Name: 글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T12:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: 배우세요 질량분석법 기반 단백질체학을 활용한 단백질 아르기닌 메틸화의 전역적이고 고신뢰도 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 hmSILAC 대사 표지, 이중 프로테아제 소화, 고pH 역상 크로마토그래피 및 면역친화적 농축을 통합하여 정량적 메틸-프로테오믹스를 가능하게 합니다.

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MM과 EM은 유럽 분자 의학 학교 (SEMM)의 박사 과정 학생입니다. EM은 3 년 FIRC-AIRC 보조금 (프로젝트 코드 : 22506)의 수혜자입니다. TB 그룹의 R- 메틸 단백질체에 대한 글로벌 분석은 AIRC IG 보조금 (프로젝트 코드 : 21834)에 의해 지원됩니다.

<ol><li>Bulau, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+arginine+methylation+in+free+versus+protein-incorporated+amino+acids+in+vitro+and+in+vivo+using+protein+hydrolysis+and+high-performance+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of arginine methylation in free versus protein-incorporated amino acids in vitro and in vivo using protein hydrolysis and high-performance liquid chromatography.</a> Biotechniques. 40 (3), 305-310 (2006).</li>
<li>Blanc, R. S., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arginine+methylation%3A+the+coming+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Arginine methylation: the coming of age.</a> Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).</li>
<li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li>
<li>Yang, Y., Bedford, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methyltransferases+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methyltransferases and cancer.</a> Nature Reviews Cancer. 13 (1), 37-50 (2013).</li>
<li>Bezzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+constitutive+and+alternative+splicing+by+PRMT5+reveals+a+role+for+Mdm4+pre-mRNA+in+sensing+defects+in+the+spliceosomal+machinery%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Regulation of constitutive and alternative splicing by PRMT5 reveals a role for Mdm4 pre-mRNA in sensing defects in the spliceosomal machinery.</a> Genes & Development. 27 (17), 1903-1916 (2013).</li>
<li>Auclair, Y., Richard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+arginine+methylation+in+the+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Repair%22%5BJournal%5D)">The role of arginine methylation in the DNA damage response.</a> DNA Repair. 12 (7), 459-465 (2013).</li>
<li>Spadotto, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1-mediated+methylation+of+the+microprocessor-associated+proteins+regulates+microRNA+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PRMT1-mediated methylation of the microprocessor-associated proteins regulates microRNA biogenesis.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 96-115 (2020).</li>
<li>Musiani, D., Massignani, E., Cuomo, A., Yadav, A., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+and+computational+approaches+for+the+large-scale+analysis+of+protein+arginine+methylation+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protein+and+Peptide+Science%22%5BJournal%5D)">Biochemical and computational approaches for the large-scale analysis of protein arginine methylation by mass spectrometry.</a> Current Protein and Peptide Science. 21 (7), 725-739 (2020).</li>
<li>Ong, S. -E., Mittler, G., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+quantifying+in+vivo+methylation+sites+by+heavy+methyl+SILAC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Identifying and quantifying in vivo methylation sites by heavy methyl SILAC.</a> Nature Methods. 1 (2), 119-126 (2004).</li>
<li>Hart-Smith, G., Yagoub, D., Tay, A. P., Pickford, R., Wilkins, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+scale+mass+spectrometry-based+identifications+of+enzyme-mediated+protein+methylation+are+subject+to+high+false+discovery+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Large scale mass spectrometry-based identifications of enzyme-mediated protein methylation are subject to high false discovery rates.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 15 (3), 989-1006 (2016).</li>
<li>Bedford, M. T., Clarke, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+arginine+methylation+in+mammals%3A+who%2C+what%2C+and+why%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why.</a> Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).</li>
<li>Larsen, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+analysis+of+arginine+monomethylation+reveals+widespread+occurrence+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide analysis of arginine monomethylation reveals widespread occurrence in human cells.</a> Science Signaling. 9 (443), (2016).</li>
<li>Massignani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hmSEEKER%3A+Identification+of+hmSILAC+doublets+in+MaxQuant+output+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">hmSEEKER: Identification of hmSILAC doublets in MaxQuant output data.</a> Proteomics. 19 (5), 1800300(2019).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).</li>
