Name: 얇은 층 크로마토그래피에 의한 진균의 지질 조성 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 진균의 지질 조성 분석 방법을 얇은 층 크로마토그래피를 사용하여 Mycobacterium 종에서 수행하는 기법입니다. 이 프로토콜은 병원성 및 면역 조절 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 과학, 혁신 및 대학의 스페인 부에 의해 투자되었다 (RTI2018-098777-B-I00), 페더 펀드, 그리고 카탈루냐의 일반 (2017SGR-229). 산드라 과라-가리도는 일반타트 드 카탈루냐에서 박사 학위 계약(FI)을 받고 있습니다.

1. 진균으로부터 의약과 연계된 총 지질추출(도 1)
<ol><li>단단한 매체에서 균균의 0.2 g를 긁고 폴리테트라플루오로로알렌 (PTFE) 라이너 나사 캡유리 튜브에 추가합니다. 클로로폼 5mL및 메탄올 10mL(클로로폼:메탄올, 1:2)로 구성된 용액을 추가합니다. 참고: 유기 용매를 사용하는 경우 유리 수령인만 사용해야 합니다. 플라스틱 용기는 허용되지 않습니다. 또한, 병에 대한 PTFE 라이너 나사 캡이 필요합니다. 주의: 클로로폼은 잠재적으로 독성이 있고 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. 주의: 메탄올은 잠재적으로 독성이 있고 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.</li>
	<li>균 균 세포 표면에서 비 공유 연결 지질을 추출 하룻밤 지속적인 교반에 튜브를 둡니다. 참고: 궤도 흔들림 플랫폼을 사용할 수 없는 경우 일정한 교반을 가능한 한 자주 주기적인 수동 교반으로 대체할 수 있습니다.</li>
	<li>필터 용지로 유리 깔때기를 덮고 유기 용매를 필터링하고 유리 튜브로 수집합니다.</li>
	<li>질소 가스 플럭스를 사용하여 튜브의 액체 상을 증발시다. 튜브를 질소 가스로 채우고 뚜껑을 덮고 4 °C에 보관하십시오. 참고: 유리 파스퇴르 파이펫을 질소 가스 스트림에 연결하여 원하는 튜브를 특별히 증발시다. 또한 튜브용 드라이 블록 히터 내부에 튜브를 37°C에서 유지합니다. 용매가 증발하면 튜브를 질소 가스로 채운 후 닫습니다.</li>
	<li>클로로폼용 15mL를 셀룰러 파편에 넣습니다. 균 균 세포 표면에서 비 공유 연결 지질을 추출 하룻밤 지속적인 교반에 튜브를 둡니다. 참고: 궤도 흔들림 플랫폼을 사용할 수 없는 경우 일정한 교반을 가능한 한 자주 주기적인 수동 교반으로 대체할 수 있습니다.</li>
	<li>혼합물을 1 시간 동안 쉬게하십시오. 파스퇴르 파이펫을 사용하면 유기 용매를 회수하십시오. 필터 용지로 유리 깔때기를 덮고 유기 용매를 필터링하고 이전에 1.3 단계에서 사용했던 것과 동일한 유리 튜브로 수집합니다. 질소 가스 플럭스를 사용하여 튜브의 액체 상을 증발시다. 튜브를 질소 가스로 채우고 닫고 4 °C에서 다시 저장하십시오.</li>
</ol>2. 산성 메탄성 석면에 의한 진콜산 추출(그림 2A)
<ol><li>PTFE 라이너 나사 캡이 있는 밀폐 유리 튜브에 2-5mL의 에스테르피케이클을 추가합니다. 유리 튜브에 균균 바이오매스 0.2 g를 넣습니다. 참고: 에스테로마이징 용액은 메탄올 30mL, 톨루엔 15mL, 황산 1mL를 혼합하여 형성된다. 진균 세포는 고체 배양또는 진균박테리아로부터 총 비공유 연결 지질추출을 수행한 후 탈지 세포로부터 도취될 수 있다(1.6단계에서 여과 후 남은 세포). 주의: 톨루엔은 인화성 및 매우 유해물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. 주의: 황산은 부식성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.</li>
	<li>소용돌이에 의해 내용을 혼합. 혼합물은 하룻밤 동안 80 °C에서 마른 목욕 안에 서보자.</li>
	<li>튜브가 실온에 도달할 때까지 식힌 다음 튜브에 n-헥산 2mL를 추가합니다. 30s에 대한 소용돌이로 내용을 혼합하고 두 개의 명확한 단계가 나타날 때까지 튜브가 정착 할 수 있습니다. 주의: n-헥산은 잠재적인 인화성, 자극성, 환경 적 손상 및 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.</li>
	<li>n-헥산 상에 대응하는 상면을 복구합니다. 새 튜브로 전송합니다.</li>
	<li>2.3 단계를 반복합니다. 상위를 다시 회수하고 2.4 단계에서 사용되는 동일한 튜브로 옮는다.</li>
	<li>질소 가스 플럭스를 사용하여 튜브의 함량을 증발시다. 튜브를 질소 가스로 채우고 닫고 4 °C에 보관하십시오.</li>
</ol>3. 삽화 및 메틸화에 의한 진콜산 추출(도 2B)
<ol><li>단단한 매체에서 균균의 0.2 g를 긁어 PTFE 나사 캡유리 튜브에 추가합니다.</li>
	<li>수산화 칼륨 5%를 함유한 메탄올 벤젠 용액 2mL(80:20)를 추가합니다. 내용물들을 소용돌이에 섞는다. 혼합물을 100°C에서 3시간 동안 가열합니다. 주의: 벤젠은 인화성, 발암성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.</li>
	<li>튜브가 실온으로 식힙니다. pH = 1을 달성하기 위해 시료를 산성화하기 위해 20 % 황산을 추가하십시오.</li>
	<li>디틸 에테르 3mL를 추가합니다. 소용돌이에 의해 내용을 부드럽게 섞습니다.</li>
	<li>정착하여 두 단계가 형성될 수 있습니다. 다이틸 에테르 단계를 복구하고 새로운 튜브로 전송합니다. 총 세면단계를 3회 반복합니다.</li>
	<li>디틸 에테르 추출물을 증류수 2mL로 세척하고 디틸 에테르에 해당하는 상부부분을 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다. 총 세면단계를 3회 반복합니다.</li>
	<li>다이틸 에테르 추출물 위에 무수성 나트륨 황산나트륨 2 g를 추가하여 건조시다.</li>
	<li>서스펜션을 필터링합니다. 질소 가스 플럭스를 사용하여 함량을 증발시다.</li>
	<li>메틸화 단계를 수행하기 위해, 디틸 에테르 45mL에 의해 형성된 사전 냉각 용액에 N-니트로소-N-메틸 우레아 3g을 녹이고 증류수에서 KOH 40%의 9mL를 용해한다. 주의: N-니트로소-N-메틸루레아는 독성, 자극제, 발암성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.</li>
