단일 박테리아에 혼입된 중수소의 자극된 라만 산란 이미징에 의한 신속한 항균 감수성 테스트

소변과 혈액에서 2.5 시간 이내에 신속한 항균 감수성 검사를 얻을 수 있으며, 이는 기존의 브로스 미세 희석 방법에 비해 분석 시간이 크게 단축 된 것으로 간주됩니다. 전혈과 같은 복잡한 환경에서 박테리아 대사 활동을 모니터링 할 수 있습니다. 시작하려면 600나노미터 파장에서 광도계로 광학 밀도를 측정하여 샘플의 박테리아 농도를 확인하십시오.

밀리리터당 10 내지 5번째 콜로니 형성 단위(CFU)의 8배의 최종 세포 농도에 도달하려면 중수소가 없는 일반 MHB 배지를 사용하여 박테리아 용액을 희석합니다. 박테리아 세포를 와류에 의해 혼합한 후, 7개의 1.5밀리리터 마이크로튜브에서 박테리아 용액의 300마이크로리터 분취량을 제거하고 하나의 1.5밀리리터 마이크로튜브에서 박테리아 용액의 600마이크로리터 분취량을 제거합니다. 그런 다음 4.8 마이크로 리터의 박테리아 용액이 들어있는 마이크로 튜브에 600 마이크로 리터의 항생제 저장 용액을 추가하여 밀리리터 당 8 마이크로 그램의 최종 항생제 농도를 달성합니다.

항생제가없는 박테리아 용액의 300 마이크로 리터 분취량에 항생제가 포함 된 300 마이크로 리터의 박테리아 용액을 추가하여 최종 항생제 농도가 밀리리터 당 4 마이크로 그램 인 2 배 희석 용액을 얻습니다. 밀리리터당 0.25마이크로그램의 최저 농도에 도달할 때까지 시험 항생제의 2배 연속 희석을 반복합니다. 마지막 마이크로 튜브에서 300 마이크로 리터의 용액을 버립니다.

항생제가 없는 튜브 하나를 중수소 처리가 있는 양성 대조군에 할당하고 중수소가 없는 음성 대조군에 할당합니다. 박테리아 분취액을 항생제 함유 MHB 배지와 함께 1시간 동안 인큐베이션한다. 한편, 앞서 설명한 것과 동일한 농도 구배를 갖는 100% 중수소 함유 MHB 배지로 항생제의 연속 희석액을 준비한다.

배양 1시간 후, 동일한 항생제 농도의 항생제 전처리 박테리아 300마이크로리터에 MHB 함유 100%중수소 배지로 직렬 희석한 700마이크로리터의 항생제를 추가합니다. 여러 번 위아래로 피펫팅하여 혼합물을 균질화합니다. 양성 대조군으로 300 마이크로 리터의 항생제가없는 박테리아에 MHB 배지를 함유 한 700 마이크로 리터의 무항생제 100 % 중수소를 첨가하십시오.

음성 대조군으로 300 마이크로 리터의 항생제가없는 박테리아에 MHB 배지를 함유 한 무항생제 0 % 중수소 700 마이크로 리터를 첨가하십시오. 모든 마이크로튜브를 섭씨 37도에서 분당 200회 회전하여 30분 동안 배양합니다. 배양 후, 항생제 1 밀리리터와 중수소 처리 박테리아 시료를 섭씨 4도에서 5 분 동안 6, 200 회 g으로 원심 분리한다.

그런 다음 정제수로 펠릿을 두 번 씻으십시오. 샘플을 부피 기준으로 10% 부피 포르말린 용액에 고정하고 섭씨 4도에서 보관하십시오. 600나노미터 파장에서 광도계로 광학 밀도를 측정하여 새로 준비된 박테리아 샘플에서 대장균 농도를 확인합니다.

임상 요로 감염 샘플을 모방하려면 대장균 샘플을 식별되지 않은 소변 샘플 10ml에 스파이크하여 밀리리터당 10에서 6CFU의 최종 농도에 도달합니다. 5 미크론 필터를 사용하여 대장균 스파이크 소변을 여과하고 여과 된 박테리아 용액을 300 마이크로 리터 분취량으로 7 개의 1.5 밀리리터 마이크로 튜브로, 1.5 밀리리터 마이크로 튜브에 600 마이크로 리터 분취량으로 나눕니다. 앞에서 설명한 대로 항생제가 있는 상태에서 중수소 혼입 치료를 수행합니다.

임상 혈류 감염 샘플을 모방하기 위해, 녹농균을 식별되지 않은 인간 혈액 1 밀리리터에 스파이크하여 밀리리터당 10 내지 6 CFU의 최종 농도에 도달한다. 혈액을 용해하려면 9 밀리리터의 멸균 정제수를 첨가하십시오. 녹농균 스파이크 혈액을 5-마이크론 필터를 사용하여 여과한다.

그런 다음 여과 된 샘플에서 박테리아를 섭씨 4도에서 5 분 동안 6, 200 회 g의 원심 분리로 1 밀리리터 부피로 수확합니다. 원심분리 후, 녹농균 스파이크 혈액 용액을 300 마이크로리터 분취량으로 7개의 1.5밀리리터 마이크로튜브로 나누고 1.5밀리리터 마이크로튜브에 박테리아 용액의 600마이크로리터 분취량을 나누고, 앞서 설명한 바와 같이 항생제가 있는 상태에서 중수소 혼입 처리를 수행합니다. 샘플 준비를 위해 고정 된 박테리아 용액 1 밀리리터를 정제수로 세척하고 세척 된 박테리아 용액을 섭씨 4도에서 5 분 동안 6, 200 회 g로 원심 분리합니다.

상청액을 제거하고 박테리아 용액을 멸균된 물로 약 20 마이크로리터로 농축한다. 박테리아 용액을 poly-L-lysine 코팅 커버 유리에 증착하고 다른 커버 유리와 샌드위치하고 샘플을 밀봉합니다. SRS 현미경에서 80 메가 헤르츠 반복률의 조정 가능한 펨토초 레이저는 펌프와 Stokes 여기 레이저를 제공합니다.

Stokes 빔은 2.4 메가 헤르츠의 음향 광학 변조기에 의해 변조됩니다. 두 개의 빔은 이색성 거울을 통해 동일 선형으로 결합됩니다. 그런 다음 펌프와 Stokes 빔을 레이저 스캐닝을 위해 2D Galvo 미러가있는 실험실에서 제작 한 레이저 스캐닝 현미경으로 보냅니다.

60x 물 대물렌즈는 레이저를 샘플에 집중시키고 오일 콘덴서는 샘플에서 신호를 수집합니다. 두 개의 필터가 Stokes 빔을 필터링하는 데 사용되며 펌프 빔은 광 다이오드에 의해 감지된 후 유도된 라만 신호는 잠금 증폭기에 의해 추출됩니다. 제어 소프트웨어를 사용하여 펌프 파장을 852나노미터로 입력하고 조정합니다.

C에서 D까지의 진동 주파수를 2, 168 파수로 조정하여 SRS 현미경을 사용하여 박테리아를 이미지화합니다. 파워 미터를 사용하여 레이저 출력을 측정합니다. 레이저 출력 앞의 반파 플레이트를 조정하여 샘플에서 펌프 레이저의 출력을 8밀리와트로 설정하고 샘플에서 Stokes 레이저의 출력을 50밀리와트로 설정합니다.

표준 샘플 DMSO d6을 샘플 스테이지에 놓고 60x 수침 대물렌즈를 사용하여 펌프와 Stokes 레이저를 샘플에 집중시킵니다. 반사 거울의 나사를 조정하여 펌프와 Stokes 빔을 공간적으로 정렬하고 두 빔을 레이저 스캐닝을 위해 2D Galvo 미러 시스템이 장착 된 정립 현미경으로 향하게합니다. 소프트웨어 제어판에서 각 SRS 이미지를 200 x 200 픽셀을 포함하도록 설정하고 픽셀 유지 시간을 30마이크로초로 설정합니다.

한 이미지의 총 획득 시간은 약 1.2초입니다. 스텝 크기를 150나노미터로 설정하면 이미지 크기는 약 30 x 30마이크로미터의 제곱이 됩니다. 시스템을 최적화한 후 표준 샘플을 꺼내고 박테리아 샘플을 60x 수침 대물렌즈 아래의 샘플 스테이지에 놓습니다.

박테리아 샘플의 SRS 이미징을 시작합니다. 각 샘플에 대해 최소 3개의 시야를 이미지화합니다. 중수소 혼입에 대한 배양 시간의 효과는 CD 및 CH 영역에서 자발적인 라만 미세 분광법에 의해 측정됩니다.

단일 박테리아에 대한 중수소 배양 시간에 따른 CD 대 CH 강도 비율 플롯은 0분에서 180분까지 배양 시간에 걸쳐 CH 강도에 대한 CD 증가를 보여주었습니다. 녹농균의 SRS 영상화는 겐타마이신 및 70%중수소와의 배양시 수행되었습니다. 추가 정량적 통계 분석에 따르면 박테리아의 CD 신호는 겐타 마이신 처리를하지 않은 경우보다 밀리리터 당 2 마이크로 그램 또는 겐타 마이신 농도가 훨씬 낮았습니다.

0.60의 컷오프 강도 역치는 녹농균이 밀리리터당 2마이크로그램 및 더 높은 농도의 겐타마이신에서 대사적으로 억제된다는 결론을 내렸습니다. 정상 MHB 배지에서 겐타마이신에 대한 녹농균에 대한 SC-MIC는 밀리리터당 2마이크로그램으로 측정되었으며, 이는 브로스 마이크로희석법에 의해 결정된 밀리리터당 4마이크로그램의 MIC와의 1배 차이 범위 내에 있었습니다. 대장균 스파이크 소변 샘플의 신속한 항균 감수성 테스트 (AST)는 SRS 영상에 의해 수행되었습니다.

아목시실린에 대한 대장균 스파이크 소변 샘플에 대한 SC-MIC는 밀리리터당 4마이크로그램으로 측정되었으며, 이는 일반 MHB 배지에서 순수한 대장균에 대한 종래의 브로스 희석 방법에 의해 밀리리터당 8마이크로그램의 MIC와 동일한 감수성 판독값을 갖는다. 인간 혈액에서 스파이크된 녹농균의 신속한 AST의 적용 가능성을 SRS 영상에 의해 조사하였다. 2, 168 센티미터에서 SRS 이미지의 CD 강도는 살아있는 박테리아의 대사성 중수소 혼입으로부터 유래 한 박테리아 신호에 의해 지배되었다.

혈액 내 녹농균에 대한 SC-MIC는 밀리리터당 2마이크로그램으로 결정되었으며, 이는 정상 성장 배지에서 녹농균에 대한 종래의 표준 MIC 결과와 잘 일치했습니다. 항균 감수성 시험에 사용되는 박테리아 세포 수는 임상 및 실험실 표준 연구소에서 권장하는 대로 밀리리터당 약 5배 10 내지 5번째 콜로니 형성 단위로 유지됩니다. 박테리아 농도가 높을수록 최소 억제 농도가 증가 할 수 있습니다.

현장 병원체 식별과 신속한 항생제 감수성 검사 진단을 결합하면 정확한 치료를 위해 적절한 항균제를 적시에 식별할 수 있는 클리닉으로 번역할 수 있는 큰 잠재력이 될 수 있습니다.