<li>Getz, E. B., Xiao, M., Chakrabarty, T., Cooke, R., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+the+sulfhydryl+reductants+tris%282-carboxyethyl%29phosphine+and+dithiothreitol+for+use+in+protein+biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A comparison between the sulfhydryl reductants tris(2-carboxyethyl)phosphine and dithiothreitol for use in protein biochemistry.</a> Analytical Biochemistry. 273 (1), 73-80 (1999).</li>
<li>Nielsen, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iodoacetamide-induced+artifact+mimics+ubiquitination+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Iodoacetamide-induced artifact mimics ubiquitination in mass spectrometry.</a> Nature Methods. 5 (6), 459-460 (2008).</li>
<li>Huesgen, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LysargiNase+mirrors+trypsin+for+protein+C-terminal+and+methylation-site+identification%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">LysargiNase mirrors trypsin for protein C-terminal and methylation-site identification.</a> Nature Methods. 12 (1), 55-58 (2015).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896(2007).</li>
<li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li>
<li>Bremang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+identification+and+characterisation+of+lysine+and+arginine+methylation+in+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+bioSystems%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based identification and characterisation of lysine and arginine methylation in the human proteome.</a> Molecular bioSystems. 9 (9), 2231-2247 (2013).</li>
<li>Geoghegan, V., Guo, A., Trudgian, D., Thomas, B., Acuto, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+identification+of+arginine+methylation+in+primary+T+cells+reveals+regulatory+roles+in+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Comprehensive identification of arginine methylation in primary T cells reveals regulatory roles in cell signalling.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-8 (2015).</li>
<li>Tabb, D. L., Huang, Y., Wysocki, V. H., Yates, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+basic+residue+content+on+fragment+ion+peak+intensities+in+low-energy+collision-induced+dissociation+spectra+of+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of basic residue content on fragment ion peak intensities in low-energy collision-induced dissociation spectra of peptides.</a> Analytical Chemistry. 76 (5), 1243-1248 (2004).</li>
<li>Guthals, A., Bandeira, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+identification+by+tandem+mass+spectrometry+with+alternate+fragmentation+modes%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Peptide identification by tandem mass spectrometry with alternate fragmentation modes.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (9), 550-557 (2012).</li>
<li>Swaney, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supplemental+activation+method+for+high-efficiency+electron-transfer+dissociation+of+doubly+protonated+peptide+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Supplemental activation method for high-efficiency electron-transfer dissociation of doubly protonated peptide precursors.</a> Analytical Chemistry. 79 (2), 477-485 (2007).</li>
<li>Kundinger, S. R., Bishof, I., Dammer, E. B., Duong, D. M., Seyfried, N. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Middle-down+proteomics+reveals+dense+sites+of+methylation+and+phosphorylation+in+arginine-rich+RNA-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Middle-down proteomics reveals dense sites of methylation and phosphorylation in arginine-rich RNA-binding proteins.</a> Journal of Proteome Research. 19 (4), 1574-1591 (2020).</li>
<li>Batth, T. S., Francavilla, C., Olsen, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Off-line+high-pH+reversed-phase+fractionation+for+in-depth+phosphoproteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Off-line high-pH reversed-phase fractionation for in-depth phosphoproteomics.</a> Journal of Proteome Research. 13 (12), 6176-6186 (2014).</li>
<li>Yang, F., Shen, Y., Camp, D. G., Smith, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pH+reversed-phase+chromatography+with+fraction+concatenation+for+2D+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Review+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High-pH reversed-phase chromatography with fraction concatenation for 2D proteomic analysis.</a> Expert Review of Proteomics. 9 (2), 129-134 (2012).</li>
<li>Hartel, N. G., