Name: 차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: 배우세요 자기 비드 기반 DNA 추출법으로 Aedes aegypti 모기에서 고품질 DNA를 분리하는 방법입니다. 이 프로토콜은 비용이 저렴하여 자원이 제한된 연구실에서도 차세대 시퀀싱을 수행할 수 있습니다.

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우리는 미국이 자금을 지원하는 벡터 매개 질병에 대한 우수의 태평양 남서부 지역 센터의 자금 지원을 인정합니다. 질병통제예방센터(협력계약 1U01CK0000516), CDC 보조금 NU50CK000420-04-04, USDA 국립식품농업연구소(해치 프로젝트 1025565), UF/IFAS 플로리다 메디컬 곤충학 연구소 펠로우십 Tse-Yu Chen, NSF CAMTech IUCRC 단계 II 보조금(AWD05009_MOD0030), 플로리다 보건부(CoQ) 이 문서의 결과와 결론은 저자의 결과이며 반드시 미국 어류 및 야생 동물 서비스의 견해를 나타내지는 않습니다.

1. DNA 추출 전에 일반 샘플 저장 및 준비
<ol><li>샘플을 조직을 부드럽게 하기 위해 >70% 알코올에 저장된 경우 4°C에서 1시간(또는 하룻밤)에 100 μL PCR 급 수분으로 샘플을 수화한다.</li>
</ol>2. 샘플 중단
<ol><li>인큐베이터 또는 흔들림 열 블록을 56°C에서 설정합니다.</li>
	<li>단백질 효소 K (PK) 버퍼/ 효소 믹스를 만듭니다. 단백질제 K(100 mg/mL)의 2μL과 98μL의 단백질제 K 버퍼(총 100μL)는 각 개별 모기 추출에 필요합니다. 여러 시편에 대한 마스터 믹스를 준비하려면 적절한 부피의 가용성을 보장하기 위해 총 양(모든 개별 시편에 대한 결합)을 ~15% 증가시합니다.</li>
	<li>추출 하기 전에 샘플 수화 된 경우, 각 샘플 튜브에서 물을 폐기.</li>
	<li>모기 조직을 포함하는 1.5 mL 마이크로 원심 분리기 튜브에서 PK 완충 /효소 혼합물의 100 μL을 추가하십시오.</li>
	<li>마이크로 원심 분리기 튜브 유봉을 사용하여 조직을 균질화합니다.</li>
	<li>실온에서 9,600 x g에서 1 분 동안 샘플을 원심 분리합니다.</li>
	<li>56°C에서 2-3h의 시료를 배양한다.</li>
	<li>인큐베이션 하는 동안, DNA 추출 단계(단계 3)를 사용하여 다른 시약을 준비한다.</li>
</ol>3. DNA 추출
<ol><li>마그네틱 비드 마스터 믹스를 만드세요. 각 샘플에 대해, 용해 버퍼 100 μL, 이소프로판올 100 μL, 자기 비드 15 μL(총 215 μL)를 혼합합니다. 여러 반응에 대한 마스터 믹스를 준비하려면 적절한 부피의 가용성을 보장하기 위해 총 양(모든 개별 표본에 대한 결합)을 ~20% 증가시합니다.</li>
	<li>인큐베이션 시간(2.7단계)이 끝나면 각 리세이트를 깨끗한 미세원심분리기 튜브 또는 파이펫을 사용하여 마이크로플레이트로 옮김한다.</li>
	<li>각 샘플에 마그네틱 비드 마스터 믹스의 100 μL lysate 및 215 μL을 추가합니다.</li>
	<li>파이펫을 사용하여 10-20 s에 잘 섞은 다음 실온에서 10 분 동안 방치하십시오. 간으로 튜브를 부드럽게 흔들어 자기 구슬과 DNA의 결합을 최대화합니다.</li>
	<li>자기 비드 분리기위에 튜브/플레이트를 놓고 용액이 명확해질 때까지 기다립니다.</li>
	<li>파이펫을 사용하여 튜브 / 접시에서 액체를 버리십시오. 상체를 제거할 때 DNA를 들고 있는 자기 구슬을 만지거나 방해하지 않도록 하십시오.</li>
	<li>튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 우물에 325 μL의 세척 버퍼 1을 추가합니다.</li>
	<li>피펫팅으로 철저히 섞고 실온에서 1분 동안 배양합니다.</li>
	<li>3.5-3.6 단계를 반복합니다.</li>
	<li>튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 우물에 250 μL의 세척 버퍼 1을 추가합니다.</li>
	<li>피펫팅으로 철저히 섞고 실온에서 1분 동안 배양합니다.</li>
	<li>3.5-3.6 단계를 반복합니다.</li>
	<li>튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 샘플에 250 μL의 세척 버퍼 2를 추가합니다.</li>
	<li>철저히 섞어서 실온에서 1분 동안 인큐베이션합니다.</li>
	<li>3.5-3.6 단계를 반복합니다.</li>
	<li>튜브/플레이트를 자기 비드 분리기에서 멀리 이동하고 각 우물에 250 μL의 세척 버퍼 2를 추가합니다.</li>
	<li>철저히 섞어서 실온에서 1분 동안 인큐베이션합니다.</li>
	<li>3.5-3.6 단계를 반복합니다.</li>
	<li>자기 비드 분리기에서 튜브 /플레이트를 이동하고 각 우물에 용출 버퍼 100 μL을 추가합니다.</li>
	<li>철저히 섞어서 실온에서 2분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>자기 비드 분리기위에 튜브/플레이트를 이동하고 용액이 명확해질 때까지 기다립니다.</li>
	<li>새로운 깨끗한 0.5 마이크로 센심 분리기 튜브 또는 마이크로 플레이트에 피펫.</li>
	<li>DNA 샘플을 4°C(최대 1주) 또는 -80°C로 저장합니다.  마이크로 플레이트를 사용하는 경우 파라필름으로 덮습니다.</li>
	<li>적절한 방법을 사용하여 DNA 수율을 결정합니다. 참고: 이 연구에서는 260/280 nm에서 DNA 불소계 판독 및 흡광도를 활용했습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Nieman, C. C., Yamasaki, Y., Collier, T. C., Lee, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+extraction+protocol+for+improved+DNA+yield+from+individual+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A DNA extraction protocol for improved DNA yield from individual mosquitoes.</a> F1000Research. 4, 1314(2015).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+divergence+among+invasive+populations+of+Aedes+aegypti+in+California%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Genome-wide divergence among invasive populations of Aedes aegypti in California.</a> BMC Genomics. 20 (1), 204(2019).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abundance+of+conserved+CRISPR-Cas9+target+sites+within+the+highly+polymorphic+genomes+of+Anopheles+and+Aedes+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Abundance of conserved CRISPR-Cas9 target sites within the highly polymorphic genomes of Anopheles and Aedes mosquitoes.</a> Nature Communications. 11 (1), 1425(2020).</li>