	<li>수산화 칼륨 펠릿 (약 30g)을 포함하는 얼음에서 냉각 된 새로운 플라스크로 상체 (diazomethane)를 전송합니다. 참고: 상체가 즉시 사용되지 않으면 최대 1시간 동안 -20°C로 저장할 수 있습니다. 주의: 수산화 칼륨은 자극성 및 부식성 물질입니다. 이 재료는 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. 주의: 디아조메탄은 매우 독성이 높고 잠재적으로 폭발성이 있습니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 안전 유리가있는 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.</li>
	<li>3.10단계에서 얻은 다이아조메탄을 함유한 에테르 용액의 2mL을 진동산을 함유한 건조 디틸 에테르 추출물에 넣고 3.8단계에서 수득하였다. 실온에서 15분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>서스펜션을 40°C에서 증발시다. 튜브를 질소 가스로 채우고 닫고 메틸화 지질을 4°C에 저장합니다. 참고: 에테르가 노란색을 잃을 때까지 라미나르 흐름 후드 아래의 에테르 용액에서 다이아조메탄을 증발시다.</li>
</ol>4. 얇은 층 크로마토그래피 (TLC) 분석
<ol><li>유리 TLC 챔버를 포화. 이를 위해, 필터 용지와 TLC 챔버의 벽 중 하나를 커버하고 용매의 혼합물에 의해 구성된 이동 상과 접촉 할 수 있도록. 용매의 나머지 부피를 TLC 챔버의 바닥에 놓습니다. 참고: TLC 챔버의 바닥은 이동상의 최소 1cm까지 커버해야 합니다. 본 실험에서, TCC를 개발하기 위해 상이한 이동상이 사용되었다. 그들은 n-헥산 85 mL 플러스 디틸 에테르의 15 mL로 구성; 디클로로메탄 100mL; 클로로폼 90mL, 메탄올 10mL, 물 1mL; 30mL의 클로로폼, 메탄올 8mL, 물 1mL; 60mL의 클로로폼, 메탄올 35mL, 8mL의 물; 95 mL 클로로폼 플러스 메탄올의 5 mL; 및 90mL의 석유 에테르 (60-80 °C)와 디틸 에테르 10 mL. 참고: 2차원 TLC에서는, n-헥산:아세톤(95:5)을 첫 번째 방향으로 세 번 사용하고, 톨루엔:아세톤(97:3)을 사용하여 두 번째 방향으로 단일 개발을 사용하여 진동산 조성물을 분석한다. PIM을 분석하려면 클로로폼:메탄올:물(60:30:6)을 첫 번째 방향으로 한 번 사용하고, 클로로폼:아세트산:메탄올:물(40:25:3:6)을 두 번째 방향으로 사용한다. PDIM 및 AG를 분석하려면, 석유 에테르(60-80°C):에틸 아세테이트(98:2)를 첫 번째 방향으로 3번 사용하고, 석유 에테르(60-80°C):아세톤(98:2)을 제2 방향으로 사용한다. 주의: 디틸 에테르는 잠재적으로 독성이 있고 유해한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. 주의: 디클로로메탄은 잠재적으로 독성이 있고 유해한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. 주의: 석유 에테르는 잠재적인 인화성, 환경적으로 손상되고 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. 주의: 아세트산은 잠재적인 인화성 및 부식성 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. 주의: 에틸 아세테이트는 인화성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. 주의: 아세톤은 인화성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.</li>
	<li>TLC 챔버를 닫아 최소 20분 동안 포화시다. 한편, 유리튜브에 존재하는 지질을 0.2-1mL의 클로로포름으로 용해한다. 참고: 지질을 용해하는 데 사용되는 부피는 시료의 원하는 또는 예상 농도에 따라 수정될 수 있습니다.</li>
	<li>TLC 플레이트에 모세관 유리 튜브를 사용하여 각 서스펜션의 10 μL을 바르고 실온에서 5 분 동안 시료를 건조시키십시오. 참고: 샘플은 플레이트 의 하단 부분에 적용되어야 하며 각 면에 1cm를 남겨두어야 합니다. 샘플은 0.5cm 이상 다른 샘플과 분리되어야 합니다. 샘플이 플레이트에 적용되면 튜브는 질소 가스로 다시 증발하고 추가 사용을 위해 4 °C에 저장 될 수 있습니다.</li>
	<li>플레이트를 이동상이 포함된 포화 TLC 챔버에 삽입합니다. 모바일 단계가 TLC를 통해 실행되도록 허용합니다. 참고: TLC 챔버에 적용된 모든 움직임은 플레이트의 실행 용매에 영향을 미치고 지질 이동성에 영향을 미칩니다. 2차원 TLC를 수행하는 경우 두 개의 TLC 챔버가 모두 용출 시스템을 포함해야 합니다.</li>
	<li>용매가 플레이트의 상부 끝에서 1cm 거리에 도달하면 TLC 챔버에서 플레이트를 제거합니다. 실리카가 완전히 건조 될 때까지 라미나르 플럭스 아래에 접시를 둡니다. 참고: 진골산 조성물을 분석하는 경우, n-헥산 및 디틸 에테르(85:15)를 사용하여, TLC 플레이트를 통해 3배 의 이동상을 실행할 때까지 4.4 및 4.5배 더 반복한다.</li>
	<li>필요한 얼룩으로 접시를 공개; 필요한 경우 접시를 가열합니다. 참고: 본 실험에서, 다음 의 용액의 15-20 mL은 TLC 플레이트를 분사하는 데 사용하였다: 플레이트가 밝은 노란색이 될 때까지 에탄올에서 10% 몰리브다토포스포릭산 수분염, 120°C에서 플레이트가열; 황산에서 20%α-나프톨의 에탄올 5%는 120°C에서 플레이트를 가열하는 데 이어; 몰리브덴 블루 시약(4.2M 황산산의 1.3% 몰리브덴 산화물)이 인산염 밴드가 나타나거나 황산에 1% 반위한다. 주의: 몰리브다포스포릭산 수분공급은 인화성 및 부식성 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. 주의: 에탄올은 잠재적인 인화성 및 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. 주의: 1-Naphthol은 인화성, 부식성 및 매우 위험한 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다. 주의: 몰리브덴 블루 스프레이 시약은 부식성, 독성 및 매우 유해 물질입니다. 적절한 개인 보호 장비 (실험실 코트, 보호 안경 및 니트릴 장갑)를 착용한 라미나르 플로우 후드에 사용해야합니다.</li>
</ol>

