얇은 층 크로마토그래피에 의한 진균의 지질 조성 분석

진균 지질은 속의 중요한 특성이며 호스트 진균 상호 작용에서 중요합니다. 속도와 다재다능함은 이 절차의 주요 장점입니다. 이 방법은 지질의 역할과 진균의 병원성 및 면역 자극 효과를 이해하는 데 사용할 수 있습니다.

비 공유 연결 지질 추출의 경우, 라미나르 플로우 후드 아래에 PTFE 라이너 스크류 캡이 있는 유리 튜브에 메탄올 용액에 1~2개의 클로로폼15밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 고체 배지에서 균균의 200 밀리그램을 긁어 유리 튜브에 진균을 추가합니다. 일정한 교반으로 하룻밤 동안 튜브를 배양하십시오.

다음 날, 유리 튜브에 필터 종이 줄 지어 유리 깔때기를 통해 유기 용매를 필터링합니다. 질소 가스 플럭스를 사용한 후 튜브의 액체 상을 증발하고 튜브를 질소 가스로 채우고 튜브를 섭씨 4도에 저장합니다. 그런 다음, 세포 파편에 메탄올 용액에 2 ~1 개의 클로로폼의 15 밀리리터를 추가하고 일정한 교반으로 밤새 튜브를 배양합니다.

다음 날에는 파스퇴르 파이펫을 사용하여 유기 용매를 필터 종이에 같은 유리 수집 튜브로 옮기기 전에 혼합물을 1시간 동안 쉬게 하십시오. 그런 다음, 입증된 바와 같이 액체 상을 증발한 후, 튜브를 질소 가스로 리필하기 전에 섭씨 4도 저장한다. 진균산 추출의 경우, 교반 용액 2~5밀리리터와 200밀리그램의 균박테리아 바이오매스를 PTFE 라이너 스크류 캡이 있는 밀폐 유리 튜브에 추가하고, 소용돌이에 의해 내용물을 혼합합니다.

밤새 섭씨 80도에서 마른 목욕 안에 혼합물을 배양하십시오. 다음 날, 튜브가 실온을 냉각했을 때, N 헥산의 2 밀리리터를 추가하고, 소용돌이에 의해 30 초 동안 내용을 혼합합니다. 두 개의 명확한 단계가 나타날 때까지 튜브를 정착시키고 N 헥산 상부 단계를 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다.

튜브 내용과 N 헥산의 두 개의 추가 밀리리터를 혼합하고 다시 상층을 수집합니다. 이어서, 질소 흐름에 의해 튜브 함량을 증발시키고 질소로 덮인 샘플을 4°C에서 입증하였다. TLC에 의해 샘플을 분석하려면 TLC 챔버의 한 벽을 필터 용지로 덮고 챔버 모서리에 바셀린을 추가하여 챔버를 밀봉하고 필터 용지 위에 용매 혼합물을 추가하고 TLC 챔버의 바닥에 용매의 나머지 부피를 추가할 수 있습니다.

포화까지 적어도 20분 동안 TLC 챔버를 닫습니다. 한편, 유리튜브에 지질을 200~1000마이크로리터의 클로로폼을 용인하고 모세관 유리튜브를 사용하여 지질 클로로폼 현탁액 10마이크로리터를 TLC 플레이트에 직접 적용한다. 시료가 5분 동안 건조되도록 허용한 후, 포화 TLC 챔버에 플레이트를 삽입하고 이동 상이 TLC를 통과할 수 있도록 합니다.

용매가 플레이트의 상부 끝에서 1센티미터에 도달하면 실리카가 완전히 건조할 때까지 접시를 라미나르 플럭스 아래에 놓습니다. 그런 다음, 건조된 플레이트를 10% 어금니 데이터 인산 수화물로 15~20밀리리터로 분화하여 플레이트가 밝은 노란색이 될 때까지 에탄올에 넣고 120°C에서 2~5분간 접시를 가열한다. 본 대표적인 분석에서, 다양한 진균종으로부터 추출된 진골산은, 2개의 상이한 용출 시스템과 2차원 TLC를 사용하여 1차원 TLC를 통해 분석되었다.

메틸화 절차의 2가지 유형은 또한 타입 5 골수산의 존재를 확인하기 위하여 수행되었다. 두 용출 시스템에서, 진동산은 플레이트 의 중간에 대략 위치하였으나, 5형 진동산에 해당하는 반점은, 묘목 화 후에만 관찰되었다. 2차원 TLC는 또한 개별 진골산 모형의 식별을 허용합니다.

예를 들어, 진균 브루마매는 1형 골균산, 진균보BCG표현1형과 4형, 진균균 포튜이툼은 1형과 5형, 진균아균은 1형과 2개의 골칼산 프로파일을 표현한다. 다양한 진균 종에서 추출한 총 지질 추출물은 극성과 크기의 기능으로 분석되었다. PDIM과 같은 대부분의 극지 지질이 진균 보비스 BCG에는 존재하지만 진균 포튜이텀, 진균 브루메료 및 M abcessus의 부드러운 형태에는 존재하지 않는다는 것을 알 수 있습니다.

페놀 글리코립이는 진균 보비스 BCG에만 존재하며, 글리코펩티도립이는 진균 의 샘플에서만 관찰됩니다. 골수산과 유사하게, 아실글리세롤 및 PDIM, PIM은 1차원 TLC 또는 2D TLC 분석을 통해 쉽게 시각화될 수 있다. 두 가지 유형의 얼룩이 1차원 TLC로 PIM을 드러내는 데 사용되었습니다.

이 프로토콜을 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 절차 전반에 걸쳐 플라스틱 악기를 사용하지 않는 것입니다.