<li>Schmidt, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcontinental+dispersal+of+Anopheles+gambiae+occurred+from+West+African+origin+via+serial+founder+events%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcontinental dispersal of Anopheles gambiae occurred from West African origin via serial founder events.</a> Communications Biology. 2, 473(2019).</li>
<li>Norris, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+introgression+in+an+African+malaria+mosquito+coincident+with+the+increased+usage+of+insecticide-treated+bed+nets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Adaptive introgression in an African malaria mosquito coincident with the increased usage of insecticide-treated bed nets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (3), 815-820 (2015).</li>
<li>Main, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+basis+of+host+preference+and+resting+behavior+in+the+major+african+malaria+vector%2C+Anopheles+arabiensis%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetic basis of host preference and resting behavior in the major african malaria vector, Anopheles arabiensis.</a> Plos Genetics. 12 (9), 1006303(2016).</li>
<li>Yamasaki, Y. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+tools+for+genomic+DNA+library+construction+of+small+insects%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Improved tools for genomic DNA library construction of small insects.</a> F1000Research. 5, 211(2016).</li>
<li>Tabuloc, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequencing+of+Tuta+absoluta+genome+to+develop+SNP+genotyping+assays+for+species+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pest+Science%22%5BJournal%5D)">Sequencing of Tuta absoluta genome to develop SNP genotyping assays for species identification.</a> Journal of Pest Science. 92, 1397-1407 (2019).</li>
<li>Campos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequence+of+Anopheles+coustani+from+S%C3%A3o+Tom%C3%A9+island%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequence of Anopheles coustani from São Tomé island.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (3), 3376-3378 (2020).</li>
<li>Cornel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+mitogenome+sequences+of+Aedes+%28Howardina%29+busckii+and+Aedes+%28Ochlerotatus%29+taeniorhynchus+from+the+Caribbean+Island+of+Saba%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrial+DNA.+Part+B%2C+Resources%22%5BJournal%5D)">Complete mitogenome sequences of Aedes (Howardina) busckii and Aedes (Ochlerotatus) taeniorhynchus from the Caribbean Island of Saba.</a> Mitochondrial DNA. Part B, Resources. 5 (2), 1163-1164 (2020).</li>
<li>Lucena-Aguilar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+source+selection+for+downstream+applications+based+on+dna+quality+indicators+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biopreservation+and+Biobanking%22%5BJournal%5D)">DNA source selection for downstream applications based on dna quality indicators analysis.</a> Biopreservation and Biobanking. 14 (4), 264-270 (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 다른 곤충 종에 맞게 조정할 수 있다. Nieman 외1에 도입 된 프로토콜의원래 버전은 Aedes aegypti, Ae. busckii, Ae. taeniorhynchus, 아노펠레스 아라비엔시스, An. coluzzii, An. coustani, An. darlingi, An. funestus, An. gambiae, An. quadriannulatus, An. rufipes, Culex pipiens, Cx. quinquefasciatus, Cx. theileri, Drosophila suzukii, Chrysomela aeneicollis Tutaabluta, 및 Kepereria,90. 이 프로...