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<li>Llorens-Fons, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+polyphleates%2C+external+cell+wall+lipids+in+Mycobacterium+abscessus%2C+are+associated+with+the+formation+of+clumps+with+cording+morphology%2C+which+have+been+associated+with+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Trehalose polyphleates, external cell wall lipids in Mycobacterium abscessus, are associated with the formation of clumps with cording morphology, which have been associated with virulence.</a> Frontiers in Microbiology. 8, (2017).</li>
<li>Butler, W. R., Guthertz, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycolic+acid+analysis+by+high-performance+liquid+chromatography+for+identification+of+mycobacterium+species%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Microbiology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mycolic acid analysis by high-performance liquid chromatography for identification of mycobacterium species.</a> Clinical Microbiology Reviews. 14 (4), 704-726 (2001).</li>
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<li>Sartain, M. J., Dick, D. L., Rithner, C. D., Crick, D. C., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipidomic+analyses+of+Mycobacterium+tuberculosis+based+on+accurate+mass+measurements+and+the+novel+%22Mtb+LipidDB%22%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipidomic analyses of Mycobacterium tuberculosis based on accurate mass measurements and the novel "Mtb LipidDB".</a> Journal of Lipid Research. 52 (5), 861-872 (2011).</li>
<li>Li, M., Zhou, Z., Nie, H., Bai, Y., Liu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+of+chromatography+and+mass+spectrometry+in+lipidomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances of chromatography and mass spectrometry in lipidomics.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 399 (1), 243-249 (2011).</li>
<li>Nahar, A., Baker, A. L., Nichols, D. S., Bowman, J. P., Britz, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+Thin-Layer+Chromatography-Flame+Ionization+Detection+%28TLC-FID%29+to+total+lipid+quantitation+in+mycolic-acid+synthesizing+Rhodococcus+and+Williamsia+species%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Application of Thin-Layer Chromatography-Flame Ionization Detection (TLC-FID) to total lipid quantitation in mycolic-acid synthesizing Rhodococcus and Williamsia species.</a> International Journal of Molecular Sciences. 21 (5), 1670(2020).</li>
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골균 세포벽으로부터 비연하 로 연결된 지질 화합물의 추출을 위한 금표준 방법으로 간주되는 간단한 프로토콜이 제시된다. 4개의 상이한 진균균의 추출된 지질으로부터 1차원 및 2차원 TCC에 의한 추가 시각화가 도시된다.
클로로폼과 메탄올의 2연연속 결합 혼합물은 균균 세포의 립액함량을 회수하는 데 가장 널리 사용되는 용매혼합물(23,24,25, 26,27,27, 28,29)이다. 이 혼합물은 세포에서 극성 및 극성 지질의 넓은 범위의 회복을 허용한다. 그럼에도 불구하고,...

