Name: 인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 배우세요 Tol2 transposon을 이용한 인공 microRNA 형질전환으로 병아리 배아 망막에서 유전자 기능 상실을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 안정적이고 효율적인 유전자 억제를 가능하게 합니다.

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pT2K-CAGGS 및 pCAGGS-T2TP 벡터는 각각 Yoshiko Takahashi(Kyoto University, Kyoto, Japan)와 Koichi Kawakami(National Institute of Genetics, Mishima, Japan)에 의해 친절하게 제공되었습니다. 원고를 비판적으로 읽어준 Michael Berberoglu에게 감사드립니다. 이 연구는 왕립 학회와 생명 공학 및 생물 과학 연구위원회 (BBSRC) (영국)의 보조금으로 지원되었습니다.

1. miRNA 발현 벡터의 구축
참고: miRNA 발현 벡터를 구성하는 절차(단계 1.1-1.3, 1.5-1.6.)는 앞서 설명한 바와 같이 miRNA 발현 키트인 EmGFP를 사용한 Block-iT Pol II miR RNA 발현 키트에 최적화되어 있습니다(15,16). 이 키트는 miRNA 발현(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), 대조군 벡터(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-음성 대조군 플라스미드), 보조 시약 및 miRNA 발현 벡터를 생산하기 위한 지침을 제공하도록 설계된 발현 벡터를 제공합니다(재료 표 참조)17.
<ol><li>표적 유전자에 대해 pre-miRNA를 암호화하는 단일 가닥 DNA 올리고 설계: 온라인 도구인 RNAi Designer(재료 표 참조)를 사용하여 단일 가닥 DNA 올리고("상단 가닥" 올리고(표적 pre-miRNA) 및 "하단 가닥" 올리고(상단 가닥 올리고의 보완))를 설계합니다. 단일 가닥 올리고의 필수 기능(그림 2A)과 표적 서열의 예(그림 2B)에 대해서는 그림 2를 참조하십시오. 참고: 주어진 표적 유전자에 대해 5-10개의 pre-miRNA 서열을 생성하고 시험관 내에서 녹다운 활성을 스크리닝하는 것이 좋습니다(단계 1.4).</li>
	<li>상단 및 하단 가닥 올리고를 어닐링하여 이중 가닥 올리고를 생성합니다.<ol><li>멸균된 0.5mL 미세원심분리기 튜브에 다음 어닐링 반응물(표 1)을 설정합니다.</li>
		<li>반응 혼합물을 95°C에서 4분 동안 인큐베이션한다. 상부- 및 하부-가닥 올리고를 어닐링하여 반응 혼합물을 5-10분 동안 실온(RT)으로 냉각시킴으로써 이중 가닥 올리고를 생성한다. 샘플을 짧게(~5초) 원심분리합니다. 참고: 어닐링된 올리고는 분해 없이 -20°C에서 최소 1년 동안 보관할 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>이중가닥 올리고를 miRNA 발현 벡터 내로 클로닝(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA (Provided in the miRNA expression kit)): 제조사 매뉴얼에 따라 개별적인 이중가닥 올리고를 선형화된 miRNA 발현 벡터 내로 클로닝한다17.</li>
	<li>넉다운 효과 평가 참고: 개별 miRNA 염기서열은 ovo에 적용하기 전에 시험관 내에서 유전자 억제 효율에 대해 테스트하는 것이 좋습니다. 녹다운 효율은 miRNA 발현 플라스미드를 표적 유전자를 발현하는 세포주에 형질감염시켜 테스트할 수 있습니다. 별법으로, 개별적인 miRNA 발현 플라스미드는 표적 유전자에 대한 발현 구축물을 갖는 세포주 내로 공동-형질감염될 수 있다. 본래 상태에서 막-고정되지 않은 단백질을 코딩하는 표적 유전자 (예를 들어, 가용성 단백질)의 경우, 알칼리성 포스파타제 (AP) 융합 단백질을 표적 단백질의 발현을 모니터링하기 위해 사용할 수 있다. 표적 단백질을 코딩하는 cDNA 서열은 AP-태그 벡터(APtag-1-APtag-5; 재료 표 참조)에서 인간 태반 알칼리성 포스파타제에 프레임으로 융합되어 세포 내로 도입될 수 있다(18). 배양 세포(예를 들어, HEK293T 세포)에서 발현될 때, AP-태깅된 표적 단백질은 배양 배지 내로 높은 수준으로 분비되고, 따라서 miRNA-형질감염된 세포의 배양 배지에서 AP 활성의 감소를 측정함으로써 miRNA 서열의 녹다운 효과를 평가할 수 있다(하위단계 1.4.1-1.4.4).<ol><li>하룻밤 동안 24웰 플레이트(8 x 104 cells/well)에서 HEK293T 세포를 배양합니다. 개별 miRNA 발현 구축물을 AP-태그된 표적 단백질의 발현 플라스미드로 일시적으로 형질감염시킵니다. pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-음성 대조군 플라스미드(miRNA 발현 키트에 제공됨)를 대조군으로 사용합니다. (AP 태그가 부착된 표적 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 사용하는 경우 개별 miRNA 발현 구조체로만 세포를 transfection합니다.) 참고: 기존의 리포펙션 시약( 재료 표 참조)이 형질감염에 사용됩니다.</li>
		<li>형질주입 후 48-72시간 동안 컨디셔닝된 배지를 수집하고, 내인성 AP 활성을 65°C 수조에서 5분 동안 열 불활성화시킨다. 데스크탑 미세 원심분리기에서 5분 동안 최대 속도로 회전하는 파편.</li>
		<li>상청액을 10mM HEPES, pH 7.0으로 완충하고 0.45μm 필터에 통과시킵니다.</li>