최근 개선된 DNA 추출 프로토콜1의 개발로 전체 게놈 시퀀싱2,3,4,5,6을포함하는 많은 고충격 다운스트림 연구를허용하고있다. 이 자기 비드 기반 DNA 추출 프로토콜은 개별 모기 샘플에서 신뢰할 수있는 DNA 수율을 제공하므로 필드 수집에서 충분한 수의 샘플을 획득하는 데 드는 비용과 시간을 줄입니다.
인구와 조경 유전체학의 최근 발전은 전체 게놈 시퀀싱의 비용 감소와 직접적으로 상관관계가 있습니다. 이전 DNA 추출 프로토콜1은 높은 처리량 시퀀싱과 관련된 효율성을 증가하지만, 자금이없는 작은 실험실 / 연구는 프로토콜 (예를 들어, 특수 기기의 비용)을 구현하는 비용으로 인해 이러한 새로운 강력한 풍경 및 인구 유전체 학 도구를 사용하지 않을 수 있습니다.
여기서, 수정된 DNA 추출 프로토콜은 Neiman외. 1과 유사한 자기 비드 추출 단계를 사용하여 고순도 DNA를 얻지만 조직 용해 및 DNA 추출을 위한 고비용 기기에 의존하지 않는다는 것을 제시한다. 이 프로토콜은 고품질 DNA의 >10 ng를 요구하는 실험에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>AE 버퍼</td><td>Qiagen</td><td>19077</td><td>용리 버퍼</td></tr><tr><td>AL 버퍼</td><td>Qiagen</td><td>19075</td><td>용해 버퍼</td></tr><tr><td>AW1 버퍼</td><td>Qiagen</td><td>19081</td><td>세척 버퍼 1</td></tr><tr><td>AW2 버퍼</td><td>Qiagen</td><td>19072</td><td>세척 버퍼 2</td></tr><tr><td>MagAttract 서스펜션 G</td><td>Qiagen</td><td>1026901</td><td>마그네틱 비드</td></tr><tr><td>마그네틱 비드 분리기</td><td>Epigentek</td><td>Q10002-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>ThermoFisher</td><td>ND-2000</td><td>미량 분광 광도계</td></tr><tr><td>PK 버퍼</td><td>ThermoFisher</td><td>4489111</td><td>단백질 분해 효소 K 완충</td></tr><tr><td>단백질 분해 효소 K</td><td>ThermoFisher</td><td>A25561</td><td></td></tr><tr><td>Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>형광 분석기</td></tr></tbody></table>

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 dna 추출 프로토콜

A Magnetic-Bead-Based Mosquito DNA Extraction Protocol for Next-Generation Sequencing

마그네틱 비즈와 자동화된 DNA 추출 기기를 사용하여 최근에 발표된 DNA 추출 프로토콜은 다운스트림 전체 게놈 시퀀싱에 충분한 잘 보존된 개별 모기로부터 고품질 및 수량 DNA를 추출할 수 있음을 시사했습니다. 그러나 고가의 자동화 된 DNA 추출 기기에 대한 의존은 많은 실험실에서 금지 될 수 있습니다. 여기서, 연구 결과는 저중간 처리량에 적합한 예산 친화적인 자기 비드 기지를 둔 DNA 추출 프로토콜을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 Aedes aegypti 모기 견본을 사용하여 성공적으로 시험되었습니다. 고품질 DNA 추출과 관련된 비용 절감은 자원 제한된 실험실 및 연구에 높은 처리량 시퀀싱의 적용을 증가시킬 것이다.

개별 모기 헤드/흉부 조직당 평균 DNA 수율은 용출 버퍼 100μL을 사용하여 용출할 때 형광계를 사용하여 측정된 4.121 ng/μL(N= 92, 표준 편차 3.513)이었다. 이는 전체 게놈 라이브러리 시공1,7에필요한 10-30 ng 게놈 DNA 입력 요구 사항에 충분합니다. DNA의 양은 모기 체 크기와 보존 조건에 따라 0.3-29.7 ng/μL 사이에서 다를 수 있습니다. 높은 가변성 중 일부는 연구에 사용되는 자기 구슬의 특성 때문입니다. 자기 구슬의 다른 브랜드는 이전 보고서1에표시된 바와 같이, 더 일관된 농도를 생성 할 수 있습니다. 그것은 또한 다른 모기 종 크기가 다르고 DNA 수율은 그 개별 및 종 크기 범위에 의존한다는 것을 주의해야 합니다. DNA 농도가 일반적인 범위 이하인 경우, 단백질Ae K 반응(step 2.7)에서 잠복기를 조정할 수 있지만, 이...

여기에 설명된 DNA 추출 프로토콜은 모기에서 고품질의 DNA 추출을 생성하기 위하여 자기 구슬을 사용하여 입니다. 이러한 추출은 다운스트림 차세대 시퀀싱 접근 방식에 적합합니다.

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

A recently published DNA extraction protocol using magnetic beads and an automated DNA extraction instrument suggested that it is possible to extract high ...