Mycobacterium 병원성 및 비병원성 종을 구성하는 속으로, 특유의 지질에 의해 형성된 높은 소수성 및 불투과성 세포벽을 갖는 것을 특징으로 한다. 구체적으로, 균균 세포벽에는 α 알킬과 β 하이드록시 지방산인 진동산이 포함되어 있으며, α 분지는 모든 진동산(길이 제외)과 β 사슬에서 상수이며, 메로미콜레이트 체인이라고 불리는 β 체인은 문헌과 함께 설명된 다른 기능성 화학적 집단을 함유할 수 있는 긴 알리파성 체인(me-α α, α θ-, 에폭시, 카박스시 및 ω-1-메톡시-골곱, 따라서 골수산의 7가지 유형(I-VII)을 생성합니다.1. 더욱이, 의심할 여지없는 중요성을 가진 그밖 지질은 또한 진균 종의 세포 벽에 존재합니다. 병원성 종과 같은 Mycobacterium tuberculosis, 결핵의 원인 에이전트2 피티오세롤 디마이코세로사테스(PDIMs), 페놀 글리콜리피드(PGL), 디-, 트라이-및 펜타-아실트레할로스(DAT, TAT 및 PAT) 또는 설폴리피드 와 같은 특정 지질 기반 독성 요인을 생성합니다.3. 진균 표면에 그들의 존재는 호스트 면역 반응을 수정하는 기능과 연관되었습니다, 따라서, 호스트 내부진균의 진화와 지속성4. 예를 들어, 트리아실글리세롤(TAG)의 존재는 계보 2-베이징 하위 혈통의 초연한 표현형과 관련이 있다. M. tuberculosis, 아마도 호스트 면역 반응을 감쇠하는 그것의 능력 때문에5,6. 다른 관련 지질은 결핵 과 비 결핵 진균에 존재하는 lipooligosaccharides (LOSs)입니다. Mycobacterium marinum, 세포벽에 LOS의 존재는 미닫이 운동성 및 생물막형성 능력과 관련이 있으며 대식세포 패턴 인식 수용체에 의한 인식을 방해하여 숙주 식세포에 의한 박테리아의 섭취및 제거에 영향을 미치는 영향7,8. 추가적으로, 몇몇 지질의 부재 또는 존재는 호스트 세포와 상호 작용할 때 악성 또는 감쇠 단면도를 가진 상이한 형태형으로 분류될 수 있습니다. 예를 들어, 글리코펜티오닙스(GPL)의 거친 형태에 Mycobacterium abscessus 인트라고소말 산성화를 유도하는 능력과 관련이 있으며, 결과적으로 세포 세포화증9, 자신의 표면에 GPL을 소유 하는 부드러운 형태와는 달리. 더욱이, 진균세포벽의 지질 함량은 숙주에서 면역 반응을 수정하는 능력과 관련이 있다. 이것은 다른 병리학에 대하여 보호 면역 단면도를 시작하기 위하여 몇몇 진균을 사용하는 맥락에서 관련있습니다10,11,12,13. 예를 들어, Mycolicibacterium vaccae, 결핵에 대한 면역 치료 백신으로 현재 III 임상 시험 단계에 있는 사프로피틱 진균균은 두 개의 식민지 형태형을 표시합니다. 표면에 폴리에스테르를 함유한 부드러운 표현형이 Th2 반응을 유발하는 반면, 폴리에스테르의 거친 표현형 변형은 숙주 면역 세포와 상호 작용할 때 Th1 프로파일을 유도할 수 있습니다.14. 진균 세포에 존재하는 지질의 레퍼토리는 진균 종뿐만 아니라 진균 배양의 조건에 따라 달라집니다 : 잠복기의 시간15,16 배양 배지의 조성17,18. 사실, 배양 배지 조성물의 변화는 항종양 및 면역 자극 활성에 영향을 미칩니다. M. bovis BCG 및 Mycolicibacterium brumae in vitro17. 더욱이, 보호 면역 프로파일에 의해 트리거 M. bovis 에 대한 BCG M. tuberculosis 마우스 모델의 도전은 또한 배양 매체에 달려 있습니다. M. bovis BCG성장17. 이들은 그 때 각 문화 조건에서 진균의 지질 조성과 관련될 수 있었습니다. 이러한 모든 이유로, 진균의 지질 함량에 대한 연구는 관련이 있습니다. 근균 세포벽의 지질 조성물을 추출하고 분석하는 시각적 절차가 제시된다.

