Name: 온도 제어 어셈블리 및 방울 인터페이스 Bilayer의 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 11 s
Description: 배우세요 온도 제어 장치를 이용한 방울 인터페이스 이중막(DIB) 형성 및 특성화 방법을. 고융점 지질과 천연 세포 추출물을 활용하여 생체모사 막의 온도 의존적 특성을 정밀하게 분석할 수 있습니다.

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재정 지원은 국립 과학 재단 그랜트 CBET-1752197및 과학 연구 보조금 FA9550-19-1-0213의 공군 사무실에 의해 제공되었다.

저자는 이해 관계의 충돌이 없습니다.

본 명세서에 기재된 프로토콜은 DIB를 형성하는 데 사용되는 오일 및 물방울의 온도를 제어하기 위해 실험 시스템을 조립하고 운영하기 위한 지침을 제공한다. 특히 RT 이상의 온도가 녹는 지질을 사용하여 DIB 형성을 가능하게 하는 데 특히 유용합니다. 더욱이, 오일 저수지의 온도를 정밀하게 변화시킴으로써, 이중층 온도는 커패시턴스, 면적, 두께, 유도된 열tropic 상 변화, 막 활성 종의 운동, 및 이중층인터페이스(37,38)의정력성을 포함한 다양한 멤브레인 특성 및 특성에 대한 높은 온도의 영향을 연구하기 위해 조작될 수 있다.
프로토콜은 DIB 연구에서 사용하기 전에 세 부분으로 구성됩니다: 1) 가열된 단계 기구의 준비 및 조립; 2) 다양한 악기를 연결; 및 3) 선택한 비례 및 일체형 제어 이득으로 적절한 온도 제어 성능을 확인합니다. 2부에서 가장 중요한 경우 ...

