Name: NAFLD/NASH의 쥐 모형에 초음파 및 전단 파 단층 사진 의 응용 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 학습하세요 초음파 및 전단파 탄성초음파를 활용한 비침습적 간 지방과 섬유화 측정 방법을 쥐 모델에서 적용하는 기술입니다. 이 프로토콜은 NAFLD/NASH 연구에서 생체 내 질병 진행을 모니터링하고 약물 효능을 평가하는 데 활용됩니다.

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저자는 연구 동물의 건강을 돌보고 보장하고 일부 기술을 지원한 화이자 비교 의학 운영 팀에게 감사를 표하고 싶습니다. 또한, 감사는 조직 분석을위한 조직 처리에 대한 자신의 도움에 대한 다니엘 크로웰, 게리 Seitis, 제니퍼 애슐리 올슨에 빚이있다. 또한, 저자는 이 원고를 준비하는 동안 줄리타 라미레즈에게 귀중한 피드백을 검토하고 제공한 것에 대해 감사드립니다.

화이자의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 검토 및 승인된 모든 동물 관련 절차는 AAALAC (실험실 동물 관리의 평가 및 인증) 국제 공인 시설에서 수행되었습니다.
1. 질병 유도
<ol><li>알려진 쥐 출현 병원균이 없는 수컷 위스터 한 쥐(150-175g; ~ 6-7주, 총 40마리의 쥐)를 사용하십시오. 개별적으로 통풍이 잘 되는 채 로 쥐를 종이 침구(재료 표참조)로 채석하고 22± 1°C, 40-70% 상대 습도에서 12:12h 의 밝은 어두운 사이클로 유지한다.</li>
	<li>연구 설계에 따라 1%의 콜레스테롤(n=20) 또는 표준 실험실 설치류 차우(n= 20)를 가진 콜린 결핍, 고지방 식단에 150-175g(~6-7주 전)의 쥐를 배치한다. 참고: 이 연구에서는 그룹당 총 40마리의 쥐가 20마리의 동물과 함께 등록되었습니다. 6주 말에, 각 그룹에서 코호트의 절반은 간 샘플의 중간 연구 조직 분석을 위해 부검되었다. 따라서, 표본크기는9일과 12일 주 시간포인트에 대해 그룹당 10마리의 동물이었다.</li>
</ol>2. 악기 설정
<ol><li>이미징 영역을 다음과 같이 설정: 이미징 중에 동물을 따뜻하게 유지하기 위해 온난한 표면(도 1에서c) 및 흡입제 마취를 전달하는 안전한 마취 코 콘(도 1에서b)을 포함한다.</li>
	<li>초음파 프로브 홀더를 사용하여 초음파 프로브를 원하는 위치로 옮기고 프로브가 동물에 놓이지 않도록하십시오.<ol>
<li>초음파 이미지가 획득되는 피부에 따뜻한 초음파 젤을 사용하십시오.</li>
		<li>터치 스크린에서 조정할 수 있는 절차 전반에 걸쳐 다음 설정을 유지합니다: 음향 력 0.0 dB; 티슈 튜너 1540 m/s; 다이나믹 레인지 60 dB; 탄성 범위 (SWE 모드용) < 30 kPa.</li>
	</ol>
</li>
	<li>특수 홀더(도 1)의레일 시스템에 초음파 프로브를 부착합니다.</li>
	<li>기기를 켜고 부팅할 수 있습니다. 모니터가 켜져 있으면 연결된 트랜스듀서 세부 정보가 있는 B 모드 이미지를 확인합니다.</li>
</ol>3. 주제 준비
<ol><li>동물들이 화상 촬영을 방해하지 않도록 이미징 절차 전에 적어도 4 시간 동안 금식되었는지 확인하십시오.<ol>
<li>금식의 적어도 4 시간 후에, 마취의 적당한 수준이 도달할 때까지 이소플루란 마취 유도 챔버에 쥐를 놓고, 발가락 핀치에 대한 반응에 의해 확인됩니다. 동물을 3-5%의 이소플루란에 3-5분 간 노출하여 마취를 유도합니다.</li>
		<li>유지 보수 마취의 경우 이미지 수집 중에 동물을 2-3 % 이소플루란 아래에 보관하십시오. 마취 중 건조로부터 눈을 보호하기 위해 안과 연고를 적용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>마취가 완료되면 유도 챔버에서 동물을 제거하고 따뜻한 뜨거운 물이 순환 담요에 놓습니다. 주미 위에 마취 코 콘을 놓고 흉곽에서 골반에 이르기까지 오른쪽에 있는 동물을 면도합니다. 화학 적 제모 크림을 사용하여이 부위의 나머지 모든 머리카락을 제거하십시오.</li>
	<li>모발이 제거되면, 따뜻한 이미징 플랫폼(그림 3A)에머리 위에 테이프 상단 발을 가진 왼쪽 측면 회식에 동물을 배치합니다.</li>
	<li>계기판에 있는 환자 키를 누르고, 연구 설계에 따라 피사체를 식별합니다.<ol>
<li>터치 스크린의 아이콘을 눌러 기기에서 키보드 기능을 엽니다. 원하는 대로 이름을 입력합니다.</li>
		<li>종료를 눌러 환자 이름 화면을 종료합니다. 모니터에서 B 모드가 다시 열리는 것을 관찰합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 간신장(HR) 인덱스 측정을 위한 이미지 획득