<table><tbody><tr><td>아세트산</td><td>Merck</td><td>100063</td><td>주의. 분석을 위한 무수 EMSURE&reg; ACS, ISO, 리그. Ph eur</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Carlo Erba</td><td>400971N</td><td>주의. ACETONE RPE-ACS-ISO FOR ANALYS ml 1000</td></tr><tr><td>Anthrone</td><td>Merck</td><td>8014610010</td><td>Anthrone 합성.</td></tr><tr><td>벤젠</td><td>Carlo Erba</td><td>426113</td><td>주의. 벤젠 RPE - 분석용 - ACS 2.5 l</td></tr><tr><td>모세관 유리관</td><td>Merck</td><td>BR708709</td><td>BRAND&reg; &nbsp; 일회용 BLAUBRAND&reg; &nbsp; 마이크로피펫, intraMark</td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Carlo Erba</td><td>412653</td><td>주의. 클로로포름 RS - HPLC용 - 등용매 등급 - 에탄올 2.5 L</td></tr><tr><td>드라이 블록 히터</td>로 안정화 <td>JP Selecta</td><td>7471200</td><td></td></tr><tr><td>Dicloromethane</td><td>Carlo Erba</td><td>412622</td><td>주의. 디클로로 메탄 RS - HPLC 용 - 등용매 등급 - 아밀렌 2.5 L</td></tr><tr><td>디 에틸 에테르</td><td>Carlo Erba</td>로 안정화 <td>412672</td><td>주의. 디 에틸 에테르 RS-HPLC 용 -등용매 등급 -안정화되지 않음 2.5L</td></tr><tr><td>에틸 아세테이</td>트 <td>Panreac</td><td>1313181211</td><td>주의. 에틸 아세테이트 (Reag. USP, Ph. Eur.) 분석을 위해 ACS, ISO</td></tr><tr><td>에틸 알코올 앱솔루트</td><td>Carlo Erba</td><td>4146072</td><td>주의. 에탄올 절대 무수 RPE - 분석용 - ACS - Reag. Ph.Eur. - Reag. USP 1 L</td></tr><tr><td>유리 깔때기</td><td>VidraFOC</td><td>DURA.2133148 1217/1</td><td></td></tr><tr><td>유리관</td><td>VidraFOC</td><td>VFOC.45066A-16125</td><td>PTFE 회수 캡이 있는 유리관</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Carlo Erba</td><td>412722</td><td>주의. 메탄올 RS - HPLC 용 - GOLD - Ultragradient 등급 2.5 L</td></tr><tr><td>몰리브다토 인산 수화물</td><td>Merck</td><td>51429-74-4</td><td>주의.</td></tr><tr><td>몰리브덴 블루 스프레이 시약, 1.3%</td><td>Sigma</td><td>M1942-100ML</td><td>주의.</td></tr><tr><td>n-헥산</td><td>Carlo Erba</td><td>446903</td><td>주의. n-헥산 99% RS - 아트라솔 - 미량 분석용 2.5 L</td></tr><tr><td>n-니트로소-n-메틸우레아</td><td>시그마</td><td>N4766</td><td>주의</td></tr><tr><td>궤도 진탕 플랫폼</td><td>DDBiolab</td><td>995018</td><td>NB-205L 벤치탑 진탕 인큐베이터</td></tr><tr><td>석유 에테르 (60-80&ordm; C)</td> <td>Carlo Erba</td><td>427003</td><td>주의. 석유 에테르 60 - 80&deg; C RPE - 분석용 2.5L</td></tr><tr><td>분무기</td><td>VidraFOC</td><td>712/1</td><td></td></tr><tr><td>황산나트륨 무수</td><td>Merck</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>황산 95-97%</td><td>Merck</td><td>1007311000</td><td>주의. 황산 95-97%</td></tr><tr><td>TLC 챔버</td><td>Merck</td><td>Z204226-1EA</td><td>직사각형 TLC 개발 탱크, 완전한 L &times; H &횟수; W 22cm &시간; 22cm &시간; 10cm</td></tr><tr><td>TLC 플레이트</td><td>Merck</td><td>1057210001</td><td>TLC SilicaGel 60- 20x20cm x 25 u</td></tr><tr><td>TLC 플레이트 히터</td><td>CAMAG</td><td>223306</td><td>CAMAG TLC 플랫 히터 III</td></tr><tr><td>톨루엔</td><td>Carlo Erba</td><td>488551</td><td>주의. 톨루엔 RPE - 분석용 - ISO - ACS - Reag.Ph.Eur. - Reag.USP 1 L</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>10132562</td><td>IKA&nbsp; Agitador IKA v&oacute; rtex 3</td></tr><tr><td>1-naphthol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>102269427</td><td>주의.</td></tr></tbody></table>

얇은 층 크로마토그래피에 의한 진균의 지질 조성 분석

Analysis of the Lipid Composition of Mycobacteria by Thin Layer Chromatography

진균 종은 성장 속도, 색소 침착의 존재, 고체 미디어에 표시되는 식민지 형태뿐만 아니라 다른 표현성 특성에서 서로 다를 수 있습니다. 그러나, 그(것)들은 모두 일반적인 진균의 가장 관련성이 높은 특성이 있습니다: 그것의 독특하고 높게 소수성 세포 벽. 진균 종은 근균 종 간에 다른 모형을 가진 아라비노갈락탄, 펩티도글리칸 및 진골산의 긴 사슬을 포함하는 막-공유 연결된 복합체를 포함합니다. 또한, 진균은 또한 피티오세롤 디마이코세로사테스(PDIM), 페놀글리콜리피드(PGL), 글리코페티피피드(GPL), 아킬레알로스(AT), 또는 인플루타틸디딜(PIMos)과 같은 세포 표면에 위치하고, 비공유적으로 연결된 지질을 생산할 수 있다. 그(것)들의 몇몇은 병원성 진균에 있는 독성 요인, 또는 호스트 진균 상호 작용에 있는 중요한 항원 지질으로 간주됩니다. 이러한 이유로, 여러 분야에서 그들의 응용 으로 인해 진균 지질의 연구에 상당한 관심이 있다, 진균 감염의 병원성에서 그들의 역할을 이해에서, 감염성 질환 및 암 등 다른 병원성 치료에 대 한 면역 조절 에이전트로 가능한 의미에. 여기서, 유기 용매의 혼합물을 사용하여 고체 배지에서 자란 진균 세포의 총 지질 함량 및 진균산 조성물을 추출 및 분석하는 간단한 접근법이 제시된다. 지질 추출물이 얻어지면, 얇은 층 크로마토그래피(TLC)는 추출된 화합물을 모니터링하기 위해 수행됩니다. 예실험은 네 가지 다른 진균으로 수행된다: 환경 빠르게 성장하는 미콜리시박테리움 브루마와 미콜리박테리움 fortuitum, 감쇠된 천천히 성장하는 진균 보비스 균균 칼레트-게린(BCG)과 기회성 병원균이 빠르게 성장하는 진균 농양, 현재 의정서에 나타난 방법이 광범위한 진균균에 사용될 수 있음을 입증한다.

다른 진균 종에 존재하는 지질의 넓은 범위를 보여주는 목적으로, M. bovis BCG는 거칠고 느린 성장 진균으로 선택되었다. 거칠고 빠르게 성장하는 M. fortuitum 및 M. brumae는 절차에 추가되었고, 마지막으로 M. 농양의 부드러운 형태도 포함되었습니다. 이 4개의 종은 우리가 아실트레할로스 (AT), GPLs, PDIM, PGL, PIM, TDM 및 TMM과 같은 진균 유래 지질의 넓은 스펙트럼을 시각화할 수 있게 합니다. 또한, 네 종 은 모두 다른 진동성 패턴을 가지고있다.
진골산 추출 프로토콜을 수행한 후, 지질 추출물은 1D-TLC 분석을 통해 두 개의 다른, 동등하게 유효하며 용출시스템(그림 3A,B)을사용하여 분석하였다. 제1 이동단계(도3A)는n-헥...

프로토콜은 광범위한 진균의 세포벽의 총 지질 함량을 추출하기 위해 제시된다. 더욱이, 진동산의 상이한 모형의 추출 및 분석 프로토콜이 도시된다. 이러한 진균 화합물을 모니터링하는 얇은 층 크로마토그래피 프로토콜도 제공됩니다.

Mycobacteria species can differ from one another in the rate of growth, presence of pigmentation, the colony morphology displayed on solid media, as well ...

진균 지질은 속의 중요한 특성이며 호스트 진균 상호 작용에서 중요합니다. 속도와 다재다능함은 이 절차의 주요 장점입니다. 이 방법은 지질의 역할과 진균의 병원성 및 면역 자극 효과를 이해하는 데 사용할 수 있습니다.비 공유 연결 지질 추출의 경우, 라미나르 플로우 후드 아래에 PTFE 라이너 스크류 캡이 있는 유리 튜브에 메탄올 용액에 1~2개의 클로로폼15밀리리터를 추가합니다. 그런 다음, 고체 배지에서 균균의 200 밀리그램을 긁어 유리 튜브에 진균을 추가합니다. 일정한 교반으로 하룻밤 동안 튜브를 배양하십시오.다음 날, 유리 튜브에 필터 종이 줄 지어 유리 깔때기를 통해 유기 용매를 필터링합니다. 질소 가스 플럭스를 사용한 후 튜브의 액체 상을 증발하고 튜브를 질소 가스로 채우고 튜브를 섭씨 4도에 저장합니다. 그런 다음, 세포 파편에 메탄올 용액에 2 ~1 개의 클로로폼의 15 밀리리터를 추가하고 일정한 교반으로 밤새 튜브를 배양합니다.다음 날에는 파스퇴르 파이펫을 사용하여 유기 용매를 필터 종이에 같은 유리 수집 튜브로 옮기기 전에 혼합물을 1시간 동안 쉬게 하십시오. 그런 다음, 입증된 바와 같이 액체 상을 증발한 후, 튜브를 질소 가스로 리필하기 전에 섭씨 4도 저장한다. 진균산 추출의 경우, 교반 용액 2~5밀리리터와 200밀리그램의 균박테리아 바이오매스를 PTFE 라이너 스크류 캡이 있는 밀폐 유리 튜브에 추가하고, 소용돌이에 의해 내용물을 혼합합니다.밤새 섭씨 80도에서 마른 목욕 안에 혼합물을 배양하십시오. 다음 날, 튜브가 실온을 냉각했을 때, N 헥산의 2 밀리리터를 추가하고, 소용돌이에 의해 30 초 동안 내용을 혼합합니다. 두 개의 명확한 단계가 나타날 때까지 튜브를 정착시키고 N 헥산 상부 단계를 새로운 튜브로 옮길 수 있습니다.튜브 내용과 N 헥산의 두 개의 추가 밀리리터를 혼합하고 다시 상층을 수집합니다. 이어서, 질소 흐름에 의해 튜브 함량을 증발시키고 질소로 덮인 샘플을 4°C에서 입증하였다. TLC에 의해 샘플을 분석하려면 TLC 챔버의 한 벽을 필터 용지로 덮고 챔버 모서리에 바셀린을 추가하여 챔버를 밀봉하고 필터 용지 위에 용매 혼합물을 추가하고 TLC 챔버의 바닥에 용매의 나머지 부피를 추가할 수 있습니다.포화까지 적어도 20분 동안 TLC 챔버를 닫습니다. 한편, 유리튜브에 지질을 200~1000마이크로리터의 클로로폼을 용인하고 모세관 유리튜브를 사용하여 지질 클로로폼 현탁액 10마이크로리터를 TLC 플레이트에 직접 적용한다. 시료가 5분 동안 건조되도록 허용한 후, 포화 TLC 챔버에 플레이트를 삽입하고 이동 상이 TLC를 통과할 수 있도록 합니다.용매가 플레이트의 상부 끝에서 1센티미터에 도달하면 실리카가 완전히 건조할 때까지 접시를 라미나르 플럭스 아래에 놓습니다. 그런 다음, 건조된 플레이트를 10% 어금니 데이터 인산 수화물로 15~20밀리리터로 분화하여 플레이트가 밝은 노란색이 될 때까지 에탄올에 넣고 120°C에서 2~5분간 접시를 가열한다. 본 대표적인 분석에서, 다양한 진균종으로부터 추출된 진골산은, 2개의 상이한 용출 시스템과 2차원 TLC를 사용하여 1차원 TLC를 통해 분석되었다.메틸화 절차의 2가지 유형은 또한 타입 5 골수산의 존재를 확인하기 위하여 수행되었다. 두 용출 시스템에서, 진동산은 플레이트 의 중간에 대략 위치하였으나, 5형 진동산에 해당하는 반점은, 묘목 화 후에만 관찰되었다. 2차원 TLC는 또한 개별 진골산 모형의 식별을 허용합니다.예를 들어, 진균 브루마매는 1형 골균산, 진균보BCG표현1형과 4형, 진균균 포튜이툼은 1형과 5형, 진균아균은 1형과 2개의 골칼산 프로파일을 표현한다. 다양한 진균 종에서 추출한 총 지질 추출물은 극성과 크기의 기능으로 분석되었다. PDIM과 같은 대부분의 극지 지질이 진균 보비스 BCG에는 존재하지만 진균 포튜이텀, 진균 브루메료 및 M abcessus의 부드러운 형태에는 존재하지 않는다는 것을 알 수 있습니다.페놀 글리코립이는 진균 보비스 BCG에만 존재하며, 글리코펩티도립이는 진균 의 샘플에서만 관찰됩니다. 골수산과 유사하게, 아실글리세롤 및 PDIM, PIM은 1차원 TLC 또는 2D TLC 분석을 통해 쉽게 시각화될 수 있다. 두 가지 유형의 얼룩이 1차원 TLC로 PIM을 드러내는 데 사용되었습니다.이 프로토콜을 시도 할 때 기억해야 할 가장 중요한 것은 절차 전반에 걸쳐 플라스틱 악기를 사용하지 않는 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