세포막은 모든 살아있는 세포를 캡슐화하고 세분화하는 수천 가지 지질 유형1,단백질, 탄수화물 및 스테롤로 구성된 선택적으로 투과성 장벽입니다. 그들의 구성이 그들의 기능에 어떻게 영향을 미치는지 이해하고 자연 및 합성 분자가 세포막과 상호 작용, 준수, 중단 및 배할당하는 방법을 밝히는 방법, 따라서 생물학, 의학, 화학, 물리학 및 재료 공학에 광범위한 영향을 미치는 연구의 중요한 영역입니다.
이러한 발견을 목표로 하는 목적은 세포 측의 구성, 구조 및 운송 특성을 모방한 합성 또는 자연발생 지질에서 조립된 지질 이중층을 포함하여 모델 멤브레인을 조립, 조작 및 연구하기 위한 입증된 기술의 직접적인 이점을 누릴 수 있습니다. 최근에는, 액적 인터페이스 바이레이어(DIB) 방법2,3,4는 지질 코팅물 양적물 사이의 평면 지질 이중층을 생성하기 위한것으로, 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18, 19,20,21,22,23,모델 멤브레인 형성을 위한 다른 접근법에 비해 실질적인 이점을 입증하였다: DIB 방법은 수행하기 가 간단하다. 정교한 제작이나 준비가 필요하지 않습니다(예: 멤브레인을 지원하는 기판의 "페인팅") 지속적으로 우수한 멤브레인을 산출 수명은 표준 전기 생리학 측정을 허용하며 비대칭 전단지조성물 3로모델 멤브레인의 형성을 단순화합니다. 이중 레이어는 물방울과 각 방울 사이에 자발적으로 형성되기 때문에 위치와 메이크업에 맞게 조정할 수 있습니다. DIB 기술은 또한 자극 반응형 멤브레인18,24,25,26,27, 28,29,균형 잡힌 구획화 및 수송14,30,31,및 조직형 재료17,23,32,33, 33,35, 35,35의사용에 기반한 세포에서 영감을 받은 재료 시스템 개발에 상당한 관심을 모으고있다.
DIB를 가진 사람들을 포함하여 모형 막에 간행된 실험의 대다수는, 실온에서 수행되었습니다 (RT, 20-25°C) 및 합성 지질의 소수와 (예를 들면, DOPC, DPhPC 등). 이 사례는 모형 막에서 공부될 수 있는 생물물리학적인 질문의 범위를 제한하고, 관찰에 근거하여, 또한 DIB를 조립하기 위하여 이용될 수 있는 지질의 모형을 제한할 수 있습니다. 예를 들어, 42°C의 용융 온도를 가지는 DPPC와 같은 합성 지질은 RT37에서단단히 포장된 단층층을 조립하거나 DIB를 형성하지 않는다. 실온에서 DIB 형성은 또한 포유류(예를 들어, 뇌 총 지질 추출물, BTLE)38 또는 박테리아(예를 들어, 에체리치아 대장균 총 지질 추출물, ETLE) 37, 높은 온도(37°C)에 상주하는 세포에서 유래하는 천연 추출물(예를 들어, 뇌 총 지질 추출물, BTLE)37과같은 천연 추출물에 대해도 어렵다는 것이 입증되었습니다. 따라서 다양한 조성물의 연구를 가능하게 하면 생물학적으로 관련된 조건에서 막 매개 공정을 이해할 수 있는 기회를 제공합니다.
오일의 온도를 올리는 것은 두 가지 목적을 제공 할 수 있습니다 : 그것은 단층 조립의 운동을 증가하고 지질이 액체 무질서한 단계에 도달하기 위해 용융 전환을 겪을 수 있습니다. 두 결과 모두 DIB의 전제 조건인 단층어셈블리(39)에도움이 됩니다. 이중층 형성을 위한 가열 이외에, 형성 후 멤브레인을 냉각시켜 열량계를 사용하여 검출하기 어려울 수 있는 천연 지질 혼합물(예를 들어, BTLE)을 포함하여 단일 지질이중층(38)에서열tropic 전이를 식별하는 데 사용될 수 있다. 지질의 열Tropic 전이를 평가하는 것 외에도, DIB의 온도를 정확하게 변화하여 막구조(38)의 온도 유발 변화를 연구하고 지질 조성 및 유동성이 막 활성 종의 운동(예를 들어, 모공 형성 펩타이드 및 트랜스멤브레인 단백질37)의운동에 어떤 영향을 미치는지 검사할 수 있다.37), 포유동물 및 세균성 모델 멤브레인을 포함하는 포유류 및 세균성 모델 멤브레인(37).
본 명세서에서는, 수정된 DIB 오일 저장소를 조립하고 피드백 온도 컨트롤러를 작동시켜 RT보다 높은 온도에서 단층 조립 및 이중층 형성을 가능하게 하는 방법에 대한 설명이 설명될 것이다. 이전프로토콜(40)과구별되는, 오일 저수지내DIB의 조립 및 특성화에 병행하여 온도를 측정하고 제어하는 데 필요한 계측의 통합에 관한 명시적 세부 사항이 포함되어 있다. 따라서 이 절차를 통해 사용자는 다양한 과학적 맥락에서 다양한 온도에서 DIB를 형성하고 연구하기 위한 이 방법을 적용할 수 있습니다. 더욱이, 대표적인 결과는 온도가 다양함에 따라 발생할 수 있는 멤브레인 구조와 이온 수송 모두에서 측정 가능한 변화의 유형에 대한 구체적인 예를 제공한다. 이러한 기술은 다른 막 조성에서 막 활성 종의 운동학을 연구하는 것을 포함하여 DIBs에서 효과적으로 설계및 수행 될 수있는 많은 생물 물리학 연구에 중요한 추가입니다.