<ol><li>동물의 미지근한 피부 부위에 소량의 따뜻한 초음파 젤을 발라주세요.</li>
	<li>초음파 프로브를 이동하여 피사체의 겔 커버영역(도 3B)을터치합니다. 피사체의 내부 장기의 라이브 B 모드 이미지가 모니터에 나타나면 초음파 프로브를 엉덩이 위의 영역으로 약간 이동하여 요추 척추 (궁근)와 평행하게 움직입니다.</li>
	<li>모니터에 B 모드 디스플레이를 사용하여 큰 신장 동맥 및 피질/수질분리(도 4A)를식별하여 오른쪽 신장을 찾습니다. 또한, 이미지의 단일 평면에서 간 부분을 관찰한다.<ol>
<li>그림자 및 기포와 같은 이미지 아티팩트가 거의 또는 전혀 없는지 확인합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>HR 인덱스를 얻기 위해 B 모드 비율을 측정합니다.<ol>
<li>신장 피질과 간 빈맥이 모두 같은 초점 평면에 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 포커스를 조정하고 컨트롤을 확보하여 선명한 이미지를 얻습니다.<ol>
<li>컨트롤 패널에서 초점 노브를 돌려 포커스를 조정합니다. 자동 TGC 버튼을 한 번 눌러 게인을 조정합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>컨트롤 패널에서 동결 키를 누릅니다. 흐릿한 이미지를 피하기 위해 화면을 얼어 붙을 때 동물이 호흡 사이에 있는지 확인하십시오.</li>
		<li>화면이 고정되면 터치 스크린에서 측정 도구를 탭합니다. 선택한 관심 영역에서 조직의 상대적 밝기를 측정하는 기본 제공 도구인 B 모드 비율을선택합니다. 관심 영역(ROI)을 선택하려면 2mm 원을 만듭니다. 컨트롤 패널의 트랙볼 바깥쪽 가장자리를 따라 손가락을 이동하여 원 크기를 조정합니다.</li>
		<li>신장의 오른쪽에 위치해야 간 이미지 ROI에 2mm 원을 배치합니다. 동질적인 반향성과 매끄러운 윤곽에 따라 간 조직을 식별합니다.</li>
		<li>원이 제자리에 있으면 컨트롤 패널의 선택 단추를 누르고 나타나는 새 원을 관찰합니다.</li>
		<li>새 원의 크기를 2mm로 조정하고 신장 피질의 이미지에 놓습니다. 간과 신장 피질에 원의 깊이를 동일하게 유지하십시오. 일단 제자리에 있으면 컨트롤 패널의 선택 버튼을 누릅니다. 기본 제공 시스템 도구를 관찰하여 HR 인덱스를 B 모드 비율로 표시합니다.</li>
		<li>이미지 저장을 눌러 이미지를 저장하고 모니터 오른쪽에 축소판으로 나타나는 저장된 이미지를 관찰합니다.</li>
		<li>컨트롤 패널의 동결 버튼을 눌러 이미지를 고정해제하고 라이브 B 모드 이미지로 돌아갑니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>B 모드 비율 측정을 조직의 서로 다른 깊이와 평면에서 3번 반복합니다. 각 동물 및 시간 점에 대해 이 세 가지 B 모드 비율의 평균을 계산합니다.</li>
</ol>5. 전단 웨이브 엘라스토그래피에 대한 이미지 수집
<ol><li>프로브를 오른쪽 하위 코스부분에서 가로방향으로 이동하여 B 모드를 사용하여 간을 찾습니다. 주로 빈약한 간 영역을 찾아 포털 정맥과 간 동맥과 같은 큰 혈관이 없습니다. 간의 명확한 영역이 발견되면, 제어판에 SWE 버튼을 눌러 조직의 전단 탄성지도를 생성합니다.</li>
	<li>그림자가 없는 부위에 간 캡슐 아래의 SWE 상자의 크기와 위치를 조정합니다. 캡슐을 간 상단 근처의 밝은 에코겐성 선으로 식별합니다.</li>
	<li>SWE 상자가 5-10 s 이내에 있는 색상 맵으로 전환되는 것을 관찰합니다. 상자가 가득 차서 안정되면 동물이 호흡 사이에있을 때 제어판의 동결 버튼을 누릅니다. 참고: 상자 커버리지의 최소 량은 60-80%여야 하며, 이는 간 탄력성을 정확하게 평가해야 합니다.</li>
	<li>터치 스크린에서 전단 파 탄력맵에서 ROI의 탄력성을 계산하는 기본 제공 시스템 도구인 QBox를탭합니다. 모니터에 나타나는 원 과 데이터 상자를 관찰합니다. 터치 스크린의 위치 아이콘을 원하는 설정으로 눌러 QBox의 위치를 조정합니다.</li>
	<li>컨트롤 패널의 트랙볼 바깥쪽 가장자리를 따라 손가락을 움직여 원의 크기를 3mm로 조정합니다. 트랙볼을 사용하여 균일한 색소로 그림자가 없는 영역에 원을 배치합니다(도5A,B). 혈관이나 간 캡슐과 같은 강성의 알려진 영역을 피하기 위해주의, 뿐만 아니라 이러한 구조에서 출혈.</li>
	<li>적절한 영역이 발견되면 컨트롤 패널에서 이미지 저장을 눌러 이미지를 저장합니다. 간의 다른 지역에서 이 절차를 3번 반복하십시오. 프로브를 복부에 위아래로 움직여 간 부위의 SWE 매핑 된 이미지를 수집합니다.</li>
	<li>모든 이미지가 수집되면 제어판에서 종료 시험을 누르고 모니터에 나타나는 환자 정보 화면을 기록합니다.</li>
	<li>동물의 발에서 테이프를 제거하고, 여분의 젤을 닦고, 이미징 단계에서 동물을 제거합니다. 완전히 회복 될 때까지 따뜻하고 건조한 케이지에서 마취에서 회복하십시오. 각 동물을 모니터링하여 마취에서 완전한 회복을 보장하며, 흉골 자제력을 유지하는 능력에 의해 표시됩니다.</li>
	<li>코호트의 각 동물이 이미지화할 수 있도록 4-5절의 단계를 반복합니다.</li>
</ol>6. 이미지 데이터 검색 및 분석
<ol><li>모든 동물에 대한 이미지가 수집되면 마취를 끕니다.</li>
	<li>컴퓨터에서 이미지 데이터를 가져오려면 제어판의 검토 버튼을 누르고 모니터에 나타나는 해당 계측기에서 수행되는 모든 검사를 관찰합니다. 화면 상단 모서리에 있는 검색 창을 사용하여 원하는 스캔을 검색합니다.</li>
	<li>트랙볼 및 선택 버튼을 통해 환자의 이름 옆에 있는 상자를 선택하여 데이터 분석에 필요한 모든 검사를 선택합니다. 필요한 모든 검사가 강조 표시되면 터치 화면에서 내보내기 JpEG를 선택합니다. 데이터를 네트워크 드라이브 또는 USB(휴대용 유니버설 시리얼 버스) 드라이브로 내보냅니다. 기기 뒷면의 USB 포트를 찾습니다.</li>
	<li>파일이 내보내지면 워크스테이션 컴퓨터에서 각 검사의 개별 jpg 파일을 엽니다. 이미지의 오른쪽에 있는 모든 데이터를 관찰: B 모드 비율-B 비율 수를 수집; Q Box-는 평균 탄성(kPa) 값을 수집합니다.</li>
	<li>모든 데이터를 스프레드시트 또는 기타 데이터베이스 관리 소프트웨어에 입력하고 원하는 통계 분석을 수행합니다.</li>
</ol>7. 간 샘플의 조직학적 분석
<ol><li>6주 말에, 간 샘플의 중간 연구 조직 분석을 위해 각 그룹에서 코호트의 절반에 부검을 수행. 마찬가지로, 동물의 코호트의 나머지 부분을 안락사시키고, 12주 시점에서 조직학적 분석을 위해 간 샘플을 수집합니다.</li>
	<li>ORO 염색의 경우, 간 단면을 10% 중성 완충 포르말린으로 수정하고, 냉장 된 30 % 자당 용액을 최소한 시간 동안 사용하여 자당으로 냉동 보존하십시오. Cryo-는 최적의 절삭 온도 화합물에 섹션을 포함하고, 냉동고 섹션은 ORO 염색을 준비하기 위해 충전 된 슬라이드에 그들을 포함.</li>
	<li>저온 구간을 100% 프로필렌 글리콜에 2분 간 배치한 다음, 0.5% ORO 용액으로 하룻밤 잠복이 됩니다. ORO 용액에서 제거한 후, 85% 프로필렌 글리콜을 1분 동안, 산화된 물에 헹구고, 메이어의 헤마톡시린 릴리의 수정으로 1분 간 카운터스테인을 분으로 분별한다.<ol>
<li>수성 장착 매체를 사용하여 슬라이드에 커버립을 놓고 실온에서 건조시.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PSR의 경우, 포르말린 고정, 파라핀 임베디드 간 단면 슬라이드, 부인 유체에 하룻밤 을 배치한 다음, 일부 최적화 된 단계 (1 % 인산 염산 5 분, 0.1 % 시리우스 레드 90 분; 20 분) 및 20 분 에 대한 30%의 세이스틱 산으로 제조 자의 프로토콜에 따라 자동화 된 슬라이드 얼룩을 사용하여 얼룩을 만듭니다. 슬라이드를 자동으로 탈수한 다음 영구 장착 매체로 장착합니다.</li>
	<li>20배 배율의 디지털 현미경 스캐너를 사용하여 ORO 및 PSR 염색 슬라이드의 이미지를 캡처하고.svs 형식으로 저장하고 슬라이드 관리자 이미지 데이터베이스에 저장합니다.</li>
	<li>디지털 병리학 소프트웨어에서 만든 사용자 지정 알고리즘을 사용하여 이미지를 분석합니다. 임계값 매개 변수가 있는 디지털 병리학 소프트웨어 응용 프로그램을 균일하게 적용하여 ORO 및 PSR 염색 영역뿐만 아니라 간 섹션 영역을 식별하고 정량화합니다. 영역 백분율 계산을 위해 측정값을 스프레드시트로 내보냅니다.</li>
</ol>8. 통계 분석
<ol><li>Sidak의 다중 비교 테스트를 사용하여 양방향 ANOVA를 사용하여 이미징 데이터의 통계 분석을 수행하여 서로 다른 시점에서 그룹 간의 차이를 평가합니다. 확률 값 p에 대한 그룹 간의 상당한 차이를 가정p ≤ 0.001. 또한 조직학 분석과 이미징 판독값의 상관 관계를 수행합니다.</li>
	<li>비파라메트릭 통계를 사용하여 이 연구의 조직학 분석 결과를 분석합니다. 그룹 값을 중간 ± 반중사 범위(sIQR)로 보고합니다. 확률 값 p에 대한 그룹 간의 상당한 차이를 가정p ≤ 0.001. Mann-Whitney 테스트를 사용하여 PSR 및 ORO 히스토케미컬 얼룩의 양을 다른 그룹 간의 비교합니다.</li>
</ol>