이 예산 친화적 인 자기 비드 기반 DNA 추출 프로토콜은 자원 제한된 실험실 및 연구에 액세스 할 수있는 높은 처리량 시퀀싱을 합니다. 이 프로토콜은 고품질 DNA 추출을 위한 고가의 장비를 필요로 하지 않으며 높은 처리량 시퀀싱을 위한 질로 충분한 양의 DNA를 얻는 것이 어려운 특정 진단 또는 연구 상황에서 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 일회성 데모로 쉽게 복제할 수 있습니다.워크플로에 익숙해지려면 먼저 소수의 샘플로 시도해야 합니다. 우선, PCR 급수 의 100 마이크로리터를 추가하고 조직을 부드럽게하기 위해 섭씨 4도에서 1 시간 동안 배양하여 70 % 이상의 알코올에 저장된 모기 조직 샘플을 수화하십시오. 인큐베이션 후 물을 버리고 100 마이크로리터의 Proteinase K 완충 효소 믹스를 추가합니다.그런 다음 마이크로 원심 분리기 튜브유봉을 사용하여 조직을 균질화하십시오. 균질화 후, 원심분리하고 56섭씨에서 2~3시간 동안 조직을 용해시키고 배양한다. DNA를 추출하기 위해 조직의 파이펫 100 마이크로리터가 새로운 깨끗한 미세 원심 분리튜브로 분해됩니다.그런 다음 마그네틱 비드 마스터 믹스의 215 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫을 사용하여 용액과 마그네틱 구슬 혼합물을 10~20초 동안 섞은 다음 실온에서 10분 동안 방치합니다. 잠복하는 동안, 부드럽게 자기 구슬에 DNA의 결합을 극대화하기 위해 때때로 튜브를 흔들어.다음으로, 용액이 명확해질 때까지 자기 비드 분리기 위에 튜브를 놓습니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 DNA를 들고 있는 자기 구슬을 방해하지 않고 튜브에서 액체를 부드럽게 흡인시합니다. 마그네틱 비드 분리기에서 튜브를 멀리 이동하고 세척 버퍼 1의 325 마이크로 리터를 추가하여 구슬을 씻어.피펫팅으로 철저히 섞고 실온에서 1분간 배양합니다. 인큐베이션 후, 튜브를 마그네틱 비드 분리기 위에 놓고 이전에 설명한 대로 상체를 제거한 다음, 자기 비드 분리기에서 튜브를 멀리 이동시키고 완충액으로 한 번 구슬을 세척합니다. 완충1로 두 번째 세척 후, 250 마이크로리터의 세탁 버퍼 2개로 구슬을 두 번 씻는다.마지막 세척 후, 자기 비드 분리기에서 멀리 튜브를 이동하고 용출 버퍼의 100 마이크로 리터를 추가합니다. 파이펫팅으로 철저히 섞은 다음 실온에서 2분 동안 튜브를 배양한 다음 마그네틱 분리기위에 다시 놓습니다. 용액이 명확해지면 상체를 새롭고 깨끗한 0.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브로 옮기고 적절하게 보관하십시오.0.5 밀리몰러 EDTA를 함유하는 용출 완충제에서 모기 DNA의 전형적인 마이크로볼륨 형광계 판독으로 여기에 도시되었다. 평균 260 ~ 280 나노미터 흡광도 비는 2.3이다. 이 표는 다른 추출 방법에 대해 하루 동안 처리된 샘플의 비용과 수를 보여 주어 있습니다.이 프로토콜에 의한 추출에 대한 일반적인 시약 및 소모품 비용은 샘플당 약 9.50입니다. 이 비용은 일반적인 자기 비드 기반 추출 방법과 동일합니다. 이 프로토콜의 주요 비용 이점은 자동화 된 DNA 추출 기기를 필요로하지 에서 비롯됩니다.여러 샘플로 작업할 때 DNA의 교차 오염을 방지하기 위해 샘플 간에 파이펫 팁을 변경해야 합니다. 우리는 전체 게놈 시퀀싱을 위해이 방법을 사용하여 추출 된 고품질의 DNA를 사용합니다. 우리는 현재 공중 보건 및 질병 통제에 있는 우려의 살충제 저항 또는 면역 유전자에 있는 새로운 돌연변이를 확인하기 위하여 시퀀싱 데이터를 사용하고 있습니다.높은 처리량 시퀀싱을 위한 적당한 해결책을 갖는 것은 많은 새로운 유전 통제 전략의 성공에 영향을 미치는 모기 분산및 유전자 흐름을 이해하기 위한 인구 유전체학 및 조경 유전체학을 위한 흥미진진한 문을 엽니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

모기 표본의 품질 말라리아 기생충 및 벡터 DNA를 추출 할 수 신속하고 저렴한 방법은 설명되어 있습니다. 간단한 방법은 모기 중간 창자와 침샘 단계에서 말라리아 기생충의 genotyping,뿐만 아니라의 분자 식별, Chelex 수지의 킬레이트 특성에 수 대문자로...

에서 DNA 추출을위한 간단한 Chelex 프로토콜<em&gt; 아노펠레스</em&gt; 종.

ribosomal RNA (rRNA) 고갈 프로토콜은 모기 내장 metatranscriptome의 RNA-seq를위한 메신저 RNA를 (mRNA) 풍부하게하기 위해 개발되었습니다. 뺄셈을 통해 rRNA를 제거하는 데 사용 된 샘플 특정 rRNA 프로브은, 모기와 내장 미생물에서 만들어졌습니다. 프로토콜의 성능은 rRNA의 약 90~99%의 삭제 될 수 있습니다.

모기 내장 Metagenomic RNA-seq에 대한 Ribosomal RNA의 고갈

염색체 페인팅은 세포 핵의 조직과 카요타입의 진화를 연구하는 데 유용한 방법입니다. 여기서, 우리는 이후 시상 혼성화(FISH)에서 2차원 및 3차원 형광에 사용되는 단일 폴리텐 염색체로부터 관심 있는 특정 영역을 분리하고 증폭시키는 접근법을 시연한다.