		<li>100 μL(플레이트 리더에서 측정용) 또는 500 μL(분광광도계에서)의 상층액을 취하고 동일한 양의 2x AP 기질 버퍼를 추가합니다(표 2). 플레이트 리더 또는 분광 광도계에서 OD405 를 측정하여 AP 활동을 확인하십시오. 참고: 컨디셔닝 배지의 AP 활성이 너무 높아 정확한 측정이 불가능한 경우 HBAH 완충액(행크스 균형 염 용액(HBSS), 0.5mg/mL 소 혈청 알부민, 20mM HEPES(pH 7.0)) 또는 운반체 단백질이 포함된 다른 완충액. 인산염 함유 완충액(예: PBS)은 무기 인산염이 AP의 경쟁적 억제제로 작용하므로 사용하지 마십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>miRNA 염기서열의 연쇄 참고: 녹다운 효과는 동일한 표적 유전자에 대해 서로 다른 miRNA를 연결하거나 동일한 miRNA를 반복하여 향상시킬 수 있습니다. miRNA 발현 벡터는 다수의 pre-miRNA 서열 및 이들의 코-시스트로닉 발현(co-cistronic expression)의 연쇄를 지지한다17.<ol><li>제조사의 지시에 따라 시험관 내 분석(단계 1.4)에서 가장 높은 녹다운 활성을 보이는 두 개의 상이한 pre-miRNA 서열(동일한 표적 유전자에 대해)을 사슬로 묶는다17.</li>
		<li>단계 1.4에 기재된 바와 같이 시험관내 검정을 사용하여 사슬화된 구축물의 유전자 억제 효율을 평가한다. 3개 이상의 pre-miRNA 염기서열이 유사하게 높은 녹다운 활성을 나타내는 경우, 두 염기서열의 상이한 조합을 테스트하고 가장 높은 녹다운 활성을 나타내는 조합을 사용하십시오( 대표 결과 참조).</li>
	</ol></li>
	<li>EmGFP-pre-miRNA 발현 카세트를 Tol2 트랜스포존 벡터로 전달 참고: EmGFP cDNA와 2개의 pre-miRNA 서열을 포함하는 발현 카세트는 Tol2 트랜스포존 벡터(pT2K-CAGGS 벡터, 재료 표 참조)로 전달됩니다. 이를 위해, 발현 카세트(CMV 프로모터의 3' 말단부터 miRNA 발현 벡터의 miRNA 역염기서열 분석 프라이머 부위까지 포함)를 인공 제한효소 부위를 갖는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하고, PCR 산물을 Tol2 트랜스포존 벡터에 클로닝한다. Tol2 트랜스포존 벡터는 삽입된 발현 카세트의 발현을 구동하는 유비쿼터스 CAGGS 프로모터를 포함합니다. CAGGS 프로모터와 발현 카세트는 Tol2 서열 옆에 있습니다(그림 1).<ol><li>EmGFP-pre-miRNA 발현 카세트의 PCR 증폭: 표 3에 설명된 반응 설정 및 열순환 조건을 따릅니다.</li>
		<li>겔 정제된 PCR 산물(c. 1.3 kb)을 제한 효소 분해 Tol2 트랜스포존 벡터에 합자합니다. 플라스미드를 적격한 대장균 세포에 전기천사하고( 재료 표 참조) 재조합체(pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA 구성물)를 선택합니다.</li>
		<li>통상적인 maxiprep 키트를 사용하여 플라스미드를 준비한다( 재료 표 참조). 플라스미드의 구조와 서열을 각각 PCR에 사용된 프라이머를 이용하여 제한효소 맵핑을 통해 확인하였다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 계란 저장 및 배양
<ol><li>수정된 화이트 레그혼(Gallus gallus) 알은 지역 농장이나 상업 공급업체에서 구입하십시오. 참고: 계란은 생존력의 현저한 손실이나 배양 중 발달 지연 없이 배양 전 최대 1주일 동안 12-16°C 또는 4°C에서 보관할 수 있습니다.</li>
	<li>알에 배양 시작 날짜를 표시하고 알의 윗면(배아가 위치할 위치)을 표시하십시오. 배아가 햄버거와 해밀턴(HH) 단계 10(33-38시간)-11(40-45시간)19에 도달할 때까지 38°C에서 수평 위치에서 수정란을 배양합니다.</li>
</ol>3. ovo electroporation에서
<ol><li>oovo electroporation에서 준비<ol><li>0.25% 패스트 그린 용액의 제조: 25mg의 패스트 그린 FCF를 10mL의 PBS에 녹입니다. 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다. 솔루션은 RT에 저장할 수 있습니다.</li>
		<li>DNA 칵테일: 개별 pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNA 플라스미드(하위 단계 1.6.3)와 Tol2 트랜스포이즈효소 발현 플라스미드(pCAGGS-T2TP 벡터, 재료 표 참조)(각각 5μg/μL)를 2:1의 비율로 혼합하여 주입 용액을 준비합니다. 주입 된 영역을 시각화하기 위해 0.25 % 빠른 녹색 용액의 1/10 부피를 추가하십시오. 참고: 최적의 DNA 농도는 구축물에 따라 달라질 수 있습니다.</li>
		<li>미세주입 장치 설정(그림 3A,B): 미세주입 장치는 다음으로 구성됩니다(재료 표 참조): 해밀턴 주사기, 18G 바늘(바늘 길이 = 2"), PVC(폴리염화비닐) 튜브(길이 2cm), 마이크로피펫 바늘(마이크로피펫 풀러로 오메가 도트 섬유(1mm OD X 0.75mm ID)가 있는 모세관을 당겨 만들 수 있음).<ol><li>해밀턴 주사기에 중광유를 채웁니다. 주사기에 18G 바늘을 부착하고 주사기 플런저를 눌러 바늘 내부 공간을 기름으로 채웁니다.</li>
			<li>바늘 끝에 2cm 길이의 PVC 튜브를 부착하고 튜브에 오일을 채웁니다.</li>
			<li>당겨진 마이크로피펫 바늘을 튜브에 부착합니다. 미세 집게로 마이크로 피펫 바늘의 끝을 직경 10-20 μm로 떼어 내고 작은 구멍을 만듭니다. 바늘 전체에 기름을 채 웁니다. 알림: DNA 용액의 흐름을 방해할 수 있으므로 시스템에 기포가 가두지 않도록 주의해야 합니다.</li>
		</ol></li>
		<li>착색 된 DNA 칵테일 (하위 단계 3.1.2)의 5 μL를 멸균 된 페트리 접시에 넣는다. 해부 현미경 아래에서 마이크로피펫 바늘의 끝을 멸균 페트리 접시의 DNA 용액에 넣고 용액을 천천히 바늘에 넣습니다.</li>