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</ol>

모든 저자는 화이자, Inc.의 직원입니다.

SWE를 포함하여 초음파 기지를 둔 화상 진찰은, NAFLD/NASH의 전임상 모형에 있는 간 steatosis 및 뻣뻣함의 종방향 평가를 위한 귀중한 공구일 수 있습니다. 이 논문은 NASH의 CDAHFD 다이어트 유도 쥐 모델을 사용하여 HR 지수 및 탄성의 측정을 위한 고품질 B 모드뿐만 아니라 간 SWE 이미지를 획득하는 방법에 대한 상세한 방법론을 설명합니다. 또한, 결과는 간 조직의 평가-조직학적 평가의 금본위제와 HR 지수 및 탄성의 우수한 상관관계를 나타낸다. 프로시저 자체는 복잡하지 않은 것처럼 보이지만 성공적인 결과를 보장하는 프로토콜의 몇 가지 중요한 측면이 있습니다.
트랜스듀서의 배치는 특히 B 모드에서 HR 인덱스를 측정하는 신장을 찾는 데 중요합니다. 프로브를 갈비뼈에 너무 가깝게 두면 갈비뼈가 생길 수 있으며, 이는 초음파 감쇠의 잘못된 측정을 생성합니다. 또한 면도 및 탈약 크림을 사용하여 모든 모발을 제거하는 것이 중요하며, 남은 머리카락은 기포를 ...