<table><tbody><tr><td>25mm x 40mm x 1mm 절연 고무(x2)</td><td>Any</td><td></td><td>는 현미경의 스테이지에서 알루미늄 고정 장치의 바닥을 절연</td></tr>합니다.<tr><td>25mm x 40mm x 6mm 절연 고무(x2)</td><td>Any</td><td></td><td>는 현미경에 의해 발열체가 손상되지 않도록 보호하고, 스테이지는 발열체 상단을 클립하고 절연합니다.</td></tr><tr><td>3-(N-모르폴리노) 프로판설폰산&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3183</td><td>지질 용액용 완충제</td></tr><tr><td>아크릴 기판</td><td>HTD_STG_2</td><td>~1000 uL 아크릴 우물에서 제작되었으며, 포카 요크 외부 프로필이 있어 방향을 고정합니다</td><td></td></tr><tr><td>. 알루미늄 조명기구</td><td>는 집에서 제작</td><td>되었으며,</td><td>오일웰이 아실릭 조명기구를 보유하고 있으며, 오일 웰에 인접한 두 개의 평평한 패드를 포함하여 발열체를 위한 HTD_STG_1 베이스 조명기구입니다.</td></tr><tr><td>Brain Total Lipid Extract</td><td>Avanti</td><td>131101C-100mg</td><td>25 mg/mL 돼지 지질 추출물&nbsp;</td></tr><tr><td>컴팩트 DAQ 섀시 (cDAQ)</td><td>National Instruments&nbsp;</td><td>cDAQ-9174&nbsp;</td><td>여러 유형의 센서 측정 또는 출력 모듈을 수용하는 섀시</td></tr><tr><td>데이터 수집 시스템(DAQ)</td><td>분자 소자&nbsp;</td><td>디지데이터 1440A&nbsp;</td><td>고해상도 아날로그-디지털 변환기</td></tr><tr><td>고정 이득 증폭기/전원 공급 장치</td><td>Hewlitt Packard</td><td>HP 6826A</td><td>는 전압 출력 모듈인</td></tr><tr><td>Glass Cover Slip</td><td>Corning</td><td>CLS284525</td><td>알루미늄 베이스의 바닥을 밀봉하고 이중층의 광학적 특성을 가능하게 합니다.</td></tr><tr><td>발열체 (x2)</td><td>Omega</td><td>KHLV-101/5</td><td>25 mm x 25 mm 폴리미드 필름 Kapton 발열체는 5 와트 전력 제한이 있습니다.</td></tr><tr><td>M3 스테인레스 스틸 스크류</td><td>McMaster Carr</td><td>90116A150</td>은 <td>알루미늄 조명기구에 열전대를 고정</td></tr>합니다. 패치 <tr><td>클램프 증폭기</td><td>분자 장치&nbsp;</td><td>액소패치 200B&nbsp;</td><td>전류를 측정하고 전압을 헤드스테이지로 출력</td></tr><tr><td>개인용 컴퓨터</td><td>다중 고속 USB 포트와 최소 6 Gb의 램이 있는</td><td>모든</td><td></td> 컴퓨터</tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마 알드리치</td><td>P3911</td><td>해리 이온의 전해질 용액</td></tr><tr><td>온도 입력 모듈</td><td>National Instruments&nbsp;</td><td>NI 9211</td>은 <td>cDAQ 섀시</td></tr><tr><td>열전대</td><td>Omega</td><td>JMTSS-020U-6&nbsp;</td><td>직경이 0.02인치이고 길이가 6인치인 U형 열전대</td></tr><tr><td>UV 경화성 접착제</td><td>Loctite</td><td>19739</td>는 <td>유리 커버슬립을 알루미늄 베이스 조명기구에 고정합니다.</td></tr><tr><td>전압 출력 모듈</td><td>National Instruments&nbsp;</td>cDAQ 섀시 웨이브폼 생성기 Agilent 33210A와 함께 사용하기 위한 <td>NI 9263</td><td>아날로그 전압 출력 모듈</td></tr><tr><td></td><td></td><td>&nbsp;</td><td>10mV 10Hz 정현파 파형을 출력하는 데 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