		<li>압력이 바늘 내부와 외부가 평형을 이룰 때까지 기다렸다가 (공기가 바늘로 들어가는 것을 방지하기 위해) 바늘 끝을 DNA 용액에서 꺼냅니다. 주사 때까지 바늘 끝을 작은 비커의 멸균 PBS에 담그십시오.</li>
		<li>전기 천공 장치 설정(그림 3A,C):<ol><li>마이크로 매니퓰레이터에 전극 홀더가있는 한 쌍의 백금 전극을 설정하십시오. 전극 끝 사이의 간격을 2mm로 조정합니다(그림 3C,E).</li>
			<li>전극을 케이블로 구형파 펄스 발생기에 연결합니다( 재료 표 참조).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>DNA 용액의 미세주입(그림 3D)<ol><li>인큐베이터에서 닭고기 달걀을 꺼내 70 % 에탄올에 담근 티슈 페이퍼로 달걀 표면을 닦으십시오.</li>
		<li>18G 바늘을 10mL 주사기에 연결합니다. 노른자가 손상되지 않도록 아래쪽(45°)으로 기울어진 계란의 뭉툭한 끝을 통해 바늘을 삽입합니다.</li>
		<li>계란에서 알부민 2-3mL를 빼냅니다. 스카치 테이프로 구멍을 막습니다. 배아와 vitelline 막이 빛으로 난자를 "candling"하여 껍질에서 분리되었는지 확인하십시오.</li>
		<li>가위와 집게를 사용하여 달걀 상단에서 달걀 껍질 조각(직경 2-3cm 원)을 제거하여 배아를 노출시킵니다. 전기천공 중 배아가 마르는 것을 방지하기 위해 한 번에 5개 이상의 알을 낳지 마십시오. 알림: 달걀을 깨지 않고 창문을 열기 어려운 경우 달걀 껍질을 제거하기 전에 달걀 상단 전체를 셀로테이프나 스카치 테이프로 덮을 수 있습니다.</li>
		<li>바늘 끝을 근위부에서 시전체에 45° 각도로 삽입하고 파란색 용액이 내강을 채울 때까지 플런저를 천천히 누르거나(또는 두드려) DNA 칵테일을 주입합니다(그림 3D). 참고: 또는 압력 미세주입 시스템( 재료 표 참조)을 DNA 용액 주입에 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>바늘을 빼고 끝을 PBS에 다시 넣습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>전기천공법(그림 3E)<ol><li>electroporator의 펄스 파라미터를 다음과 같이 설정합니다: 전압: 15 V, 펄스 길이: 50 밀리초, 펄스 간격: 950 밀리초, 펄스 수: 5</li>
		<li>배아 위의 vitelline 막에 HBSS 몇 방울을 추가합니다. 배아의 전후방 축에 수직 인 미세 조작기를 사용하여 전극을 HBSS로 내립니다. 참고: 또는 알부민은 효율적인 전기천공을 가능하게 하는 우수한 전기 전도체이기 때문에 HBSS를 추가하지 않고 이 절차를 수행할 수 있습니다.</li>
		<li>전극을 시신경의 양쪽(전방(비강) 측면 및 후방(측두))에 배치합니다(그림 3E). 전극이 배아나 혈관에 닿지 않도록 하십시오. 펄스 전기장을 적용합니다.</li>
		<li>전극을 제거하고 알부민이 축적되지 않도록 물에 적신 멸균 면봉으로 전극을 부드럽게 청소하십시오.</li>
		<li>스카치 테이프로 창을 밀봉하고 원하는 발달 단계까지 배아를 다시 배양하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+guidance+of+retinal+axons+by+a+tectal+lamina-specific+glycoprotein+Nel%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vitro guidance of retinal axons by a tectal lamina-specific glycoprotein Nel.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 41 (2), 113-119 (2009).</li>
<li>Nakamura, R., Nakamoto, C., Obama, H., Durward, E., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-function+analysis+of+Nel%2C+a+Thrombospondin-1-like+glycoprotein+involved+in+neural+development+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Structure-function analysis of Nel, a Thrombospondin-1-like glycoprotein involved in neural development and functions.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (5), 3282-3291 (2012).</li>
<li>Nakamoto, C., Durward, E., Horie, M., Nakamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nell2+regulates+the+contralateral-versus-ipsilateral+visual+projection+as+a+domain-specific+positional+cue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Nell2 regulates the contralateral-versus-ipsilateral visual projection as a domain-specific positional cue.</a> Development. 146 (4), (2019).</li>
<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+from+transcriptionally+disabled+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gene expression from transcriptionally disabled retroviral vectors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (15), 5197-5201 (1987).</li>
</ol>

