콘 스페이서의 사용에 익숙하지 않은 연구자의 경우 PSW 또는 기타 깨끗한 매체를 각 웰에 피펫팅하여 사용 전에 누출을 테스트하는 것이 좋습니다.샘플 챔버의 구성은 구두로 묘사 된 것보다 쉽게 표시됩니다. 획득한 비디오 데이터로부터 운동성 패턴을 추출하는 과정도 마찬가지이다. 시작하려면 현미경 슬라이드보다 높이와 너비가 약간 작은 250 마이크로 미터 두께의 실리콘 스페이서 시트 조각을 자릅니다.전체 펀치를 사용하여 이웃 우물 사이에 충분한 공간을 남겨 둔 원형 웰을 만들어 좋은 씰을 확보하십시오. 2 분 동안 10 % sucrose 또는 2 % uria에서 스텐터 coeruleus 세포를 배양하여 구강 장치의 재생을 시작하십시오. 그런 다음 신선한 매체로 세 번 씻으십시오.각 웰에 약 10 스텐터를 부드럽게 피펫하십시오. 샘플 부피를 웰 부피와 가능한 한 가깝게 일치시키도록주의하십시오. 한쪽 가장자리에서 시작하여 웰 위에 커버 글라스 조각을 부드럽게 내려 웰을 닫으십시오.10 마이크로 리터 피펫 팁과 같이 좁고 약간 유연한 물체를 사용하여 실리콘 시트와 접촉하는 커버 글라스를 눌러 좋은 밀봉을 보장합니다. 샘플을 현미경 스테이지에 놓고 현미경을 사용 가능한 가장 낮은 배율로 설정하여 프레임에 잘 맞도록 합니다. 시간 경과를 시작하고 각 시점에서 각 웰의 초당 30 프레임으로 10 초 비디오를 획득하십시오.보정하려면 비디오와 동일한 배율 설정에서 보정 슬라이드의 선명한 이미지 또는 선명한 눈금자를 얻습니다. 이미지 보기 프로그램을 사용하여 알려진 물리적 거리의 마크 사이의 픽셀 수를 계산합니다. 두 스크립트를 다운로드하고, 셀을 추적하고, 추적하고, 추적한 흔적을 컴퓨터에서 기억하기 쉬운 위치로 이동하고, 데이터 비디오를 이 컴퓨터로 전송합니다.데이터 비디오를 폴더로 구성합니다. 각 시점마다 하나씩. 스크립트 트랙 셀을 사용하여 트랙 셀을 열고 스크립트 경로 추가를 실행하여 데이터 비디오에서 자동화된 셀 추적을 수행합니다."팝업 창이 나타나면 일반적으로 지정된 폴더에서 스크립트를 처음 실행할 때만 발생합니다.메시지가 표시되면 하나 이상의 데이터 비디오를 선택하여 추적을 시작합니다. 데이터 비디오로 이동하여 파일 목록에 만족하면 열기를 클릭하십시오."변칙적이거나 잘못된 추적을 수동으로 거부하려면 파일을 두 번 클릭하여 MATLAB 편집기 창에서 깨끗한 추적을 엽니 다. 프롬프트에서 트랙 셀별로 출력 된 데이터 폴더를 선택하십시오.생성 된 폴더 중 하나로 이동하여 선택하십시오. 메시지가 표시되면 추적을 유지하려면 하나를 입력하고 추적을 거부하려면 0을 입력합니다. 그런 다음 Enter 키를 눌러 다음 추적으로 이동합니다.스파게티 플롯이라는 제목의 스크립트를 다운로드하여 시작하십시오. 스크립트를 열고 실행합니다. 파일 브라우저 창이 프롬프트와 함께 나타나면 열 폴더를 선택합니다.시점 중 하나의 폴더로 이동합니다. 메시지가 표시되면 보정, 밀리미터당 픽셀 수는 얼마입니까? 보정 값을 입력하고 Enter 키를 누릅니다.기본적으로 RR이 네 개로 설정된 스크립트의 행 55를 변경하여 필요에 따라 플롯의 축을 조정합니다. 최대 네 밀리미터의 반경을 포함합니다. 플롯을 저장합니다.결과는 구강 장치 재생 과정으로 두 시간, 세 시간, 일곱 시간 및 여덟 시간에 스텐터 세포 집단의 집단적 운동성을 보여줍니다. 이 플롯은 운동성 개체의 수의 예상 증가와 집단 내에서 가장 운동성 세포의 범위에서 네 배 증가를 모두 보여줍니다. 가장 빠른 수영 셀은 가장자리 가까이에서 시작하면 직선으로 완전히 수영하는 것이 제한되며 이동 범위가 작아 보입니다.관 세포는 세 가지 별개의 범주로 분류되었는데, 눈에 보이는 홀드가 빠르지 않은 비운동성, 가시적 인 보류가 빠른 비운동성, 그리고 모타일로 분류되었다. 결과는 이러한 범주에 걸친 상대적 셀 수를 재생성에 대한 함수로 요약하는 누적 히스토그램을 보여주었습니다. 나중에, 상당한 수의 세포가 눈에 보이는 보류 금식을 가진 식민지에서 발견되었는데, 이는 그들이 환경을 탐험하고 그들의 종류의 다른 사람들 근처에 우선적으로 붙어 있음을 강하게 암시합니다.크기가 약 한 밀리미터 인 스텐터 코에룰루스에 대해 잘 작동하는 샘플 우물 치수를 선택하는 것이 중요합니다. 여기에는 직경 5/16 인치의 실리콘 스페이서 두께와 웰 당 10 개의 셀이 포함됩니다. 이 숫자는 다른 세포 유형에 대해이 프로토콜을 적용 할 때 조정되어야합니다.이 분석은 상이한 스텐터 표현형의 재생을 조사하고 비교하기 위해 RNA-I와 함께 수행될 수 있다.

analysis-motility-patterns-stentor-during-after-oral-apparatus

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 표피 성장 인자 수용체 (EGFR)의 이상의 표현은 소설 아가로 오스 겔 기반 microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포 (NSCs)의 운동성 향상 것을 보여줍니다. 이 기술은 인간의 신경 줄기 세포와 같은 세포 소스가 없어서 다른 포유 동물 세포 시스템에 쉽게 적응할 수 있으며, 시간을 주변의 차례가 중요합니다.

아가로 오스 겔 기반 Microfluidic 장치를 사용 신경 줄기 세포의 운동성 평가

위장 운동성 모니터로 실험용 돼지 말초 결장에서 colonic 운동성의 평가 (GIMM) 양적 위장관의 운동성 추진력을 평가하는 내용은 간단하고 단순한 방법이다.

위장 운동성 모니터 (GIMM)

3D 조직 문화의 시간 저속 영상은 대뇌 피질에서 fractionated 단백질 추출에 대한 반응으로 ganglionic 예하에서 발생하는 각각의 세포의 철새 행동을 공부하고 있습니다.

Ganglionic 에미넨스 문화에서 생성된 세포의 철새 행동

electromotility, 슬로우 운동성 및 굽힘을 포함한 외부 머리카락 세포 (OHC) 운동성이있는 응답을, 조사를 위해 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다. OHC의 운동성는 외부 교류 전기장과 자극에 의​​해 elicited 및 방법은 고속 영상 녹화, LED 기반의 조명, 그리고 마지막 세대 이미지 분석 소프트웨어를 활용합니다.

외부 교류 전기 필드 자극 및 고속 이미지 분석의 조합 아웃터 헤어 셀 운동성를 조사

암 줄기 세포 이주를 조사하기위한 compartmentalizing 마이크로 유체 장치가 설명되어 있습니다. 이 소설 플랫폼은 가능한 세포 microenvironment를 생성 및 라이브 세포 운동의 미세 시각화 할 수 있습니다. 높은 운동성 암 세포는 잠재적으로보다 효과적인 미래의 치료로 이어지는 공격적인 침투 분자 메커니즘을 공부 절연되어 있습니다.

Compartmentalizing 마이크로 유체 장치와 라이브 세포 이미징을 사용하여 암 줄기 세포 마이그레이션 평가

거대 섬모충인 Stentor coeruleus는 단일 세포의 재생과 상처 치유를 연구하는 고전적인 시스템입니다. 저배율과 고배율에서 Stentor 세포를 동시에 이미징함으로써 상처 전, 상처 중, 상처 후의 세포질 흐름을 측정할 수 있습니다.

Stentor coeruleus에서 단세포 상처 치유 중 세포질 흐름 시각화

최근에 사용 가능한 비디오 녹화 및 시공간 매핑(STmap) 기술을 사용하면 장 운동성의 전파 및 혼합 패턴을 시각화하고 정량화할 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 GIMM(GastroIntestinal Motility Monitoring) 시스템을 사용하여 STmap의 생성 및 분석을 설명하는 것입니다.

운동성의 시공간 매핑<em&gt; 전의 VIVO</em내장의&gt; 준비

최근의 연구 결과에 따르면 박테리아 편모 모터는 다양한 환경 신호를 감지하고 이에 반응하여 리모델링을 합니다. 여기에서 논의된 비드 분석은 환경 스트레스 요인에 대한 세포 적응에서 리모델링의 역할을 설명하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.

편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

거 대 한 ciliate, Stentor coeruleus, 재생을 연구 하 고 상처 치유에 뛰어난 시스템입니다. 단일 셀 또는 셀 조각에서 Stentor 셀 문화를 구축, 절단 세포 재생을 유도, 화학적 membranellar 밴드 및 구강 장치, 이미징, 및 세포의 분석의 재생성을 유도 하기 위한 절차 소개 재생입니다.

Stentor 에 중생의 연구 방법

많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

우리는 2차원 (2D) 성장 및 상처 복구 분석의 시간 경과 화상 진찰을 위한 1 차적인 마우스 배아 성 구형 중간엽 세포의 격리 그리고 문화를 위한 프로토콜을 제시합니다. 우리는 또한 세포 스트림 형성 및 방향 운동성을 결정하기 위하여 시간 경과 화상 진찰 데이터의 분석을 위한 방법론을 제공합니다.

집단 운동 특성을 분석하기 위해 1차 마우스 배아 성 성 메센키메 세포의 격리 및 시간 경과 이미징

배우세요 Stentor coeruleus의 구강 기기 재생 중 운동성을 정량화하는 방법을. 시차 현미경과 자동화된 세포 추적을 통해 기능 회복과 행동 변화를 분석하는 이 실험은 단세포 재생 생물학 연구에 필수적인 도구를 제공합니다.

세포 추적을 이용한 구강 기기 재생 중 및 이후 스텐터 의 운동성 패턴 분석

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