온도 제어 어셈블리 및 방울 인터페이스 bilayer의 특성화

Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer

지질 코팅 수성 물방울 사이에 지질 이중층(즉, DIBs)을 조립하는 물방울 인터페이스 바이레이어(DIB) 방법은 다른 방법에 비해 주요 이점을 제공합니다: DIB는 안정적이고 종종 오래 지속되며, 이중층 영역은 가역적으로 튜닝될 수 있으며, 리플렛 비대칭은 방울 조성물을 통해 용이하게 조절되고, 양층과 같은 많은 양층 네트워크와 같은 양층 렌즈에 의해 용이하게 제어된다. DIB를 형성하려면 물방울 표면의 고밀도 지질 단층으로 지질의 자발적인 조립이 필요합니다. 이것은 일반적인 합성 지질을 위한 실온에서 쉽게 생기는 동안, 충분한 단층 또는 안정한 이중층은 몇몇 세포 지질 추출물을 포함하여 실온 위의 융점을 가진 지질을 위한 유사한 조건에서 형성하는 것을 실패합니다. 이 행동은 모형 막 연구 결과에서 DIBs의 조성 및 아마 생물학 관련성 -를 제한했습니다. 이 문제를 해결하기 위해 DIB 방울을 호스팅하는 오일 저장소를 조심스럽게 가열하고 지질 막에 온도가 미치는 영향을 특성화하기 위해 실험 프로토콜이 제공됩니다. 특히, 이 프로토콜은 피드백 루프에 의해 제어되는 열 전도성 알루미늄 기구 및 저항 가열 원소를 사용하여 더 넓은 지질 유형에 대한 단층 조립 및 이중층 형성을 향상시키는 높은 온도를 처방하는 방법을 보여줍니다. 멤브레인의 구조적 특성뿐만 아니라 이중층을 포함하는 지질의 열TROPIC 상 전이는 DIB의 전기 커패시턴스의 변화를 측정하여 정량화된다. 이 절차는 다중 성분 지질 혼합물에 대한 효과적인 용융온도(TM)를결정하는 것을 포함하여 다양한 온도에 걸쳐 모델 멤브레인에서 생물 물리 학적 현상을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기능은 따라서 모형 막에 있는 자연적인 위상 전이의 더 가깝게 복제하고 더 나은 그들의 세포 대조물의 이질성을 포착하는 것을 포함하여 막 성분의 더 넓은 swath에서 모형 막의 형성 그리고 사용을 격려할 것입니다.

도 1은 알루미늄 설비 및 아크릴 오일 저장소가 DIB 형성을 위한 현미경 단계에서 어떻게 제조되는지를 보여줍니다. 조립 단계 1.2-1.4는 보다 효율적인 가열을 위해 단계에서 설비를 열로 절연하는 역할을 합니다. 1.5-1.7 단계는 열전대를 고정장치에 올바르게 부착하고 오일 저장소를 배치하는 방법을 보여주며, 1.8 -1.9 단계는 이 조각에 오일을 분배하는 데 권장되는 위치를 보여줍니다.
도 2는 피드백 온도 제어를 설정하고 DIB에서 전기 측정을 수행하는 데 사용되는 구성 요소를 간략하게 설명합니다: PC, 고정 게인 전력 증폭기, 패치 클램프 증폭기 및 DAQ 시스템(또는 전압을 적용하고 pA-nA 레벨 전류를 측정하기 위한 동등한 기기), 적절한 아날로그 입력 및 출력을 갖춘 두 번째 DAQ, 파형 발전기, 조립된 알루미늄 기구. DAQ-2는 두 개의<stron...

이 프로토콜은 높은 용융 온도와 지질에 대한 지질 단층 조립 및 방울 인터페이스 이중 층 형성을 촉진하기 위해 피드백 온도 제어 가열 시스템의 사용을 자세히 설명, 멤브레인의 온도 중심변화를 특성화하는 커패시턴스 측정.