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이 프로토콜은 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템에서 사용하는 인공 miRNA의 형질전환 발현에 의해 발달 중인 병아리 망막의 유전자 침묵에 대한 자세한 가이드를 제공합니다.
이 기술을 성공적으로 수행하는 데 중요한 요소는 다음과 같습니다. 첫째, 강력한 녹다운 효과를 발휘하는 것으로 확인된 miRNA 염기서열을 사용하는 것이 중요합니다. 생체 내 전기천공에 적용하기 전에 시험관 내 분석(단계 1.4)에서 유전자 억제 효율에 대해 개별 pre-miRNA 서열을 테스트하고 가장 높은 녹다운 활성을 나타내는 두 개의 pre-miRNA 서열을 연결합니다(단계 1.5). 둘째, DNA 용액 주입을 위해 마이크로피펫 바늘을 삽입할 때 시신경 소포와 주변 신경 조직을 손상시키지 않는 것이 중요합니다. 배아에 대한 과도한 손상은 배아 기형과 사망으로 이어질 수 있습니다. 조직 손상을 방지하려면 마이크로피펫...

척추동물 망막은 신경 발달을 연구하기 위한 중요한 모델 시스템입니다. 말초 위치에도 불구하고 망막은 해부학적으로나 발달적으로 중추 신경계의 확장이며, 망막 신경절 세포의 축삭으로 구성된 시신경은 중추 신경계 내의 관을 나타냅니다. 병아리 망막은 신경 발달의 분자 메커니즘을 연구하는 모델 시스템으로서 상당한 이점을 가지고 있습니다. 그것은 인간 망막과 구조적 및 기능적 유사성을 가지고 있습니다. 시각화 및 실험적 조작을 위해 접근성이 높습니다. 신경 발달 중 세포 증식 및 분화, 형태 형성 및 축삭 유도의 분자 메커니즘은 닭 망막을 사용하여 광범위하게 연구되었습니다.
난소에서 전기천공법은 발달 중인 병아리 배아의 세포에 이소성 유전자를 도입하기 위해 지난 20년 동안 성공적으로 사용되었습니다. 이 기술은 발달 중인 세포의 표지, 세포 운명 추적, 세포 이동 및 축삭관 추적, 유전자 기능의 생체 내 분석을 위한 이소성 유전자 발현을 가능하게 합니다. 병아리 배아에서 효율적인 이소성 유전자 발현을 위한 난소 전기천공법의 조건은 잘 확립되어 있다 1,2,3.
이러한 장점에도 불구하고 유전자 기능 연구를 위한 안정적인 기능 상실 기술의 부족은 병아리 배아의 주요 기술적 한계였습니다. 작은 간섭 RNA(siRNA)4 또는 짧은 헤어핀 RNA(shRNA)5 에 대한 발현 벡터로 전기천공된 병아리 배아는 표적 유전자의 녹다운을 나타내는 반면, 세포가 도입된 RNA 또는 DNA를 잃으면 효과가 사라지기 때문에 이러한 접근 방식에서 유전자 억제는 일시적입니다. 보다 안정적인 유전자 억제는 RCAS(Replication Competent Avian sarcoma-leukosis virus(ASLV) long terminal repeat) with a Splice acceptor) 레트로바이러스 시스템에 의해 siRNA를 병아리 배아에 전달함으로써 달성될 수 있다6. 바이러스 벡터는 숙주 게놈에 통합되고 이소성 유전자는 안정적으로 발현됩니다. 그러나 레트로바이러스는 세포 주기의 유사분열(M) 단계 동안에만 분열하는 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이는 이러한 기능 상실 접근법을 적용할 수 있는 발달 단계 및/또는 세포 유형에 제한을 가할 수 있습니다. 또한, RCAS에 의한 이식유전자의 발현은 ovo전기천공법(ovo)전기천공법( ovo electroporation)에 의해 유도된 것보다 느리고 덜 견고하게 나타난다7.
트랜스포존은 게놈의 한 위치에서 다른 위치로 이동하는 유전적 요소입니다. Tol2 요소는 hAT 전치 가능한 요소 패밀리의 구성원이며, Tol2 요소8의 트랜스포존 반응을 촉매하는 트랜스포사제를 코딩하는 내부 유전자를 함유한다. Tol2 요소(각각 200 bp 및 150 bp)의 좌측 및 우측 말단의 서열에 의해 측면 배치된 유전자 발현 카세트를 운반하는 플라스미드 벡터가 Tol2 전이효소 발현 구조체를 갖는 척추동물 세포 내로 도입될 때, 발현 카세트는 플라스미드로부터 절제되어 이소성 유전자의 안정적인 발현을 지원하는 숙주 게놈 내로 통합된다(도 1). Tol2 전치 요소는 제브라피쉬9,10, 개구리 11, 병아리12 및 생쥐 13을 포함한 다양한 척추동물 종에서 유전자 전이를 매우 효율적으로 유도할 수 있는 것으로 나타났으며, 따라서 형질전환 및 삽입 돌연변이 유발에 유용한 방법입니다. Tol2 트랜스포존 시스템은 긴 이중 가닥 RNA14에서 처리되는 siRNA의 게놈 통합에 의한 표적 유전자의 조건부 녹다운에 성공적으로 사용되었습니다.
이 프로토콜은 Tol2 트랜스포존 시스템15,16에 의한 인공 마이크로RNA(miRNA)의 도입을 포함하는 병아리 배아에서의 기능 상실 접근법을 설명한다. 이 접근법에서는 표적 유전자에 대한 EmGFP(에메랄드 그린 형광 단백질) 마커 및 인공 miRNA에 대한 발현 카세트를 Tol2 트랜스포존 벡터에 클로닝합니다. 이어서, Tol2 트랜스포존 구축물은 난소 전기천공에 의해 Tol2 트랜스포사제 발현 구축물과 함께 배아 병아리 망막 내로 도입된다. 형질감염된 망막 세포에서 전이효소는 트랜스포존 벡터에서 발현 카세트의 절제와 숙주 염색체로의 통합을 촉매하여 miRNA 및 EmGFP 단백질의 안정적인 발현을 유도합니다. 우리의 이전 연구에서, 우리는 발달중인 병아리 망막에서 신경계에서 주로 발현되는 세포 외 당 단백질 인 Nel의 발현을 성공적으로 무너 뜨 렸습니다 (대표 결과 참조). 우리의 결과는 이 기술에 의해 ovo에서 안정적이고 효율적인 유전자 억제가 달성될 수 있음을 나타냅니다.

