Name: 단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: 배우세요 자극된 라만 산란 이미징을 이용하여 중수소 혼입을 기반으로 한 신속한 항균 감수성 테스트 방법입니다. 소변과 혈액 등 복합 임상 샘플에서 2.5시간 내에 단일 세포 수준의 박테리아 대사 활성을 정량적으로 평가하여 적시적 항생제 치료를 지원합니다.

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이 작업은 NIH R01AI141439에서 J.-X.C 및 M.S로, R35GM136223에서 J.-X.C.로 지원되었습니다.

인간 혈액 표본의 사용은 보스턴 대학의 IRB와 국립 보건원 (NIH)의 지침에 따릅니다. 특히, 표본은 은행에서 왔으며 완전히 식별되지 않습니다. 이 표본은 보스턴 대학의 기관 검토위원회 (IRB) 사무실에서 인간 대상으로 간주되지 않습니다.
1. 박테리아 및 항생제 원액의 제조
<ol><li>1.5mL 마이크로 튜브의 멸균 1x 인산완충식염수(PBS) 또는 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 용해된 1mg/mL 농도의 항생제(황산겐타마이신 또는 아목시실린) 원액을 준비합니다. 겐타 마이신 설페이트를 멸균 PBS 용액에 녹이고 아목시실린을 멸균 DMSO 용매에 용해시킨다. 그 후, 항생제 용액을 제안된 대로 2-8°C에서 저장한다.</li>
	<li>D2O함유 양이온 조정 뮐러-힌튼 브로스(MHB) 배지를 만들기 위해, 10mL의 D2O에 220mg의 MHB 브로스 베이스를 첨가하여 100%D2O함유 배지를 만든다. 200nm 공극 크기의 필터로 여과하여 용액을 멸균합니다. 알림: 이 프로토콜은 항상 추가 단계에서 배지 용액을 만들고 살균하는 데 사용하십시오.</li>
	<li>SRS 이미징을 위해 박테리아 샘플을 준비하려면 중수소가 포함되지 않은 일반 MHB 배지 2mL를 멸균 둥근 바닥 배양 튜브에 추가한 다음 37°C에서 예열합니다.</li>
	<li>멸균 루프를 사용하여 트립신 대두 한천 플레이트의 신선한 배양물로부터 하나의 박테리아(대장균 BW 25113 또는 녹농 균 ATCC 47085) 콜로니를 선택합니다. 그런 다음 예열 된 배양 배지에 현탁하고 부드럽게 와동하여 박테리아 현탁액을 준비합니다.</li>
	<li>박테리아가 대수 단계에 도달할 때까지 셰이커에서 분당 200회전(rpm)으로 37°C에서 배양합니다.</li>
</ol>2. 항생제 존재 하에서의D2O혼입 처리(도 2a)
<ol><li>파장 600nm에서 광도계로 광학 밀도 (OD)를 측정하여 박테리아 농도를 확인하십시오.</li>
	<li>중수소를 포함하지 않는 일반 MHB 배지를 사용하여 박테리아 용액을 희석하여 최종 세포 농도 8 x 105 CFU/mL에 도달합니다. 박테리아 세포를 부드럽게 혼합하기 위해 와동.</li>
	<li>7개의 1.5mL 마이크로 튜브에 박테리아 용액의 300μL 분취량을 준비하고, 하나의 1.5mL 마이크로 튜브에 박테리아 용액의 600μL 분취량을 준비합니다.</li>
	<li>4.8μL의 항생제(겐타마이신 또는 아목시실린) 원액(1mg/mL)을 600μL의 박테리아 용액이 포함된 마이크로 튜브에 추가하여 최종 항생제 농도를 8μg/mL로 만듭니다.</li>
	<li>항생제 함유 박테리아 용액 8μg/mL에서 용액 300μL를 취하고 박테리아 용액 300μL를 더 추가하여 2배 희석된 항생제(4μg/mL) 함유 박테리아 용액을 만듭니다.</li>
	<li>최저 농도(0.25μg/mL)의 마이크로 튜브에 도달할 때까지 테스트 항생제, 겐타마이신 또는 아목시실린의 2배 연속 희석을 반복하고 튜브에서 300μL를 버립니다. 겐타 마이신과 아목시실린 모두의 경우 연속 농도 범위는 0.25 μg / mL - 8 μg / mL입니다.<ol><li>빈 통제를 위해 항생제가없는 튜브 하나를 남겨 두십시오. 이는 항생제 처리 없이D2O처리로 박테리아 대사 활성을 검사하는 양성 대조군이 될 것이다.</li>
		<li>음성 대조군을 위해 항생제가없고 D2O가없는 튜브 하나를 남겨 두십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>박테리아 분취량을 MHB 배지를 함유하는 특정 항생제 (겐타 마이신 또는 아목시실린)와 함께 1 시간 동안 배양한다.</li>
	<li>배양 동안, 단계 2.6에서 제조된 항생제와 동일한 농도구배를 갖는 100%D2O함유 배지로 항생제의 연속 희석액을 준비한다. 겐타 마이신과 아목시실린 모두의 경우 연속 농도 범위는 0.25 μg / mL - 8 μg / mL입니다.</li>
	<li>1시간 항생제 처리 후, 동일한 항생제 농도(단계 2.6에서 제조)의 항생제 전처리 박테리아 300μL에 각각 연속 희석된 항생제 700μL와 100%D2O함유 MHB 배지를 첨가한다.<ol><li>예를 들어, 700μL의 100%D2O-함유 MHB 배지(8μg/mL의 항생제 함유)를 300μL의 8μg/mL 항생제 전처리 박테리아에 추가합니다. 동일한 방식으로 다음 농도의 해당 튜브로 옮기고 여러 번 위아래로 피펫팅하여 균질화합니다.</li>
		<li>블랭크 대조군으로서 300μL의 무항생제 박테리아(단계 2.6.1에서 제조됨)에 700μL의 무항생제 100%D2O-함유 MHB 배지를 추가합니다.</li>
		<li>200 rpm의 인큐베이션 쉐이커에서 37°C에서 추가 30분 동안 인큐베이션합니다. 참고: 이 단계에서, 시험용 배지 중D2O의 최종 농도는 70%이다.</li>
	</ol></li>
	<li>먼저 항생제 1 mL와 D2O 처리된 박테리아 시료를6200x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리한 다음, 정제수로 2회 세척하였다. 마지막으로 샘플을 10 % 포르말린 용액에 고정하고 4 ° C에서 보관하십시오.</li>
</ol>3. 소변 환경에서 박테리아의 준비 (그림 2b)
<ol><li>대장 균 BW 25113을 로그 단계에서 준비하려면 1.4 및 1.5의 단계를 따르십시오.</li>
	<li>600 nm의 파장에서 광도계로 OD를 측정하여 박테리아 농도를 확인하십시오.</li>
	<li>임상 UTI 샘플14,18,41을 모방하려면 대장균 용액을 식별되지 않은 소변 10mL에 스파이크하여 최종 세포 농도 10 6 CFU/mL에 도달합니다.</li>
	<li>5μm 필터를 사용하여 대장균 스파이크된 소변을 여과한 다음 300μL 분취량의 박테리아 용액을 7개의 1.5mL 마이크로 튜브로, 1개의 1.5mL 마이크로 튜브에 박테리아 용액의 600μL 분취량을 나눕니다.</li>
	<li>항생제의 존재하에D2O혼입 처리를 수행하고 2.4 내지 2.10의 이전 단계에서 설명한 바와 같이 샘플 수집을 수행한다.</li>