온도 제어 어셈블리 및 방울 인터페이스 Bilayer의 특성화

The droplet interface bilayer (DIB) method for assembling lipid bilayers (i.e., DIBs) between lipid-coated aqueous droplets in oil offers key benefits ...

이 프로토콜을 통해 연구자들은 물방울 인터페이스 이중 레이어 또는 모델 멤브레인을 정확하게 가열할 수 있으므로 셀룰러 환경에서 발생하는 다양한 온도 관련 효과를 연구할 수 있습니다. 핵심 장점은 DIB의 전기 또는 광학 특성에 대한 액세스를 방해하지 않고 저용량 저수지에서 목욕 온도를 현지에서 측정하고 제어하는 기능에서 비롯됩니다. 유체 목욕을 정밀하게 가열하는 능력은 천연 세포 추출물을 포함하여 훨씬 더 다양한 막 성분에서 형성된 DIB의 운송 및 신호 특성을 연구할 수 있는 가능성을 열어주습니다.이것은 충분한 실험 적 정확성을 달성하기 위해 밀접하게 따라야하는 여러 장비를 활용하는 다단계 프로토콜이므로 서면 프로세스의 모호성을 시각적 데모를 통해 명확히 할 수 있습니다. 길이 25x 40mm로 트리밍된 1mm 두께의 절연 고무 2개, 25x 40mm의 6mm 두께 고무 2개, 준비된 알루미늄 베이스 설비 어셈블리, 알루미늄 베이스 설비의 관측 창에 맞는 아크릴 오일 저장소 2개를 모으기 시작합니다. 각 조각의 긴 가장자리가 무대 개구부에 접선될 정도로 더 얇은 고무 조각을 현미경의 무대에 놓습니다.알루미늄 베이스 설비를 절연 패드 위에 배치하여 목적 렌즈 위에 고정물의 시야 창을 배치합니다. 각 저항 가열 요소 위에 두꺼운 고무 조각을 배치한 다음 현미경 스테이지 클립을 사용하여 스테이지 클립으로 인한 손상으로부터 가열 요소를 보호하고 우발적 인 전기 단락으로부터 절연합니다. 열전대의 측정 끝을 조심스럽게 구부려 끝에서 약 4밀리미터에서 90도 각도를 달성합니다.열전대의 구부러진 끝을 알루미늄 설비의 왼쪽 아래 모서리에 삽입하고 잠금 나사로 부드럽게 고정합니다. 아크릴 저수지를 알루미늄 설비의 우물에 넣은 후 알루미늄 설비의 우물에 헥사데카네 오일을 첨가하여 아크릴 저수지의 관측 창과 바닥 사이에 기포가 포획될 위험을 최소화합니다. 약 1, 000 마이크로리터의 헥사데카네 오일을 알루미늄 설비의 우물에 분배하여 오일이 현미경 단계 또는 객관적 렌즈에 고정물의 가장자리를 통해 유출되는 것을 허용하지 않는 동안 열 전달을 위한 최대 표면적을 제공합니다.육사데카네 오일의 약 1, 000 마이크로리터를 과다 채우지 않고 아크릴 저수지에 분배합니다. 멤브레인지질의 열tropic 상 전이를 식별 하기 위해 이중 층 형성을 허용 하는 설정 된 지점에서 오일 목욕의 온도를 낮추는 동안 멤브레인의 명목 커패시턴스를 측정 합니다. GUI의 온도 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 디스플레이 데이터를 지우면 버퍼의 충분한 공간을 후속 레코딩에 사용할 수 있도록 합니다.패치 클램프 증폭기에 연결된 파형 발생기를 사용하여, 액적 인터페이스 바이레이어 또는 DIB, 전극에 걸쳐 삼각형 전압 파형을 적용하고 바이레이어를 통해 유도된 전류 응답을 기록한다. 원하는 온도가 달성될 때까지 온도 변화 사이의 새로운 정상 상태 온도에서 최소 5분을 기다리며 설정점 온도를 5도 단위로 줄임으로써 이중층을 냉각시킵니다. 오일 목욕후 바이레이어를 원하는 최소 온도로 냉각한 후 GUI의 온도 그래프를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 온도 데이터와 시간 대 스프레드시트 소프트웨어를 내보냅니다.현재 레코딩을 중지합니다. 측정된 전류로부터, 냉각 기간 동안 제곱파 전류 응답의 공칭 커패시턴스를 계산한다. 명목 커패시턴스와 온도를 플롯하여 멤브레인 커패시턴스가 어떻게 변했는지 관찰한 다음, 온도 대비 커패시턴스의 비단색 변화를 찾아 용융 온도를 식별합니다.마찬가지로, 오일 목욕과 이중층 영역의 온도를 연속적으로 증가시킴으로써 고정 된 온도에서 이중 층의 준 정적 특정 커패시턴스를 평가합니다. GUI를 사용하여 섭씨 10도 단위로 설정점 온도를 변경하고 시스템이 새 온도에 평형화할 수 있도록 합니다. 