<table><tbody><tr><td>18G 바늘, 2"</td><td>VWR</td><td>89219-320</td><td></td></tr><tr><td>AP-TAG 키트 A 및 AP-TAG 키트 B</td><td>AP 융합 단백질 (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)을 만들기 위한</td> <td>GenHunter Corp</td><td>Q201 및 Q202</td> 플라스미드 벡터</tr><tr><td>Block-iT RNAi Designer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>표적 염기서열 선택 및 pre-miRNA 염기서열 설계를 위한 온라인 도구(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/</td></tr><tr><td>)BSA 10 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>C115CB 케이블</td><td>Sonidel</td><td>C115CB</td><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;254</td></tr><tr><td>C117 케이블</td><td>Sonidel</td><td>C117</td><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;252</td></tr><tr><td>오메가 도트 섬유가 있는 모세관 (마이크로 피펫 바늘)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>1 mm O.D. 0.75 mm I.D</td></tr><tr><td>CUY21 구형파 전기천공기</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>Diethanolamine (pH 9.8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8885</td><td></td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>알 인큐베이터</td><td></td><td>Kurl B-Lab-600-110</td><td>https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html</td></tr><tr><td>전극 홀더</td><td>Sonidel</td><td>CUY580</td><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;85</td></tr><tr><td>전극</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY611P3-1</td><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;94</td></tr><tr><td>Electromax DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>18290-015</td><td>Electrocompetent E. coli cells</td></tr><tr><td>Fast green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td></td></tr> <tr><td>상업용 공급업체(예: Charles River) 또는 지역 농부</td><td></td><td></td>로부터 얻은<td>수정 계란(Gallus gallus)</td></tr> <tr><td>구즈넥 섬유 광원</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FuGene 6 형질 주입 시약</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>해밀턴 주사기 (50 &mu; L)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20715</td><td>Hamilton Cat No&nbsp; 80901</td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Heavy mineral oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>L-Homoarginine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H10007</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13112</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige (일본)</td><td>MM3</td><td>http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html</td></tr><tr><td>Micropipette puller</td><td>Shutter Instrument</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>p-Nitrophenylphosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-T2TP vector</td><td></td><td></td><td>Tol2 transposase 발현 플라스미드. Koichi Kawakami (일본 국립 유전학 연구소)의 관대 한 선물. Addgene에서도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>ThermoFisher</td><td>F566S</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer (Optional)</td> <td>Parker</td><td></td><td>압력 미세주입 시스템</td></tr><tr><td>플라스미드 맥시 키트</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>플라스미드 maxiprep 키트</td></tr><tr><td>pT2K-CAGGS 벡터</td><td></td><td></td><td>Tol2 트랜스포손 벡터. Yoshiko Takahashi (Kyoto University, Japan)</td></tr><tr><td>PVC tubing</td><td>VWR (UK)</td><td>228-3830</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9007-5</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP</td><td>Invitrogen</td><td>K493600</td><td>miRNA 발현 벡터(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA), 대조 벡터(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negative control plasmid), 부속 시약 및 지침 (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)</td></tr><tr><td>Thermal cycler를</td><td></td><td></td><td></td></tr> 포함합니다.</tbody></table>