비알코올성 지방간질환(NAFLD)은 간에서 과도한 지방축적을 특징으로 하는 대사 상태이며, 최근 보고된 글로벌 보급률25%1로전 세계적으로 선도적인 간질환이 되고 있다. 무알코올 성 세포 간염 (NASH)은 NAFLD의 스펙트럼의 더 진행 단계이며, 진보적 인 세포 손상, 염증 및 섬유증을 가진 과잉 간 지방을 특징으로합니다. 이 질병은 환자의 간에서 상당한 손상이 이미 발생할 때까지 혈액 검사 또는 일상적인 검사를 통해 발견되지 않는 종종 침묵합니다. 현재, 환자에서 NASH를 진단하는 금 본위제는 환자 유래 간 생검 샘플의 조직학적 검사를 통해서이다. 유사하게, NASH/NAFLD의 병인뿐만 아니라 약물 개발 산업을 이해하기 위해 일하는 전임상 연구자들은 세포증, 염증 및 섬유증을 측정하기 위해 조직학을 위한 위성 코호트의 간 샘플 또는 말기 안락사의 생체 내 쐐기 생검에 의존합니다.
예를 들어, 간 쐐기 생검은 GUBRA NASH 모델2를사용하는 동안 간 간염과 섬유증을 평가하기 위한 표준 기술이었다. 간 쐐기 생검 방법은 작은 동물3에서침략적이고 힘들다. 연구 결과의 중간에 쐐기 간 생검의 사용은 수시로 필요로 하는 동물의 수를 증가하는 질병 모형에 있는 추가된 실험변수를 나타냅니다. 이러한 요인을 염두에 두고, 초기 시점에서 NASH/NAFLD 동물 모델에서 steatosis및 섬유증을 안정적으로 평가하는 데 사용할 수 있는 비침습적 이미징 기술은 매우 중요합니다. 전단 파 엘라스토그래피 (SWE)는 연조직의 탄성을 측정하는 데 사용되는 초음파 기반 방법입니다. 이 기술은 조직 표적을 향한 초음속 초음파 펄스에 의해 생성된 전단 파의 전파를 측정한 다음 E 계수4라는값을 계산합니다. 전단 파의 속도는 조직 강성의 정도에 비례한다.
도 1 및 도 2는 이미징 영역 설정 및 SWE 계측기를 보여 준다. SWE 계측기는 두 개의 스크린과 그림 2A에표시된 제어판이 있는 단일 휠 유닛입니다. 상부모니터(그림 2B)는컴퓨터 모니터역할을 하며 이미지 및 환자 디렉토리를 표시합니다. 제어판(그림2C)은이미지 캡처의 일반적인 측면을 제어하는 버튼과 다이얼의 배열입니다: 화면 동결, 이미지 저장, 한 모드에서 다른 모드로 변경. 하부화면(그림 2D)은설정을 변경하는 추가 컨트롤이 있는 터치 스크린이며 필요에 따라 데이터를 입력하는 키보드 역할을 합니다. 기기에는 원하는 경우 터치 스크린에 사용할 스타일러스가 장착되어 있습니다. 초음파 프로브는 장치의 하부 전면 패널에 부착됩니다. 설치류의 B 모드 및 SWE 이미징의 경우 초선형 6~20MHz 트랜스듀서가 사용되었습니다. 비침습적으로 조직 강성을 측정하는 이 기능은 SWE를 NASH 환자에서 간 섬유증5의 식별 및 준비에 대한 귀중한 도구로 만들어 더 침습적 인 방법에 대한 필요성을 감소시다. SWE는, 실제로, 환자에서 간 섬유증을 측정하기 위하여 이용되고 진료소 에서 섬유증을 득점하는 FDA 승인한 방법입니다6. SWE를 사용하여 질병의 동물 모델에서 NASH 진행을 모니터링하면 치료 개발을위한 번역 도구를 제공하고 동시에 동물 주체 수의 감소와 통증과 고통을 최소화하기 위한 생체 내 절차의 개선을 통해 동물 복지를 향상시킬 수 있습니다.
인간 환자에서 SWE 이미징은 작은 동물에게 이상적이지 않은 저주파 초음파 트랜스듀서4를사용합니다. 특히, 고주파 SWE 기술은 쥐 모델7에서NASH의 발병에 대한 아세틸-코아 카바실라제 억제의 효능을 평가하기 위해 사용되어 왔으며, 이 기술의 유용성은 전통적인 METAVIR 조직학 채점방법에비해 성공적인 결과를 갖는 간 섬유증의 탄소 테트라클로라이드 쥐 모델에서 기술되었다 8. 그러나, 기존 문헌은 NASH의 전임상 모델에서 SWE 이미징의 적용에 대한 상세한 기술 및 방법론 정보가 부족합니다. 위에서 설명한 바와 같이, 간 steatosis는 NAFLD/NASH 상태의 주요 특징 의 한개이고 내정간섭이 고려될 수 있는 중요한 단계입니다. 따라서, 이미징 양식증을 사용하여 간 지방 축적을 평가하는 것은 NASH/NAFLD의 전임상 모델에서 간 섬유증을 평가하는 것만큼 중요합니다.
신장 피질의 것과 비교하여 간 조직 밝기의 비율로 알려진 초음파 기술은 클리닉9,10에서스테토시스의 대리 마커로 사용되어 왔다. 그러나 이 접근법은 NAFLD/NASH의 전임상 동물 모델에서 광범위하게 사용되지 않았습니다. 본 기사는 NAFLD/NASH의 콜린 결핍, 고지방 식단(CDAHFD) 쥐 모델에서 각각 간 섬유증 및 스테토시스의 대리 마커로서 의탄성뿐만 아니라 HR 지수를 측정하는 방법을 설명합니다. 이 모델은 급속한 steatosis를 유도, 간 염증, 및 섬유증, 마우스에서 6 주 이내에 측정 할 수있습니다 11. 이 규정식에 콜레스테롤 (1%)의 추가는 쥐에 있는 섬유발생을 승진시키기 위하여 보였습니다12,이 모형은 전단 파 화상 진찰을 관련시키는 검증 연구 결과를 위한 적당한 후보 만들기. 전반적으로, 이 화상 진찰 기술은 또한 steatosis 및/또는 섬유증이 관심의 끝점인 NASH 모형/규정식의 넓은 범위에 적용될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Aixplorer</td><td>Supersonic Imagine</td><td></td><td>전단파 탄성 검사 기기</td></tr><tr><td>Aixplorer SuperLinear SLH20-6 변환기</td><td>전단파 탄성 조영술용</td><td>초음속 Imagine</td><td></td> 변환기</tr><tr><td>알파 드리 침구</td><td></td><td></td><td>쥐 케이지</td></tr><tr><td>Aperio AT2 스캐너</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>디지털 병리학 명시야 스캐너</td></tr><tr><td>Compac 6 마취 시스템</td><td>Vet마</td>취 기화기 및 전달 시스템을 갖추고 있습니다<td></td><td>. 그러나 모든 마취 전달 시스템을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>이미저 데이터베이스 관리</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td>Digital Pathology</td></tr><tr><td>Mayer's Hematoxilin</td><td>Dako/Agilent</td><td></td><td>H& E 염색/조직학</td></tr><tr><td>Nair</td><td>교회 & 드와이트</td><td></td><td>헤어 리무버</td></tr><tr><td>오일 레드 O 솔루션</td><td>폴리 사이언티픽</td><td></td><td>지질 염색/조직학</td></tr><tr><td>Picrosirius 레드 스테인(PSR)</td><td>Rowley Biochemical</td><td>F-357-2</td><td>콜라겐 스테인/조직학</td></tr><tr><td>Puralube 안과 연고</td><td>Dechra 수의학 제품</td><td></td><td>마취 중 안구 건조를 방지하기 위한 윤활</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Prisma Plus</td><td>Sakura Finetek USA</td><td></td><td>자동 슬라이드 염색기</td></tr><tr><td>VISIOPHARM 소프트웨어</td><td>Visiopharm</td><td></td><td>디지털 병리학 소프트웨어</td></tr><tr><td></td><td>Research Diets</td><td>A06071309i</td><td>NASH 유도 다이어트</td></tr><tr><td></td><td>Purina</td><td>5053</td><td>제어 동물 차우</td></tr><tr><td>Vevo 이미징 스테이션</td><td>Fujifilm VisualSonics</td><td></td><td>Vevo 이미징 스테이션은 이미징 중에 초음파 변환기를 유지하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Wistar Han 쥐</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

nafld/nash의 쥐 모형에 초음파 및 전단 파 단층 사진 의 응용

Application of Ultrasound and Shear Wave Elastography Imaging in a Rat Model of NAFLD/NASH