의 샘플 준비<em&gt; Mycobacterium 결핵</em핵 자기 공명 Metabolomic의 연구&gt; 압축을 풉니 다

이 동영상은 박막 크로마토그래피를 기반으로 한 마이콜산의 분리를 보여줍니다. 이 기술은 극성에 따라 다양한 마이콜산(마이코박테리아의 세포벽에 존재하는 장쇄 지질)을 분리합니다.

Mycolic Acid Variants의 박막 크로마토그래피 기반 분리: 극성에 따라 Mycobacterial 세포벽 지질을 분리하는 방법

그람 음성 박테리아 지질 다당류 (LPS)의 지질 도메인의 분리 및 특성은 세포 표면 항생제 내성의 기반 메커니즘, 세균의 생존과 건강, 어떻게 화학적으로 다양한 지질 분자 종은 차등 호스트 타고난 면역 반응을 조절에 대한 통찰력을 제공합니다.

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포유류의 외피는 개별 종의 화학 성분 특성을 제공 할 수있는 용매 추출 지질이 포함되어 있습니다. 이 논문은 박막 크로마토 그래피를 사용하여 외피 조직으로부터 격리 광범위한 지질 클래스 분리 및 매트릭스 - 보조 레이저 탈착 / 이온화 비행 시간 형 질량 분광 분석에 의해 triacylglyceride 프로파일을 결정하기위한 통상적 인 방법을 제시한다.

제조 박층 크로마토 그래피 및 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 박쥐 외피 지질의 Triacylglyceride 내용을 프로파일 링

세균성 세포벽은 펩티드에 의해 교차된 당가닥의 거대 분자 네트워크인 펩티도글리칸으로 구성됩니다. 울트라 퍼포먼스 액체 크로마토그래피는 펩티도글리칸 조성물의 새로운 발견을 위한 고해상도 및 처리량을 제공합니다. 우리는 세포벽 (sacculi)의 격리와 UPLC를 통해 분석을위한 후속 준비를위한 절차를 제시합니다.

초성능 액체 크로마토그래피에 의한 조성 분석을 위한 세균세포벽의 격리 및 준비

여기, 우리는 공간 계량 폐 결핵 육아 내 마약 배포판에 레이저 캡처 서 LC/MS 분석과 함께 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. 접근은 광범위 한 적응성 높은 공간 세부 사항에서 조직 내의 약물 농도 측정 하는 있다.

레이저에 의해 폐 결핵 병 변에서 약의 공간 정량화 캡처 서 액체 착 색 인쇄기 질량 분석 (LCM-LC/MS)

우리는 Saccharomyces cerevisiae에있는 중요한 세포 지질을 확인하고 정량화하기 위하여 탠덤 질량 분광법과 결합된 액체 크로마토그래피를 사용하여 프로토콜을 제시합니다. 효모 세포 내의 주요 지질 클래스의 정량적 평가를 위한 설명된 방법은 다재다능하고, 견고하며, 민감하다.

탠덤 질량 분석과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로 미세화세세비시아의 세포 지질의 정량분석

여기서, 중성 지질의 분리를 위한 얇은 층 크로마토그래피와 결합된 14C-아세트산을 가진 효모의 대사 라벨링을 위한 프로토콜이 제시된다.

대사 라벨링 및 얇은 층 크로마토그래피에 의한 사카로미세스 세레시아의 중립 지질 합성 분석

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이 프로토콜은 등전점을 기반으로 한 분취 등전 초점(IEF)을 사용하여 불용성 세포벽 및 막 단백질을 간단한 분획(1-5 단백질)으로 분리한 다음 분자량으로 분리합니다. 생성된 분획은 추가 정제 없이 면역학적 및 단백질체학 분석에 직접 사용할 수 있습니다.

다운스트림 단백질 분석을 위한 결핵균 의 세포벽 및 세포막 단백질의 분리 및 분획

배우세요 진균의 지질 조성 분석 방법을 얇은 층 크로마토그래피를 사용하여 Mycobacterium 종에서 수행하는 기법입니다. 이 프로토콜은 병원성 및 면역 조절 연구에 활용됩니다.

얇은 층 크로마토그래피에 의한 진균의 지질 조성 분석

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