인공 microrna의 tol2 transposon-mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

병아리 망막은 오랫동안 발달 신경 생물학에서 중요한 모델 시스템이었으며 큰 크기, 빠른 발달, 시각화 및 실험 조작을 위한 접근성 등의 장점이 있습니다. 그러나 주요 기술적 한계는 유전자 기능 분석을 위한 강력한 기능 상실 접근법이 없다는 것이었습니다. 이 프로토콜은 Tol2 트랜스포존 시스템을 사용하여 인공 microRNA(miRNA)의 형질전환 발현을 포함하는 발달 중인 병아리 망막에서 유전자 침묵 방법론을 설명합니다. 이 접근법에서, EmGFP(에메랄드 그린 형광 단백질) 마커에 대한 발현 카세트와 표적 유전자에 대한 인공 pre-miRNA 서열을 포함하는 Tol2 트랜스포존 플라스미드는 난소 전기천공에 의해 Tol2 트랜스포사제 발현 구조체와 함께 배아 병아리 망막에 도입됩니다. 형질감염된 망막 세포에서 전이효소는 트랜스포존 벡터에서 발현 카세트의 절제와 숙주 염색체로의 통합을 촉매하여 miRNA 및 EmGFP 단백질의 안정적인 발현을 유도합니다. 이전 연구에서 우리는 이 기술을 사용하여 신경 발달에서 여러 기능을 발휘하는 당단백질인 Nel의 발현이 발달 중인 병아리 망막에서 크게 억제될 수 있음을 입증했습니다. 우리의 결과는 이 방법론이 유전자 발현의 안정적이고 강력한 억제를 유도하여 망막 발달 연구를 위한 효율적인 기능 상실 접근법을 제공한다는 것을 나타냅니다.

Nel에 대한 인공 miRNA의 발현을 위한 Tol2 트랜스포존 구조의 구성 넬(Nénural Epidermal growth factor(EGF)-Like; Nell2라고도 함)은 세포외 당단백질이다. 그것은 thrombospondin-1과 구조적 유사성을 가지고 있으며 주로 신경계에서 발현됩니다20,21. 우리는 이전에 Nel이 망막 신경절 세포15의 분화와 생존을 조절하고 망막 축삭22,23,24에 대한 억제 유도 신호로 작용한다는 것을 입증했습니다. 발달중인 병아리 망막에서, Nel 발현은 HH15 (배아 일 (E) 2.5)의 추정 색소 상...