</ol>4. 혈액 환경에서 박테리아의 준비 (그림 2c)
<ol><li>녹 농균 ATCC 47085를 로그 단계에서 준비하려면 1.4 및 1.5의 단계를 따르십시오.</li>
	<li>임상 혈류 감염 샘플42,43을 모방하기 위해 식별되지 않은 인간 혈액 1mL에 녹농균을 스파이크하여 107CFU/mL의 농도에 도달합니다.</li>
	<li>혈액을 용해시키기 위해 멸균 정제수 9mL를 추가합니다.</li>
	<li>녹농균 스파이크된 혈액을 5 μm 필터를 사용하여 여과한다. 그런 다음 4°C에서 5분 동안 6200 x g에서 원심분리하여 박테리아를 1mL 부피로 수확합니다.  미리 예열된 일반 MHB 9mL를 박테리아 용액에 넣고 부드럽게 소용돌이칩니다. 박테리아의 최종 농도는 106 CFU/mL입니다.</li>
	<li>녹 농균 스파이크된 혈액 용액을 300μL 분취액으로 7개의 1.5mL 마이크로 튜브로 나누고, 600μL 분취량을 1.5mL 마이크로 튜브에 나눕니다.</li>
	<li>항생제의 존재하에D2O혼입 처리를 수행하고 2.4 내지 2.10의 이전 단계에서 설명한 바와 같이 샘플 수집을 수행한다.</li>
</ol>5. 단일 박테리아에서D2O대사 혼입의 SRS 이미징
<ol><li>고정 박테리아 용액 1mL를 정제수로 세척한 다음 6200 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 상청액을 제거하십시오. 박테리아 용액을 약 20 μL로 농축한다.</li>
	<li>박테리아 용액을 폴리 -L- 라이신 코팅 커버 글라스에 증착하십시오. SRS 이미징을 위해 샘플을 샌드위치하고 밀봉합니다.</li>
	<li>SRS 현미경을 사용하여 2168cm-1에서 C-D 진동 주파수에서 박테리아를 이미지화합니다.<ol><li>컴퓨터의 제어 소프트웨어를 사용하여 펌프 파장을 852nm로 입력하고 조정합니다.</li>
		<li>파워 미터를 사용하여 레이저 출력을 측정합니다. 레이저 출력 앞의 반파 플레이트를 조정하여 샘플에서 펌프 레이저의 출력을 ~8mW로 설정하고 샘플에서 Stokes 레이저의 출력을 ~40mW로 설정합니다. 참고: SRS 현미경에서 80MHz 반복률의 조정 가능한 펨토초 레이저는 펌프(680 - 1300nm) 및 Stokes(1045nm) 여기 레이저를 제공합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>반사 거울의 나사를 조정하여 펌프와 Stokes 빔을 공간적으로 정렬하고 두 빔을 레이저 스캐닝을 위한 2D 갈보 미러 시스템이 장착된 직립 현미경으로 향하게 합니다.<ol><li>60x 수침 대물렌즈를 사용하여 펌프와 Stokes 레이저를 샘플에 집중시킵니다.</li>
		<li>오일 콘덴서를 사용하여 샘플에서 정방향으로 신호를 수집합니다.</li>
		<li>대역 통과 필터를 사용하여 Stokes 레이저를 포토 다이오드로 향하게하기 전에 필터링하십시오.</li>
		<li>잠금 증폭기로 자극된 라만 신호를 추출하고 광 다이오드로 신호를 감지합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>소프트웨어의 제어판에서 각 SRS 이미지가 200 x 200 픽셀과 30μs 동안 픽셀 체류 시간을 포함하도록 설정합니다. 하나의 이미지에 대한 총 획득 시간은 ~1.2초입니다. 스텝 크기를 150nm로 설정하면 이미지 크기가 약 30 x 30μm2가 됩니다. 각 샘플에 대해 최소 3개의 보기 필드를 이미지화합니다.</li>
</ol>6. 이미지 처리 및 데이터 분석 (그림 3)
<ol><li>평균 C-D 신호 강도를 얻으려면 ImageJ 소프트웨어로 SRS 이미지를 열고 처리하십시오.</li>
	<li>먼저 이미지 | 클릭하여 SRS 이미지를 반전 된 색상의 8 비트 유형 이미지로 변환합니다. 유형 | 8비트 및 | 편집 ImageJ 소프트웨어의 버튼을 반전합니다.</li>
	<li>그런 다음 프로세스 | 클릭하여 가우시안 블러로 이미지를 필터링합니다. 필터 | 가우스 흐림 버튼을 누르고 시그마(반지름) 를 1로 설정합니다.</li>
	<li>이미지 임계값 조정을 사용하여 박테리아 영역을 선택합니다. 이미지 | 클릭 | 조정 선택한 박테리아 크기가 원본 SRS 이미지의 크기와 일치하는지 확인하기 위한 임계값입니다. 입자를 결정하기 위해 크기 임계값을 조정하여 작은 입자를 제거합니다. 적용을 클릭합니다.</li>
	<li>분석 | 적용 입자 분석 버튼을 사용하여 박테리아의 영역을 표시하고 결정합니다.</li>
	<li>ROI 관리자에서 모두 표시 버튼을 클릭하여 처리되지 않은 원본 SRS 이미지에 레이블을 지정하고 동일한 박테리아 영역에 레이블을 지정하고 ROI 관리자에서 측정 버튼을 클릭하여 각 데이터 포인트의 평균 강도를 결정합니다.</li>
	<li>원본 SRS 이미지의 배경 영역에 동그라미를 치고 배경의 평균 강도를 측정합니다. 각 박테리아의 평균 C-D 강도는 배경 신호 강도를 공제하여 얻습니다.</li>
</ol>7. SC-MIC를 통한 항균 감수성 정량
참고: SC-MIC를 결정하기 위한 0.60에서의 컷오프 값은 다양한 농도의 약물 노출시 박테리아에 대한 대사 활성 및 대사 억제 조건의 SRS C-D 강도의 통계 분석에 따라 설정됩니다(40). 항생제 감수성 및 항생제 내성 그룹에 대한 C-D 강도는 정규 분포로 적합했습니다.
<ol><li>수신기 작동 특성(ROC) 곡선을 플로팅하고 차단 임계값을 0.60으로 평가합니다. 이러한 컷오프 값에 기초하여, 항생제의 효능의 지표로서 SC-MIC는 대사적으로 비활성 및 대사적으로 활성인 그룹을 결정하기 위해 정의될 수 있다.</li>
	<li>SRS 이미징 데이터를 정량적으로 분석하려면 연속적으로 희석된 항생제 농도로 처리된 각 박테리아 그룹에 대한 C-D 신호 강도의 히스토그램을 플로팅합니다. 색상이 지정된 데이터 포인트는 서로 다른 개별 박테리아를 나타냅니다.</li>
	<li>항생제 처리군의 C-D 강도를 항생제 처리하지 않은 대조군의 평균 강도로 표준화합니다. 0.60의 컷오프 값을 사용하여 다양한 항생제 농도와 비교하여 C-D 영역의 SRS 신호 강도를 정량화하여 다양한 박테리아 및 항생제 조합의 SC-MIC 결과를 결정합니다.</li>
	<li>SC-MIC 판독값을 검증하고 기존 브로스 미세 희석 분석을 사용하여 측정된 MIC와 비교합니다.</li>
	<li>임상 및 실험실 표준 연구소(CLSI)에 따르면 테스트된 각 박테리아 균주에 대한 SRS 대사 영상 결과를 기반으로 한 감수성 범주는 "감수성", "내성" 또는 "중간"으로 해석됩니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

신속한 AST는 샘플에서 SC-MIC 결과까지 2.5시간 이내에 단일 세포 SRS 대사 영상을 사용하여 항생제 치료에 대한 박테리아 대사 활성의 반응을 평가함으로써 얻을 수 있습니다. 박테리아 대사 활성 및 항미생물 감수성의 반응은 C-D 결합의 SRS 이미징을 사용하여 생체 분자 합성을 위한D2O의 대사 혼입을 모니터링함으로써 검출될 수 있다. 물은 살아있는 세포에서 어디에나 사용되기 때문에 SRS 대사 영상은 신속한 AST를위한 보편적 인 방법을 제공합니다. 신속한 AST 방법은 단일 박테리아 수준에서 소변이나 전혈과 같은 복잡한 생물학적 환경에서 박테리아를 검출하는 데 적용 할 수 있습니다. SC-MIC는 소변 및 혈액에서 박테리아의 1.5시간 배양 후 측정할 수 있으며, 이는 UTI 및 BSI 진단의 패러다임을 시간 소모적인 배양 의존적 절차에서 배양 독립적인 현장 접근 방식으로 전환하는 혁신적인 것으로 간주됩니다. 따라서 기존의 브로스 미세 희석 방법에 비해 진단 시간이 크게 단축되어...

항생제 내성(AMR)은감염성 질환의 효과적인 치료에 대한 전 세계적으로 증가하는 위협입니다1. 항생제 내성 박테리아 퇴치를 위한 조치가 취해지지 않으면 AMR로 인해 연간 1,000만 명이 추가로 사망하고 2050년까지 전 세계 GDP 1,00조 달러의 손실이 발생할 것으로 예상됩니다.1,2. 이는 항생제 내성 박테리아의 출현을 늦추고 관련사망률을 줄이기 위해 감염성 박테리아의 항생제 감수성 검사(AST)를 위한 신속하고 혁신적인 진단 방법의 시급한 필요성을 강조합니다3. 최상의 임상 결과를 보장하려면 24시간 이내에 효과적인 치료법을 도입하는 것이 중요합니다. 그러나 디스크 확산 또는 브로스 희석 방법과 같은 현재의 금 표준 방법은 일반적으로 임상 샘플의 사전 배양 절차에 최소 24시간이 필요하고 최소 억제 농도(MIC) 결과를 얻기 위해 추가로 16-24시간이 필요합니다. 전반적으로, 이러한 방법은 클리닉에서 전염병 치료에 대한 즉각적인 결정을 안내하기에는 너무 시간이 많이 걸리며, 이는 항생제 내성의 출현 및 확산으로 이어집니다4.
중합효소연쇄반응(PCR)기반 기술5과 같은 유전형 AST 방법이 신속한 검출을 위해 개발되었습니다. 이러한 기술은 빠른 AST 결과를 제공하기 위해 특정 저항 유전자 서열을 측정합니다. 그들은 시간이 많이 걸리는 세포 배양에 의존하지 않습니다. 그러나 내성이있는 특정 알려진 유전자 서열 만 테스트됩니다. 따라서, 그 적용은 다양한 박테리아 종 또는 다른 저항 메커니즘으로 제한됩니다. 또한 치료 결정 6,7에 대한 MIC 결과를 제공 할 수 없습니다. 게다가, 이러한 한계를 극복하기 위해 신속한 AST를 위한 신규한 표현형 방법이 개발 중이다(8), 미세유체 장치 9,10,11,12,13, 광학 장치14,15,16, 핵산 복제 번호 17,18, 및 라만 분광법(19)을 포함하는 표현형 AST, 20,21,22,23,24. 이러한 방법은 AST 결과를 안내하는 시간을 단축하지만 대부분은 임상 표본에 직접 적용되지 않고 박테리아 분리에만 적용되며 여전히 오랜 시간 사전 배양이 필요합니다.
이 연구에서는 SRS 영상에 의한 세포 대사 활동의 모니터링을 통해 소변 및 전혈에서 박테리아의 감수성을 신속하게 결정하는 방법을 제시합니다. 물 (H2O)은 살아있는 세포에서 필수적인 생체 분자 합성 과정의 대다수에 참여합니다. 물의 동위 원소로서, NADPH의 산화 환원 활성 수소 원자와 D2O의 D 원자 사이의 효소 촉매 H / D 교환 반응을 통해, 중수소는 세포 (25,26) 내부의 바이오 매스로 통합 될 수있다. 중수 소화 지방산 합성 반응은 중수소 표지 NADPH에 의해 매개됩니다. 아미노산 (AA)의 반응에D2O가 혼입되면 중수 소화 단백질 생산 (26)이 발생합니다 (그림 1). 이와 같이, 단일 미생물 세포에서 새롭게 합성된 C-D 결합 함유 생체분자는 검출하고자 하는 일반적인 대사활성 마커로 채용될 수 있다. de novo 합성 C-D 결합을 판독하기 위해 생체 분자의 구체적이고 정량적인 화학 정보를 제공하는 다목적 분석 도구인 Raman 분광법은 항균 감수성을 결정하고 테스트 시간을 몇 시간으로 크게 단축하는 데 널리 사용됩니다.27,28,29,30 . 그러나, 라만 산란 공정의 고유한 낮은 효율로 인해, 자발적 라만 분광법은 검출 감도가 낮다. 따라서 자발적인 라만 분광법을 사용하여 실시간 이미지 결과를 얻는 것은 어려운 일입니다. 코히어런트 안티-스톡스 라만 산란(CARS) 및 자극 라만 산란(SRS)을 포함한 코히어런트 라만 산란(CRS)은 자발적 라만 분광법보다 훨씬 더 큰 크기를 생성하는 코히어런트 라이트 필드로 인해 높은 검출 감도에 도달하여 단일 셀 수준에서 고속, 특이적 및 정량적 화학 이미징을 렌더링합니다. 31,32,33,34,35 ,36,37,38,39.
여기에서, 우리의 가장 최근의 연구(40)에 기초하여, 우리는 단일 세포 수준에서 정상 배지, 소변 및 전혈 환경에서 박테리아의D2O혼입의 펨토초 SRS C-D 이미징에 의한 대사 활성 및 항균 감수성의 신속한 결정을 위한 프로토콜을 제시한다. 펨토초 SRS 이미징은 2.5시간 이내에 단일 박테리아 수준에서 항생제에 대한 단일 세포 대사 불활성화 농도(SC-MIC)를 쉽게 모니터링할 수 있습니다. SC-MIC 결과는 브로스 미세 희석을 통한 표준 MIC 테스트에 의해 검증됩니다. 당사의 방법은 기존 방법에 비해 분석 시간이 훨씬 단축된 박테리아 요로 감염(UTI) 및 혈류 감염(BSI) 병원체의 항균 감수성을 측정하는 데 적용할 수 있으며, 이는 단일 세포 수준에서 클리닉에서 빠른 표현형 AST의 기회를 열어줍니다.

<table><tbody><tr><td>음향 광학 변조</td><td>Gooch & Housego</td><td>R15180-1.06-LTD</td><td>변조 스톡스 레이저 빔</td></tr><tr><td>Amoxicillin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8523-5G</td><td></td></tr><tr><td>대역 통과 필터</td><td>Chroma</td><td>HQ825/150m</td><td>포토다이오드 전에 스톡스 레이저 빔 차단</td></tr><tr><td>염화칼슘</td><td>시그마 Aldrich</td><td>C1016-100G</td><td>양이온 조정</td></tr><tr><td>Mueller-Hinton Broth</td><td>Fisher Scientific</td><td>B12322</td><td>국물 희석 방법에 의한 미생물의 항균 감수성 테스트</td></tr><tr><td>원심 분리기</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002542</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경</td><td>VWR</td><td>16004-318</td><td></td></tr><tr><td>스냅 캡이있는 배양 튜브</td><td>Fisher brand</td><td>149569B</td><td></td></tr><tr><td>Daptomycin</td><td>Acros</td><td>A0386346</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td></td><td>151882</td><td>항생제를 용해시키는 유기 용매</td></tr><tr><td>Deuterium oxide-d6</td><td>Sigma Aldrich</td><td>156914</td><td>SRS 이미징 시스템</td></tr><tr><td>Escherichia coli BW 25113</td><td>The Coli Genetic Stock Center</td><td>7636</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf polypropylene microcentrifuge tubes 1.5 mL</td><td>Fisher brand</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin sulfate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G4918</td><td></td></tr><tr><td>친수성 폴리비닐리덴 플루오라이드 필터</td><td>Millipore-Sigma</td><td>SLSV025NB</td><td>pore size 5 &micro; m</td></tr><tr><td>ImageJ 소프트웨어</td><td>NIH</td><td>버전 : 2.0.0-rc-69 / 1.52t</td><td>이미지 처리 및 분석</td></tr><tr><td>37 °deg에서 설정된 궤도 쉐이커를 인큐베이팅; C</td><td>VWR</td><td>97009-890</td><td></td></tr><tr><td>접종 루프</td><td>Sigma</td><td>BR452201-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>InSight DeepSee 펨토초 펄스 레이저</td><td>Spectra-Physics</td><td>Model: insight X3</td><td>SRS 이미징용 1045nm에서 조정 가능한 레이저 소스 및 고정 레이저 소스</td></tr><tr><td>Lock-in amplifier</td><td>취리히 인스트루</td>먼트 <td>HF2LI</td><td>SRS 신호 복조</td></tr><tr><td>오일 콘덴서</td><td>Olympus</td><td>U-AAC</td><td>NA 1.4</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa ATCC 47085 (PAO1)</td><td>American Type Culture Collection</td><td>ATCC 47085</td><td></td></tr><tr><td>Photodiode</td><td>Hamamatsu</td><td>S3994-01</td><td>검출기</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 원추형 튜브 15 mL</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 필터</td><td>Thermo Scientific</td><td>726-2520</td><td>기공 크기 0.2 &마이크로; m</td></tr><tr><td>멸균 페트리 접시</td><td>Corning</td><td>07-202-031</td><td></td></tr><tr><td>주사기 10 mL</td><td>Fisher 브랜드</td><td>14955459</td><td></td></tr><tr><td>UV/Vis 분광 광도계</td><td>Beckman Coulter</td><td>모델: DU 530</td><td>600 nm</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>물 대물렌즈</td><td>Olympus</td><td>UPLANAPO/IR</td><td>60&times;의 파장에서 광학 밀도 측정, 해당 위치 1.2</td></tr></tbody></table>

단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium

항생제 내성 감염의 확산을 늦추고 예방하기 위해 병원균에 대한 항균 효과를 정량적으로 결정하기 위해 신속한 항균 감수성 검사 (AST)가 시급합니다. 전형적으로 장기간 배양에 기초한 통상적인 방법으로 AST를 완성하는 데 며칠이 걸리며, 이들은 임상 샘플에 대해 직접 작용하지 않는다. 여기에서는 산화중수소(D2O) 대사 혼입의 자극된 라만 산란(SRS) 이미징에 의해 가능해진 신속한 AST 방법을 보고합니다. 바이오매스로의D2O의 대사 혼입 및 단일 박테리아 수준에서 항생제에의 노출에 따른 대사 활성 억제는 SRS 영상화에 의해 모니터링된다. 항생제 노출 시 박테리아의 단일 세포 대사 불활성화 농도(SC-MIC)는 총 2.5시간의 샘플 준비 및 검출 후에 얻을 수 있습니다. 또한이 신속한 AST 방법은 소변이나 전혈과 같은 복잡한 생물학적 환경의 박테리아 샘플에 직접 적용 할 수 있습니다. 중수소 혼입의 SRS 대사 영상화는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST에 대한 변형입니다.

중수소 혼입에 대한 배양 시간의 영향은 C-D (2070-2250 cm-1) 및 CH (2,800-3,100 cm-1) 영역에서 자발적 라만 미세 분광법으로 측정됩니다 (그림 4a). 70% D2O 함유 배지에서 배양된 녹농균의 타임랩스 단일 세포 라만 스펙트럼은 0분에서 180분까지의 배양 시간에 걸쳐 CD/CH 강도가 증가하는 것을 보여줍니다(그림 4b) 단일 미생물 세포에서 증가하는 C-D 풍부도는D2O가 세포 내부의 중수소화 생체분자에 통합됨을 보여줍니다.
50% 이상의D2O표지는 23시간 잠복기 동안 박테리아 대사에 유의하게 영향을 미친다27. 25시간 배양 기간 동안D2O표지 농도가 70%...

이 프로토콜은D2O대사의 단일 세포 자극 라만 산란 이미징에 의해 2.5시간 이내에 신속한 항균 감수성 테스트(AST) 분석을 제공합니다. 이 방법은 소변 또는 전혈 환경의 박테리아에 적용되며, 이는 클리닉에서 신속한 단일 세포 표현형 AST를 변형시킵니다.

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to ...

소변과 혈액에서 2.5 시간 이내에 신속한 항균 감수성 검사를 얻을 수 있으며, 이는 기존의 브로스 미세 희석 방법에 비해 분석 시간이 크게 단축 된 것으로 간주됩니다. 전혈과 같은 복잡한 환경에서 박테리아 대사 활동을 모니터링 할 수 있습니다. 시작하려면 600나노미터 파장에서 광도계로 광학 밀도를 측정하여 샘플의 박테리아 농도를 확인하십시오.밀리리터당 10 내지 5번째 콜로니 형성 단위(CFU)의 8배의 최종 세포 농도에 도달하려면 중수소가 없는 일반 MHB 배지를 사용하여 박테리아 용액을 희석합니다. 박테리아 세포를 와류에 의해 혼합한 후, 7개의 1.5밀리리터 마이크로튜브에서 박테리아 용액의 300마이크로리터 분취량을 제거하고 하나의 1.5밀리리터 마이크로튜브에서 박테리아 용액의 600마이크로리터 분취량을 제거합니다. 그런 다음 4.8 마이크로 리터의 박테리아 용액이 들어있는 마이크로 튜브에 600 마이크로 리터의 항생제 저장 용액을 추가하여 밀리리터 당 8 마이크로 그램의 최종 항생제 농도를 달성합니다.항생제가없는 박테리아 용액의 300 마이크로 리터 분취량에 항생제가 포함 된 300 마이크로 리터의 박테리아 용액을 추가하여 최종 항생제 농도가 밀리리터 당 4 마이크로 그램 인 2 배 희석 용액을 얻습니다. 밀리리터당 0.25마이크로그램의 최저 농도에 도달할 때까지 시험 항생제의 2배 연속 희석을 반복합니다. 마지막 마이크로 튜브에서 300 마이크로 리터의 용액을 버립니다.항생제가 없는 튜브 하나를 중수소 처리가 있는 양성 대조군에 할당하고 중수소가 없는 음성 대조군에 할당합니다. 박테리아 분취액을 항생제 함유 MHB 배지와 함께 1시간 동안 인큐베이션한다. 한편, 앞서 설명한 것과 동일한 농도 구배를 갖는 100% 중수소 함유 MHB 배지로 항생제의 연속 희석액을 준비한다.배양 1시간 후, 동일한 항생제 농도의 항생제 전처리 박테리아 300마이크로리터에 MHB 함유 100%중수소 배지로 직렬 희석한 700마이크로리터의 항생제를 추가합니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합물을 균질화합니다. 양성 대조군으로 300 마이크로 리터의 항생제가없는 박테리아에 MHB 배지를 함유 한 700 마이크로 리터의 무항생제 100 % 중수소를 첨가하십시오.음성 대조군으로 300 마이크로 리터의 항생제가없는 박테리아에 MHB 배지를 함유 한 무항생제 0 % 중수소 700 마이크로 리터를 첨가하십시오. 모든 마이크로튜브를 섭씨 37도에서 분당 200회 회전하여 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 항생제 1 밀리리터와 중수소 처리 박테리아 시료를 섭씨 4도에서 5 분 동안 6, 200 회 g으로 원심 분리한다.그런 다음 정제수로 펠릿을 두 번 씻으십시오. 샘플을 부피 기준으로 10% 부피 포르말린 용액에 고정하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 600나노미터 파장에서 광도계로 광학 밀도를 측정하여 새로 준비된 박테리아 샘플에서 대장균 농도를 확인합니다.임상 요로 감염 샘플을 모방하려면 대장균 샘플을 식별되지 않은 소변 샘플 10ml에 스파이크하여 밀리리터당 10에서 6CFU의 최종 농도에 도달합니다. 5 미크론 필터를 사용하여 대장균 스파이크 소변을 여과하고 여과 된 박테리아 용액을 300 마이크로 리터 분취량으로 7 개의 1.5 밀리리터 마이크로 튜브로, 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 600 마이크로 리터 분취량으로 나눕니다. 앞에서 설명한 대로 항생제가 있는 상태에서 중수소 혼입 치료를 수행합니다.임상 혈류 감염 샘플을 모방하기 위해, 녹농균을 식별되지 않은 인간 혈액 1 밀리리터에 스파이크하여 밀리리터당 10 내지 6 CFU의 최종 농도에 도달한다. 혈액을 용해하려면 9 밀리리터의 멸균 정제수를 첨가하십시오. 녹농균 스파이크 혈액을 5-마이크론 필터를 사용하여 여과한다.그런 다음 여과 된 샘플에서 박테리아를 섭씨 4도에서 5 분 동안 6, 200 회 g의 원심 분리로 1 밀리리터 부피로 수확합니다. 원심분리 후, 녹농균 스파이크 혈액 용액을 300 마이크로리터 분취량으로 7개의 1.5밀리리터 마이크로튜브로 나누고 1.5밀리리터 마이크로튜브에 박테리아 용액의 600마이크로리터 분취량을 나누고, 앞서 설명한 바와 같이 항생제가 있는 상태에서 중수소 혼입 처리를 수행합니다. 샘플 준비를 위해 고정 된 박테리아 용액 1 밀리리터를 정제수로 세척하고 세척 된 박테리아 용액을 섭씨 4도에서 5 분 동안 6, 200 회 g로 원심 분리합니다.상청액을 제거하고 박테리아 용액을 멸균된 물로 약 20 마이크로리터로 농축한다. 박테리아 용액을 poly-L-lysine 코팅 커버 유리에 증착하고 다른 커버 유리와 샌드위치하고 샘플을 밀봉합니다. SRS 현미경에서 80 메가 헤르츠 반복률의 조정 가능한 펨토초 레이저는 펌프와 Stokes 여기 레이저를 제공합니다.Stokes 빔은 2.4 메가 헤르츠의 음향 광학 변조기에 의해 변조됩니다. 두 개의 빔은 이색성 거울을 통해 동일 선형으로 결합됩니다. 그런 다음 펌프와 Stokes 빔을 레이저 스캐닝을 위해 2D Galvo 미러가있는 실험실에서 제작 한 레이저 스캐닝 현미경으로 보냅니다.60x 물 대물렌즈는 레이저를 샘플에 집중시키고 오일 콘덴서는 샘플에서 신호를 수집합니다. 두 개의 필터가 Stokes 빔을 필터링하는 데 사용되며 펌프 빔은 광 다이오드에 의해 감지된 후 유도된 라만 신호는 잠금 증폭기에 의해 추출됩니다. 제어 소프트웨어를 사용하여 펌프 파장을 852나노미터로 입력하고 조정합니다.C에서 D까지의 진동 주파수를 2, 168 파수로 조정하여 SRS 현미경을 사용하여 박테리아를 이미지화합니다. 파워 미터를 사용하여 레이저 출력을 측정합니다. 레이저 출력 앞의 반파 플레이트를 조정하여 샘플에서 펌프 레이저의 출력을 8밀리와트로 설정하고 샘플에서 Stokes 레이저의 출력을 50밀리와트로 설정합니다.표준 샘플 DMSO d6을 샘플 스테이지에 놓고 60x 수침 대물렌즈를 사용하여 펌프와 Stokes 레이저를 샘플에 집중시킵니다. 반사 거울의 나사를 조정하여 펌프와 Stokes 빔을 공간적으로 정렬하고 두 빔을 레이저 스캐닝을 위해 2D Galvo 미러 시스템이 장착 된 정립 현미경으로 향하게합니다. 소프트웨어 제어판에서 각 SRS 이미지를 200 x 200 픽셀을 포함하도록 설정하고 픽셀 유지 시간을 30마이크로초로 설정합니다.한 이미지의 총 획득 시간은 약 1.2초입니다. 스텝 크기를 150나노미터로 설정하면 이미지 크기는 약 30 x 30마이크로미터의 제곱이 됩니다. 시스템을 최적화한 후 표준 샘플을 꺼내고 박테리아 샘플을 60x 수침 대물렌즈 아래의 샘플 스테이지에 놓습니다.박테리아 샘플의 SRS 이미징을 시작합니다. 각 샘플에 대해 최소 3개의 시야를 이미지화합니다. 중수소 혼입에 대한 배양 시간의 효과는 CD 및 CH 영역에서 자발적인 라만 미세 분광법에 의해 측정됩니다.단일 박테리아에 대한 중수소 배양 시간에 따른 CD 대 CH 강도 비율 플롯은 0분에서 180분까지 배양 시간에 걸쳐 CH 강도에 대한 CD 증가를 보여주었습니다. 녹농균의 SRS 영상화는 겐타마이신 및 70%중수소와의 배양시 수행되었습니다. 추가 정량적 통계 분석에 따르면 박테리아의 CD 신호는 겐타 마이신 처리를하지 않은 경우보다 밀리리터 당 2 마이크로 그램 또는 겐타 마이신 농도가 훨씬 낮았습니다.0.60의 컷오프 강도 역치는 녹농균이 밀리리터당 2마이크로그램 및 더 높은 농도의 겐타마이신에서 대사적으로 억제된다는 결론을 내렸습니다. 정상 MHB 배지에서 겐타마이신에 대한 녹농균에 대한 SC-MIC는 밀리리터당 2마이크로그램으로 측정되었으며, 이는 브로스 마이크로희석법에 의해 결정된 밀리리터당 4마이크로그램의 MIC와의 1배 차이 범위 내에 있었습니다. 대장균 스파이크 소변 샘플의 신속한 항균 감수성 테스트 (AST)는 SRS 영상에 의해 수행되었습니다.아목시실린에 대한 대장균 스파이크 소변 샘플에 대한 SC-MIC는 밀리리터당 4마이크로그램으로 측정되었으며, 이는 일반 MHB 배지에서 순수한 대장균에 대한 종래의 브로스 희석 방법에 의해 밀리리터당 8마이크로그램의 MIC와 동일한 감수성 판독값을 갖는다. 인간 혈액에서 스파이크된 녹농균의 신속한 AST의 적용 가능성을 SRS 영상에 의해 조사하였다. 2, 168 센티미터에서 SRS 이미지의 CD 강도는 살아있는 박테리아의 대사성 중수소 혼입으로부터 유래 한 박테리아 신호에 의해 지배되었다.혈액 내 녹농균에 대한 SC-MIC는 밀리리터당 2마이크로그램으로 결정되었으며, 이는 정상 성장 배지에서 녹농균에 대한 종래의 표준 MIC 결과와 잘 일치했습니다. 항균 감수성 시험에 사용되는 박테리아 세포 수는 임상 및 실험실 표준 연구소에서 권장하는 대로 밀리리터당 약 5배 10 내지 5번째 콜로니 형성 단위로 유지됩니다. 박테리아 농도가 높을수록 최소 억제 농도가 증가 할 수 있습니다.현장 병원체 식별과 신속한 항생제 감수성 검사 진단을 결합하면 정확한 치료를 위해 적절한 항균제를 적시에 식별할 수 있는 클리닉으로 번역할 수 있는 큰 잠재력이 될 수 있습니다.

rapid-antimicrobial-susceptibility-testing-stimulated-raman

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Zhang, M. 외, 단일 박테리아 내 중수소 통합 자극 라만 산란 영상을 통한 신속 항균 감수성 검사. J. Vis. Exp. (2022)이 영상은 자극 라만 산란 현미경을 활용해 중수소 표지된 대사 활동을 추적하여 항생제에 대한 감수성을 평가하는 방법을 시연합니다. 탄소-중수소 신호를 모니터링함으로써 내성 및 감수성 박테리아 집단을 신속히 검출할 수 있게 합니다.

자극 라만 산란 현미경을 이용한 박테리아 항생제 감수성 검출

우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해...

액포 파열의 단일 세포 측정은 세포 내 병원균에 의해 발생

우리는 급속한 항생제 감수성 시험을 위한 미세유체 플랫폼을 개발했습니다. 유체는 미세 유체 채널의 바닥에 고정 된 박테리아를 통해 고속으로 전달됩니다. 스트레스와 항생제의 존재에서, 박테리아의 취약 한 긴장 은 급속 하 게 죽는다. 그러나, 저항하는 박테리아는 이 스트레스가 많은 조건을 살아남을 수 있습니다.

칩에 스트레스 유발 항생제 감수성 테스트

여기에서는 박테리아 포자 발아 중 환원당의 존재를 감지하기 위한 비색 분석법을 설명합니다.

세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출

항생제 효능은 가장 일반적으로 사멸 역학 연구를 수행하고 집락 형성 단위(CFU)를 측정하여 결정됩니다. 주사전자현미경(SEM)을 이러한 표준 방법과 통합함으로써 다양한 항생제 간의 치료의 약리학적 효과를 구별할 수 있습니다.

형태 변화를 규명하기위한 프로토콜<em&gt; 클로스 트리 디움 디피 실</em&gt; 항생제 치료에 대한 반응

간단한 ATP 측정 분석 결과 및 라이브/죽은 방법 얼룩 계량 ceftriaxone 치료 후 Neisseria gonorrhoeae 생존을 시각화 하 사용 되었다. 이 프로토콜 검사 어떤 항생제의 항균 효과를 확장할 수 있습니다 고 박테리아 biofilms에서 항생제의 최소 억제 농도 정의 하기 위해 사용할 수 있습니다.

정량 검사의 항생제 자화 율 Neisseria gonorrhoeae 집계를 사용 하 여 ATP 이용 상업적인 분석 실험 및 라이브/죽은 얼룩

원자력 현미경-적외선 분광법(AFM-IR)은 세균 연구를 위한 강력한 플랫폼을 제공하여 나노 스케일 해상도를 달성할 수 있습니다. 둘 다, 세포 외 변화의 매핑 (예를 들어, 세포 분열시) 뿐만 아니라 화학 조성의 비교 연구 (예를 들어, 약물 내성에서 발생) 박테리아의 단일 세포 수준에서 수행 될 수있다.

원자력 현미경 검사법은 단일 박테리아 화학을 조사하는 도구로 적외선 분광법과 결합

이 논문은 동일한 현미경 플랫폼에 통합 된 자극 된 라만 산란 (SRS)과 일관된 스토크스 라만 산란 (CARS)의 해상도, 감도 및 이미징 대비를 직접 비교합니다. 결과는 CARS가 더 나은 공간 분해능을 가지며, SRS는 더 나은 콘트라스트와 스펙트럼 분해능을 제공하며, 두 방법 모두 비슷한 감도를 가지고 있음을 보여줍니다.

화학 이미징을 위한 하이퍼스펙트럼 자극 라만 산란 및 일관된 안티스토크스 라만 산란 현미경의 직접 비교

매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 이미징 질량 분석법을 통해 한천 기반 박테리아 거대 콜로니 분석을 위한 새로운 샘플 준비 방법이 시연됩니다.

감염 중 한천 및 조직에서 자란 박테리아 집락의 이미징 질량 분석 분석을 통한 미생물 협력 조사

우리는 전송된 신호 감지 기능이 있는 직립 자극 라만 산란 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 타임랩스 이미징을 위한 무대 상단의 유연한 환경 챔버를 보고합니다. 지질 방울은 3분 시간 간격으로 최대 24시간 동안 올레산으로 처리된 SKOV3 세포에서 이미지화되었습니다.

자극 라만 산란 현미경을 사용한 타임랩스 라이브 셀 이미징을 위한 유연한 챔버

Acinetobacter baumannii의 빠르고 정확한 검출을 촉진하기 위해 A. baumannii 감염을 식별하기 위해 LbaCas12a 엔도뉴클레아제와 함께 Recombinase Polymerase Amplification(RPA)을 사용하는 프로토콜을 제시합니다.

Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a 기반 시스템을 사용한 Acinetobacter Baumannii 감염의 빠르고 특이적 검출

배우세요 자극된 라만 산란 이미징을 이용하여 중수소 혼입을 기반으로 한 신속한 항균 감수성 테스트 방법입니다. 소변과 혈액 등 복합 임상 샘플에서 2.5시간 내에 단일 세포 수준의 박테리아 대사 활성을 정량적으로 평가하여 적시적 항생제 치료를 지원합니다.

단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

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