무알코올 성 세포 간염 (NASH)은 간 지방 축적 (steatosis) 및 섬유증으로 이어지는 염증을 특징으로하는 비 알코올 성 지방 간 질환 (NAFLD)의 스펙트럼 내에서 상태입니다. 인간 NASH/NAFLD를 밀접하게 재구성하는 전임상 모델은 약물 개발에 필수적입니다. 간 생검은 현재 클리닉에서 NAFLD /NASH 진행 및 진단을 측정하기위한 금 본위제이지만, 전임상 공간에서, 연구 중 여러 시점에서 전체 간 샘플의 수집 또는 간 생검은 질병 단계를 평가하기 위해 조직학적 분석을 위해 필요합니다.
간 생검 중간 연구를 수행하는 것은 침략적이고 노동 집약적인 절차이며, 질병 수준을 평가하기 위해 간 샘플을 수집하면 연구에 필요한 연구 동물의 수가 증가합니다. 따라서, 이러한 전임상 모델에서 NASH/NAFLD를 검출하기 위해 신뢰할 수 있고, 전염가능하고, 비침습적 이미징 바이오마커에 대한 필요성이 있다. 비침습적 초음파 기반 의 B 모드 이미지와 전단 웨이브 엘라스토그래피 (SWE)는 간 섬유증뿐만 아니라 세포증을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. NASH의 전임상 설치류 모델에서 SWE의 유용성을 평가하기 위해 동물은 프로 NASH 식단에 배치되었고, 비침습적 초음파 B 모드와 전단 파 엘라스토그래피 이미징을 수행하여 간장(HR) 지수와 간 탄력성을 측정하여 NAFLD/NASH 연구를 통해 여러 시간 지점에서 간 지방 축적 및 조직 강성의 진행을 측정했습니다.
HR 지수와 탄성 수치는 스테토시스 및 섬유증의 조직학적 마커와 비교하였다. 결과는 HR 지수와 오일 레드 O (ORO) 염색의 백분율 사이 강한 상관관계를 보여주었습니다, 뿐만 아니라 탄성과 피크로 시리우스 레드 (PSR) 간 염색 사이. 고전적인 전 생체 내 방법과 생체 내 이미징 결과 사이의 강한 상관 관계는 전단 파 엘라스토그래피 / 초음파 기반 이미징이 NAFLD / NASH의 전임상 모델에서 질병 표현형 및 진행을 평가하는 데 사용될 수 있다는 증거를 제공합니다.

CDAHFD를 먹이는 동물의 한 가지 특징은 스테토시스입니다. 간에서 지방의 축적은 조직의 반향 특성을 변화, 이는 간 밝기를 측정하고 같은 평면에서 촬영 B 모드 이미지에서 신장 피질의 밝기로 정상화하여 정량화 될 수있다. 정량화된 값은 steatosis의 간접 척도인 HR 지수로 표현됩니다. 도 4A에서,대조군 동물의 대표적인 간 이미지는 신장 피질에 비해 약 같거나 적은 밝기(echogenicity)를 나타낸다. 따라서, 일반 동물의 HR 지수는 &lt;1이다. 이 연구에서3주 시점에서 대조군 동물의 평균 HR 지수는 0.645 ± 0.03입니다. 대조적으로, CDAHFD-공급 동물의 대표적인 B 모드이미지(도 4A)는신장 피질에 비해 간 밝기가 증가하는 것을 나타낸다. 그 결과, CDAHFD 다이어트 동물의 대표적인 이미지의 HR 지수는 각각 6주와 12주 시점에서 1.91및 1.79였습니다.
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이 프로토콜은 비침습적으로 비 알코올 성 지방 간 질환의 설치류 모델에서 간 조직 변화를 관찰하고 정량화하기 위해 향상된 초음파 기술의 사용을 설명합니다.

NAFLD/NASH의 쥐 모형에 초음파 및 전단 파 단층 사진 의 응용

Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) is a condition within the spectrum of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD), which is characterized by liver fat ...