우리는 ovo electroporation 및 Tol2 transposon 시스템을 사용하여 병아리 배아에 인공 마이크로 RNA 서열을 도입하고 게놈 통합하는 새로운 기능 상실 접근 방식을 개발했습니다. 이 기술은 개발 중 유전자 기능 연구를 위한 강력하고 안정적인 유전자 녹다운 방법론을 제공합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

이 방법론은 병아리의 망막 발달 연구를 위한 기능 상실 접근법을 제공합니다. 이 기술은 망막의 특정 영역에서 표적 유전자의 신속하고 지속적인 억제를 지원합니다. 이 접근법은 신경 조직과 비신경 조직을 모두 포함하여 병아리 배아의 다른 부분에도 적용될 수 있습니다.oovo electroporation의 경우 25mg의 Fast Green FCF를 10ml의 PBS에 용해시켜 0.25%Fast Green 용액을 준비한 다음 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다. 다음으로, microRNA 에메랄드 GFP 플라스미드와 Tol2 트랜스포사아제 발현 플라스미드를 2:1 비율로 혼합하여 DNA 칵테일 주사액을 제조한다. 그런 다음 주입 된 영역의 시각화를 위해 준비된 Fast Green 용액을 DNA 칵테일에 1 대 10 비율로 첨가하십시오.다음으로, 미세주입 장치를 설정한다. 이 장치는 해밀턴 주사기, 18 게이지 2 인치 바늘, 2 센티미터 길이의 폴리 염화 비닐 튜브 및 마이크로 피펫 바늘로 구성됩니다. 해밀턴 주사기에 중광유를 채운 다음 18게이지 바늘을 주사기에 부착하고 주사기 플런저를 눌러 바늘 내부 공간을 기름으로 채웁니다.다음으로 폴리염화비닐 튜브를 바늘 끝에 부착하고 튜브에 오일을 채웁니다. 당겨진 마이크로피펫 바늘을 튜브에 부착합니다. 그런 다음 미세 집게를 사용하여 해부 현미경으로 바늘 끝을 직경 10-20 마이크로 미터로 떼어 내고 작은 구멍을 만듭니다.바늘 전체에 기름을 채 웁니다. 다음으로, 5 마이크로 리터의 착색 된 DNA 칵테일을 페트리 접시에 넣는다. 해부 현미경 아래에서 마이크로 피펫 바늘의 끝을 페트리 접시의 DNA 용액에 넣고 용액을 천천히 바늘에 넣습니다.바늘 내부와 외부의 압력이 평형을 이룬 후 바늘 끝을 DNA 용액에서 꺼내 주사할 때까지 작은 비커에 멸균된 PBS에 담근다. 그런 다음 전기 천공 장치를 설정하려면 미세 조작기의 전극 홀더로 한 쌍의 백금 전극을 단단히 고정하십시오. 전극 끝 사이의 간격을 2mm로 조정하고 전극을 케이블로 구형파 펄스 발생기에 연결합니다.다음으로, DNA 미세 주입을 위해 인큐베이터에서 수정 된 화이트 레그혼 알을 제거하고 70 % 에탄올에 적신 티슈 페이퍼로 알의 표면을 닦습니다. 그런 다음 18 게이지 바늘을 10 밀리리터 주사기에 부착하고 노른자가 손상되지 않도록 아래쪽으로 기울어 진 계란의 뭉툭한 끝을 통해 바늘을 삽입합니다. 달걀에서 2-3 밀리리터의 알부민을 꺼낸 후 스카치 테이프로 구멍을 막고 배아와 유리막이 껍질에서 분리되도록하기 위해 달걀에 빛을 촛불로 촛불을 켭니다.다음으로, 집게를 사용하여 달걀 꼭대기에서 달걀 껍질을 제거하여 배아를 노출시킵니다. 전기천공 중 배아가 마르는 것을 방지하기 위해 한 번에 5개 이상의 알을 낳지 마십시오. 바늘 끝을 근위부에서 시신경에 45도 각도로 삽입하고 파란색 용액이 내강을 채울 때까지 플런저를 천천히 눌러 DNA 칵테일을 주입합니다.바늘을 빼고 끝을 PBS에 다시 넣습니다. electroporation의 경우 펄스 전압을 15V로, 펄스 길이를 15밀리초로, 펄스 간격을 915밀리초로, 펄스 수를 5로 설정합니다. 배아 위의 바이텔린 막에 HBSS 몇 방울을 추가한 후 미세 매니퓰레이터를 사용하여 전극을 배아의 전후 축에 수직인 HBSS로 내립니다.시신경의 양쪽에 전극을 놓고 전극이 배아나 혈관에 닿지 않도록 한 다음 펄스 전기장을 적용합니다. 전기천공이 완료되면 전극을 제거하고 알부민 축적을 방지하기 위해 물에 적신 멸균 면봉으로 전극을 부드럽게 청소합니다. 스카치 테이프로 창을 밀봉하고 원하는 발달 단계까지 배아를 재배양하십시오.개별적인 pre-microRNA 서열을 Nel AP 발현 HEK293T 세포 내로 형질감염시키는 것은 뉴클레오티드 482 내지 502, 910 내지 930, 및 2461 내지 2481에 대한 구축물에 의한 Nel 발현의 현저한 억제를 초래하였다. 두 개의 microRNA 서열을 연결하면 녹다운 효율이 크게 향상되었습니다. 세 가지 조합 모두 사슬이 없는 개별 pre-microRNA 서열에 비해 향상된 억제 활성을 보여주었습니다.형질감염 후 최소 13일에 강력한 억제가 관찰되었습니다. 뉴클레오티드 482 내지 502 및 2461 내지 2481을 표적으로 하는 Nel pre-microRNA 구조체를 트랜스포사제 발현 벡터와 함께 병아리 망막 내로 공동 형질감염시켰을 때, 배아 4.5일째에 에메랄드 GFP 발현 세포에서 망막 색소 상피에서의 Nel 발현이 유의하게 감소하였다. 생후 8일 된 배아에서, Nel 발현은 또한 망막 신경절 세포에서 감소하였다.대조적으로, 망막에서의 Nel 발현은 대조군 microRNA의 도입에 의해 영향을 받지 않았다. 이 절차에 따라 세포 증식 및 분화, 세포 사멸, 세포 및 축삭 추적 검사와 같은 다양한 방법을 사용하여 표적 유전자 억제에 미치는 영향을 검사할 수 있습니다.