이전에 설명한 단계를 수행하여 정전 용량 전류 및 기록 의 측정을 시작합니다.마이크로 조작기의 위치를 신중하게 조정하여 이중 레이어 영역을 변경합니다. 제곱파 전류가 일정한 상태 진폭에 도달하고 DIB의 이미지를 수집하여 멤브레인 영역과 시간 대비 멤브레인 영역의 계산을 가능하게 합니다. 현미경에 장착된 카메라를 사용하여 조리개에서 볼 수 있는 바이레이어를 이미지화합니다.동시에 현재 레코딩 소프트웨어에 디지털 태그를 추가하여 이미지 수집에 해당하는 시간 지점을 표시합니다. 총 5개의 DIB 이미지와 이중층 전류의 정상 상태 영역을 얻은 다음 온도를 재설정하고 이미징을 반복합니다. 현재 레코딩 및 DIB 이미지를 정상 상태 이중 레이어 영역에 대응하는 태그된 시간 지점에서 분석하고 각 온도에 대해 쌍층 커패시턴스 및 영역을 추출합니다.각 온도에 대해 커패시턴스 대 영역을 플롯하고 각 온도에서 이중 레이어의 특정 커패시턴스를 나타내는 첫 번째 순서 회귀의 경사를 계산합니다. 그런 다음 특정 정전 용량과 해당 온도의 값을 플롯합니다. 비단색 변이에 대한 특정 커패시턴스와 온도 데이터를 검사하여 용융 온도를 식별합니다.이중 계층에 걸쳐 DC 전압 스텝 입력을 생성하여 전압 의존 이온 채널 형성의 역학을 평가합니다. 초기 전압을 밀리볼트로 원하는 스텝 값으로 설정하고 최종 전압 및 스텝 크기를 원하는 단계보다 높은 값으로 설정합니다. 단계 입력에 대해 원하는 지속 시간을 몇 초 만에 설정한 다음 단계 입력에 대해 원하는 극성을 선택합니다.패치 클램프 증폭기를 전환하여 실험실 뷰 또는 전압 출력 모듈에서 헤드 스테이지로 발생하는 명령 전압을 헤드 스테이지로 보내고, 전압을 켜고 유도된 전류 응답을 기록하여 중요한 전압에 대한 S자형 반응을 억제해야 합니다. 원하는 온도에서 멤브레인에 대한 동적 전류 전압 관계를 별도로 획득하여 이온 채널 동작과 같은 전압 의존관계를 드러냅니다. 파형 발생기에서 헤드 스테이지로 시작된 명령 전압을 헤드 스테이지로 전송하고 현재 레코딩을 시작하도록 패치 클램프 증폭기를 전환합니다.파형 발생기에서 원하는 진폭, 오프셋 및 주파수로 연속 부비동 파형을 출력합니다. 유도된 전류 응답을 하나 또는 여러 사이클에 걸쳐 기록하고 다른 죄파 진폭, 주파수 및 온도에 대해 원하는 대로 반복합니다. 온도 조절 시스템은 뇌 총 지질 추출물 또는 BTLE, 지질으로부터 형성된 DIB의 온도 의존성을 보여주기 위해 사용되었다.정전 용량 전류 및 온도 대 시간의 측정은 실온에서 약 60 °C까지 가열 사이클 동안 표시됩니다. 60°C에서 초기 이중층 형성 후 완전한 냉각/가열 사이클에 걸쳐 명목 커패시턴스와 온도의 변화가 문서화되었습니다. 다른 온도에서 특정 정전 용량의 준 정적 측정을 사용하여 지질 용융 온도를 식별할 수 있습니다.이중 레이어 대 이중 레이어 영역의 커패시션을 플로팅하면 경사가 특정 커패시턴스의 값을 나타내는 선형 회귀를 허용합니다. DIB 이미지는 온도가 용융 온도 보다 낮을 때, 멤브레인이 잘 분리된 전극으로 인한 연탄 방울의 장력 하에서도 매우 접착제 상태를 채택한다는 것을 보여줍니다. 표시된 전류 대 전압 추적은 부비동막 전압을 적용하여 얻어졌으며, 유도전류를 두 개의 다른 온도에서 측정하였다.화살표와 후속 숫자는 시간에 대한 부비동 압도 전압의 연속 분기를 시각화하는 데 도움이됩니다. 동일한 전압 수준에서 모나조마이신 도핑 BTLE 멤브레인에 대한 측정 된 전류 밀도와 두 개의 다른 온도가 여기에 표시됩니다. 육사데케인 오일을 알루미늄 설비의 우물에 올바르게 분배하는 것이 중요합니다.순서가 순서대로 수행되지 않거나 신중하게 수행되면 기포가 아크릴 아래에 잘 형성되어 DIB의 상향식 시야를 방해합니다. 또한 사용자는 전체 기록을 보장하기 위해 각 측정 전에 온도 제어 소프트웨어의 데이터 버퍼를 지우는 것을 기억해야 합니다. 이 절차는 멤브레인 구조 및 수송의 온도 의존성을 연구하는 데 필요한 다양한 온도에서 생체 모방 막을 특성화 할 수 있습니다.또한, 이 기능은 생물학적 이온 채널 및 엔지니어링 나노 물질과 같은 다른 막 활성 종의 나노 스케일 효과를 드러내는 데 사용될 수 있다.

temperature-controlled-assembly-characterization-droplet-interface

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

세균 mechanosensitive 채널은 생체 분자 장치에서 mechanoelectrical 트랜스 듀서로 사용할 수 있습니다. 물방울 인터페이스 이중층 (DIB의), 이러한 장치에 휴대 영감 빌딩 블록, 통합 및 mechanosensitive 채널을 자극하는 새로운 플랫폼을 나타냅니다. 여기서 우리는, DIB의 형성 기계적인 자극에서 mechanosensitive 채널의 연구를 허용하는 새로운 마이크로 피펫 기반 방법을 보여줍니다.

다기능, 물방울 인터페이스 이중층에서 세균 Mechanosensitive 이온 채널의 설립과 자극에 대한 방법을 마이크로 피펫 기반

우리는 보유, 수송 지질 이중층 형성 시스템을 보여준다. 냉동 막 전구체는 상온 상태로 전환하면 지질 이중층 막을 80 % 성공률 1 시간 내에 형성 될 수있다. 이 시스템은 이온 채널과 관련된 힘드는 과정과 전문​​ 지식을 줄일 수 있습니다.

폴리 디메틸 실록산 박막을 사용하여 자동화 지질 이중층 제막

유사분열 방추체의 조립 및 위치는 미세소관 역학, 운동 단백질 및 가교제에 의해 생성된 결합된 힘에 따라 달라집니다. 여기에서 우리는 구형 에멀젼 방울의 기하학적 구속이 기본 유사 분열 방추체의 상향식 재구성에 사용되는 최근에 개발 된 방법을 제시합니다.