초음파 및 전단 파 엘라스토피의 사용은 연구원이 무알코올 성 세포 형 간염의 모형에 있는 간 지방 및 섬유증에 있는 변경을 측정하는 것을 가능하게 합니다. 이 이미징 양식은 비침습적, 고처리량 및 임상적으로 전이 가능한 기술이며 약물 발견 중 비알코올성 간염 모델의 질병 단계 및 효능을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 시작하려면 6-7주 된 남성 Wistar Han rats를 150~175그램의 개별 환기 케이지에 넣고 적절한 침구를 약 22도, 12~12시간 의 빛/어두운 사이클로 40~70%의 상대 습도를 조절합니다.1%콜레스테롤을 가진 콜린 결핍, 고지방 규정식을 가진 20개의 쥐를, 그리고 표준 실험실 설치류 차우를 가진 또 다른 20개의 쥐를 제공합니다. 이미징 기기를 설정하려면 이미징 부위에 온난한 표면을 배치하여 이미징 중에 동물을 따뜻하게 유지하고 흡입제 마취를 전달하기 위한 마취 코 콘을 수정합니다. 초음파 프로브 홀더를 사용하여 초음파 프로브를 원하는 위치로 이동하고 프로브가 동물에 놓이지 않도록하십시오.쥐가 완전히 마취되면 유도 챔버에서 따뜻한 뜨거운 물이 순환 담요로 옮기습니다. 화학 적 제모 크림을 사용하여 쥐의 오른쪽에있는 골반에 늑골 케이지에서 머리카락을 제거합니다. 쥐를 왼쪽 측면 재배치 위치에 놓고 머리 위에 위쪽 발을 따뜻한 이미징 플랫폼에 테이프로 놓습니다.계기판에 있는 환자 키를 누르고 연구 설계에 따라 피사체를 식별합니다. 쥐의 미온된 피부 부위에 소량의 따뜻한 초음파 젤을 발라주세요. 초음파 프로브를 이동하여 젤로 덮인 부위를 만집니다.내부 장기의 라이브 B 모드 이미지가 화면에 나타나면 초음파 프로브를 엉덩이 위 부위로 약간 이동하여 요추 척추와 평행하게 이동합니다. B 모드 디스플레이를 사용하여 큰 신장 동맥 및 피질 수질 분리를 식별하여 오른쪽 신장을 찾습니다. 이미지의 단일 평면에서 간 부분을 관찰하고 기포 또는 그림자가 이미지에 존재하지 않도록합니다.초점을 조정하고 신장 피질과 간 빈맥이 동일한 평면에 있는지 확인하여 선명한 이미지를 얻습니다. 흐리게 이미지를 캡처하지 않도록 화면을 동결 할 때 동물이 호흡 사이에 있는지 확인합니다. B 모드 비율을 선택하여 선택한 관심 영역에서 조직의 상대적 밝기를 측정합니다.2 밀리미터 원을 만들고 신장의 오른쪽에 위치한 간 이미지에 관심 영역에 배치합니다. 신장 피질의 이미지에 새로운 원을 배치하여 간과 신장 피질에 원의 깊이를 동일하게 유지합니다. 제어판의 선택 버튼을 눌러 간신장 지수를 B 모드 비율로 표시하고 조직의 서로 다른 깊이및 평면에서 세 번 측정을 반복한 다음 평균을 계산합니다.프로브를 오른쪽 하위 코스부분에서 가로방향으로 이동하여 B 모드를 사용하여 간을 찾습니다. 주로 빈약한 간 및 포탈 정맥 및 간 동맥과 같은 큰 혈관이없는 간의 명확한 영역을 찾은 다음 제어판의 SWE 버튼을 눌러 조직의 전단 탄력지도를 생성합니다. 그림자가 없는 부위에 간 캡슐 아래의 SWE 상자의 크기와 위치를 조정합니다.상자가 가득 차있고 안정되면 쥐가 호흡 사이에있는 동안 제어판의 동결 버튼을 누릅니다. 계측기의 터치 디스플레이에 Q-Box를 탭하여 전단 파 탄력맵에서 관심 영역의 탄력성을 계산합니다. 원과 데이터 상자가 나타납니다.균일한 착색으로 그림자없는 영역에 원을 배치하여 강성 영역을 피합니다. 간의 다른 지역에서 SWE 매핑 된 이미지를 수집하기 위해 복부에 프로브를 위아래로 또는 옆으로 이동하여 절차를 세 번 반복합니다. 완료되면 발에서 테이프를 제거하고 여분의 젤을 닦아냅니다.쥐를 따뜻하고 건조한 케이지에 다시 넣고 완전히 회복할 수 있도록 합니다. 트랙 볼 및 선택 버튼을 사용하여 환자의 이름 옆에 있는 상자를 선택하여 데이터 분석에 필요한 모든 검사를 선택합니다. 파일을 내보낸 후 각 검사의 개별 JPG 파일을 열고 이미지의 오른쪽에 있는 데이터를 관찰합니다.모든 데이터를 스프레드시트 또는 기타 데이터베이스 관리 소프트웨어에 복사하고 원하는 통계 분석을 수행합니다. 대조군과 콜린-결핍, 고지방 다이어트 그룹에서 간 신장 지수의 대표적인 이미지는 신장 피질에서 간 밝기가 거의 동일하다는 것을 나타내며, 간신장 지수는 대조군에서 1개 미만이었다. 고지방 식이그룹에서는 간밝기가 높아졌고, 간신장지수는 6주 만에 1.91, 12주 시점에서 1.79로 상승했다.고지방 다이어트 그룹의 간장 색인 값은 고원에 도달하기 전에 처음 3 ~ 6 주 동안 빠르게 상승했습니다. 오일 레드 O 염료로 염색된 간 단면은 대조군에 비해 고지방 식이군에서 유의하게 증가한 스테인드 영역을 보였다. 또한 얼룩진 영역과 간 신장 지수 사이에 상관 관계가 발견되었습니다.조직 강성은 12 주 이상 고지방 규정식 단에서 점차적으로 증가하고, 섬유증 때문에 23.1 kilopascals에 도달했습니다. 간 샘플은 섬유증의 지표로 콜라겐을 국소화하기 위해 피그리리우스 빨간색으로 염색되었다. 대조군에 비해 고지방 식이군에서 얼룩진 비율의 현저한 증가가 관찰되었다.그리고 백분율 염색 된 영역과 전단 파 E 계수 수 사이에도 강한 상관 관계가 발견되었습니다. 트랜스듀서와 측정 원 이나 상자를 제대로 배치하는 것이 중요합니다. 이미지에서 아티팩트를 피하면 반복 가능하고 일관된 측정이 가능합니다.시술 후, 간 트리글리세라이드 및 콜라겐 유전자 발현의 전 생체 측정은 또한 부검 조직에서 수행되어 이미징에서 본 결과를 확인할 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Giustetto, P., et. al., 비침습적 실질, 혈관 및 대사 고주파 초음파 및 광음향 쥐 심부 뇌 영상. J. Vis. Exp. (2015)이 비디오에서는 쥐의 뇌에서 혈관 구조와 헤모글로빈 함량을 연구하기 위해 고주파 초음파 및 광음향 이미징을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 뇌 관류 및 혈액 산소화에 대한 자세한 통찰력을 제공하여 뇌 혈관 구조 및 산소 분포에 대한 비침습적 분석을 가능하게 합니다.