loss-function-approach-embryonic-chick-retina-using-tol2-transposon

Research

연구

JoVE Journal

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이소성 표현은 두뇌 발달의 마이크로 RNA의 역할을 명료하게 한 기술이다. 그러나, 비켜 일렉트로에 사용하여 특정 영역을 대상으로하는 것은 도전이다. 여기, 우리는 효율적으로 선택적으로 electroporate 복부와 등쪽 중뇌 영역에 표시됩니다.

복부 병아리 중뇌에있는 마이크로 RNA의 오보, 식

배아 병아리 망막 세포 배양은 광 수용체 생물학의 연구에 유용한 도구를 구성한다. 우리는 이전에 배양 망막의 플라스미드 일렉트로 오보 EX에 기초한 효율적인 유전자 전달 기술을 개발했다. 이 기술은 상당히이 시스템에 대한 가능한 유전자 조작을하고, 현재 사용 가능한 프로토콜을 통해 형질 전환 효율을 증가시킨다.

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근

이 프로토콜의 목표는 loss-을 설명하고 이득의 trophectoderm 및 착상 마우스 배아의 내부 세포 덩어리 분화에 이르게 무대 특정 수용체​​로 neogenin 확인할 적용 기능 방법입니다.

착상 전의 마우스 배아의 초기 세포 운명 결정 요인을 조사 할 Loss- 및 이득 -의 - 기능 접근

서로 다른 유전 적 배경에서 개별 WT 망막 전구 세포의 실시간 추적은 신경 동안 셀이 아닌 자율적 인 신호의 기여도의 평가를 할 수 있습니다. 여기서, 배아 이식을 통한 생체 저속 촛점 촬상 유전자 녹다운, 키메라 세대의 조합이 목적을 위해 사용 하였다.

키메라 Zebrafish의 태아의 개별 망막 전구 세포의 형질 전환 유전자 발현의 생체 내 이미징에서 세포 비 자립적 영향을 연구하기 위해

이 프로토콜은 인공 예측에 관한 중재 RNA 간섭 그대로 신경 회로 내에서 선택적 gene(s)의 감소 식이 구체적으로 연 접 boutons를 자극 하는 optogenetics와 결합 하는 방법에 대 한 워크플로우를 제공 합니다.

연 접 기능 그대로 신경 회로 내에 유전자 최저 효과 특성 인공 microRNAs Optogenetics 결합

이 프로토콜 논문은 렌즈 발달 중 단백질의 in situ 기능 및 발현을 연구하기 위한 도구로서 RCAS(A) 레트로바이러스의 배아 닭 수정체 미세 주입 방법론을 설명합니다.

재조합 RCAS(A) 레트로바이러스를 배아 닭 수정체에 미세주입

배우세요 Tol2 transposon을 이용한 인공 microRNA 형질전환으로 병아리 배아 망막에서 유전자 기능 상실을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 안정적이고 효율적인 유전자 억제를 가능하게 합니다.

인공 microRNA의 Tol2 Transposon-Mediated 형질전환 발현을 사용한 배아 병아리 망막의 기능 상실 접근법

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