구형 에멀젼 방울의 기본 유사 분열 스핀들의 재구성

우리는 유체 지질 이중층에 둘러싸여 나노 단백질 패치 유리를 기능화하는 프로토콜을 제시한다. 이 기판은 첨단 광학 현미경과 호환 및 세포 부착 및 이동 연구를위한 플랫폼 역할을 할 것으로 예상된다.

지원되는 지질 이중층에 리간드 나노 클러스터의 배열

여기, 선물이 연락처 거품 bilayer 메서드를 사용 하 여 지질 bilayers의 대형을 위한 프로토콜. 물 거품 물-오일 인터페이스에는 단층은 형성 하는 그것에 의하여, 유기 용 매에 불어 진다. 두 펫은 bilayer를 형성 하기 위하여 거품을 도킹 하려면 조작 됩니다.

패치-Clampers에 대 한 연락처 거품 Bilayers 지질 Bilayer 실험

프로토콜의 전반적인 목표는 세포 없는 단백질 합성에 사용될 수 있는 1cm2 평면 기판에 1백만 개 이상의 주문, 균일, 안정 및 생체 호환 펨토리터 물방울을 준비하는 것입니다.

단일 DNA 분자에서 대규모 병렬 단백질 합성을 위한 펨토리터 물방울 배열

우리는 구리 (II) 2,9,16,23 테트라 - 테르트 - 부틸 -29H,31H -phthalocyanine (CuPc) 분자와 지질 이중 층을 도핑하여 물 / 공기 인터페이스에서 하이브리드 지질 막을 생산하기위한 프로토콜을보고합니다. 그 결과 하이브리드 지질 막에는 지질/CuPc/지질 샌드위치 구조가 있습니다. 이 프로토콜은 또한 다른 기능성 나노 물질의 형성에 적용될 수 있다.

물/공기 인터페이스에서 소수성 유기 분자와 함께 도핑 하이브리드 지질 막의 자체 조립

이 프로토콜은 유니 지질 및 다중 지질 소포, 지원지질 이중층 및 일시 중단 된 지질 이중 층을 모방 하는 세포의 형성을 설명 합니다. 이러한 체외 모델은 다양한 지질 유형을 통합하도록 조정할 수 있으며 다양한 분자 및 거대 분자 상호 작용을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

여기에서는 단일 분자 전반사 형광(smTIRF) 현미경을 사용하여 인공 군집 지질 막에서 단일 분자의 결합, 이동성 및 조립을 수행하고 분석하는 프로토콜이 제시됩니다.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

여기에서는 수중수(water-in-oil) 에멀젼(플러그)의 조합 라이브러리를 생산하기 위한 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 이중층 장치의 제조를 소개합니다. 플러그 생산을 자동화하는 데 필요한 하드웨어 및 소프트웨어는 프로토콜에 자세히 설명되어 있으며 형광 플러그의 정량적 라이브러리 생산도 시연됩니다.

조합 플러그 생산을 위한 이중층 미세유체 장치

그라마시딘 A-도핑된 액상 계면 이중층을 조립, 전기자극, 분석하는 실험 프로토콜이 제시됩니다. 지질-단백질 구조-기능 관계는 막 면적, 이온 플럭스, 단일 채널 전도도 변화를 측정하고, 이러한 반응을 전기 시냅스에서 영감을 받은 막 모델에서 이온 전도의 가소성 유사 변화와 연관하여 정량화합니다.

액상 인터페이스 이중층을 이용한 지질-단백질 막 구조-기능 특성 분석

배우세요 온도 제어 장치를 이용한 방울 인터페이스 이중막(DIB) 형성 및 특성화 방법을. 고융점 지질과 천연 세포 추출물을 활용하여 생체모사 막의 온도 의존적 특성을 정밀하게 분석할 수 있습니다.

온도 제어 어셈블리 및 방울 인터페이스 Bilayer의 특성화

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