비침습적 고주파 초음파 및 쥐 뇌 혈류역학의 도플러 이미징

초기 혈역학적 기능 장애는 신장 질환의 발병에 매우 중요합니다. 그러나 탐지 방법은 제한적입니다. 최근 초음파 검사의 발전은 신장 손상을 조기에 발견할 수 있는 비침습적이고 정확한 옵션을 제공합니다. 이 연구는 약물 유발 신독성 쥐 모델을 사용하여 신장 기능 장애를 감지하기 위한 단계별 초음파 검사 방법론을 간략하게 설명합니다.

쥐에서 초음파 기술을 사용하여 약물 유발 신장 혈역학 적 부전의 조기 발견

인간 내피 기능의 비 침습적 평가는 유동 매개 팽창 기술에 의해 결정될 수있다. 연구 수천이 기술을 사용하고 있지만, 어떤 연구는 쥐에서 비 침습적이 기술을 수행하지 않았다. 다음 문서에서는 상완의 흐름 중재 팽창과 쥐의 표면 대퇴 동맥의 비 침습적 측정을 설명합니다.

흐름 매개 상완의 팽창과 쥐의 피상적 인 대퇴 동맥의 초음파 평가

간 생 검 임상 설정에서 무알코올 steatohepatitis (steatosis, 염증, 열기구, hepatocyte 및 섬유 증)의 단계를 평가 하는 데 사용 됩니다. 여기, 우리는 평가 방식으로 더 많은 치료제의 임상 시험 정렬 있도록 조직학 분석을 위해 사용 될 수 있는 쥐에 지속 가능 간 생 검을 보여 줍니다.

무알코올 Steatohepatitis (NASH) 해상도 평가 하기 위해 쥐에 지속 가능 간 생 검 절차의

현재 프로토콜은 비알코올성 지방간염(NASH) 동안 세포외 기질(ECM) 리모델링의 역학을 시각화하기 위한 신뢰할 수 있는 플랫폼을 구축하기 위해 간 상피내 관류/탈세포화 및 이광자 현미경 방법을 최적화합니다.

비알코올성 지방간염 마우스 모델에서 간 세포외 기질의 3D 이미징

식이 유발 비알코올성 지방간 질환(NAFLD) 마우스 모델을 사용하여 NAFLD의 진행 단계를 평가하기 위한 비침습적 방법으로 새로운 생체 내 미세 컴퓨터 단층 촬영 이미징 기술의 사용을 설명하며, NAFLD 관련 간 조절 장애에 크게 관여하기 때문에 주로 간 혈관 네트워크에 초점을 맞춥니다.

비알코올성 지방간 질환의 진행을 평가하기 위한 새로운 생체 내 미세 컴퓨터 단층 촬영 이미징 기술

이 연구의 목적은 간섬유증의 조기 진단을 위한 새로운 3차원 디지털 모델을 개발하는 것인데, 여기에는 환자의 간에서 각 복셀의 경직도가 포함되어 있어 다양한 섬유증 단계에서 환자의 간 분포 비율을 계산하는 데 사용할 수 있습니다.

자기공명탄성검사(Magnetic Resonance Elastography)를 기반으로 한 간섬유증 조기 진단을 위한 3차원 디지털 모델

높은 공간 해상도(100μm)와 감도를 가진 초고속 도플러 초음파(UFUS)는 간 혈관 구조에 대한 포괄적인 정성적 개요를 얻기 위한 적절한 비침습적 이미징 방식을 나타냅니다. UFUS는 또한 미세혈관 구조의 정량적 측정을 용이하게 하여 혈관 질환 메커니즘에 대한 이해를 높이는 것을 목표로 합니다.

초고속 도플러 초음파를 이용한 생쥐의 간 혈관 구조의 이미징 및 정량화

이 연구는 자기공명영상(MRI)과 저강도 펄스 집속 초음파(FUS) 프로토콜을 결합한 방법을 설명하며, 경정맥 카테터 삽입이 있는 살아있는 쥐를 활용하여 혈액뇌장벽(BBB) 개구부를 모니터링합니다.

Monitoring Blood-Brain Barrier Opening in Rats with a Preclinical Focused Ultrasound System

이 프로토콜의 목표는 낭포성 섬유증 환자의 간담도 침범 및 진행성 낭포성 섬유증 간 질환을 모니터링하는 소아 위장병 전문의를 위한 현장 일시적인 탄성 조영술의 기술과 사용을 보여주는 것입니다.

낭포성 섬유증이 있는 소아 집단의 간 질환 평가를 위한 비침습적 현장 진료 일시적 탄성 조영술의 구현

학습하세요 초음파 및 전단파 탄성초음파를 활용한 비침습적 간 지방과 섬유화 측정 방법을 쥐 모델에서 적용하는 기술입니다. 이 프로토콜은 NAFLD/NASH 연구에서 생체 내 질병 진행을 모니터링하고 약물 효능을 평가하는 데 활용됩니다.

NAFLD/NASH의 쥐 모형에 초음파 및 전단 파 단층 사진 의 응용

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