말라리아 모기의 2D 및 3D 염색체 페인팅

유전자 발현, 돌연변이 및 유전자 융합에 대해 선택된 전사체를 조사하기 위한 데이터 분석을 사용한 색인화된 cDNA 라이브러리 준비, 혼성화 및 캡처를 포함하는 표적 RNA 염기서열분석 기반 방법을 설명합니다. Targeted RNAseq를 사용하면 데스크톱 염기서열분석기에서 선택된 전사체를 비용 효율적이고 신속하게 평가할 수 있습니다.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

Nanopore 시퀀싱 생체에 대 한 기술, 생명 과학, 병원 균, 식품 안전 모니터링, 게놈 분석, metagenomic 환경 모니터링 및 박테리아의 특성의 식별을 포함 하 여 넓은 응용 프로그램에 항 생 저항입니다. 이 문서에서는, metagenomic 토양 DNA 연속 nanopore 시퀀싱 기술을 사용 하 여 종 식별을 위한 절차는 보여 줍니다.

Metagenomic 토양 분석 Nanopore DNA 시퀀싱

여기, 우리는 토양, rhizosphere, 및 루트 endosphere microbiomes amplicon 시퀀스 데이터를 얻기 위해 프로토콜을 설명 합니다. 이 정보 구성 및 플랜트 관련 미생물 커뮤니티의 다양성을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 다양 한 종의 식물 사용에 적합.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

여기에 설명된 16S rRNA 메타게놈 시퀀싱 및 자유롭게 사용할 수 있는 도구를 사용하여 분석하는 미생물군유전체 프로파일링을 위한 간소화된 표준 작동 절차입니다. 이 프로토콜은 미생물군유전체 분야를 새로운 연구자뿐만 아니라 더 높은 해상도에서 박테리아 프로파일링을 달성하기 위한 방법에 대한 업데이트를 요구하는 연구자들에게 도움이 될 것입니다.

2단계 PCR 및 차세대 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 사용한 미생물 분석

이 프로토콜은 gRNA 유도 Cas9 분열 및 DNA 수리 에 따른 표적 부위에서 비균성 최종 결합(NHEJ) 이벤트의 식별 및 정량화를 위한 분석을 포함하여 디지털 물방울 PCR(ddPCR)에 대한 실험용 설정에 DNA 추출에서 단계를 제공합니다. 이 방법의 그밖 용도는 다형성 검출 및 유전자 편집 이체 확인과 같은 응용을 포함합니다.

유전자 변형 된 Anopheline 모기 인구에서 인델 돌연변이를 감지하는 디지털 물방울 PCR

이 문서에서는 CRISPR/Cas9에 의해 유도된 인델의 신속한 식별을 위한 프로토콜과 고해상도 용융 분석을 사용하여 모기 Aedes aegypti 의 돌연변이 라인을 선택하는 것에 대해 자세히 설명합니다.

모기 Aedes aegypti에서 고해상도 용융 분석을 사용하여 CRISPR/ Cas9 돌연변이 발생 에 따른 인델 검출

이 프로토콜은 DNA 캡처 비드 정제와 결합된 비드 박팅이 Mycobacterium tuberculosis 샘플에서 DNA를 추출하기 위한 빠르고 일관된 방법을 제공하여 차세대 염기서열분석 응용 분야에 효과적인 선택임을 보여줍니다.

맞춤형 버퍼에서 비드 박동을 사용한 Mycobacterial DNA 추출 후 NGS 워크플로우

Mycobacterium tuberculosis의 다운스트림 표적 차세대 염기서열분석을 위해 마그네틱 비드 정제와 결합된 매트릭스 기반 추출 방법을 사용하여 오염이 제거된 객담에서 DNA를 추출하기 위한 최적화된 방법을 제시합니다.

오염이 제거된 객담 샘플에 대한 표적 차세대 염기서열분석을 위한 매트릭스 기반 DNA 추출

배우세요 자기 비드 기반 DNA 추출법으로 Aedes aegypti 모기에서 고품질 DNA를 분리하는 방법입니다. 이 프로토콜은 비용이 저렴하여 자원이 제한된 연구실에서도 차세대 시퀀싱을 수행할 수 있습니다.

차세대 시퀀싱을 위한 자기 비드 기반 모기 DNA 추출 프로토콜

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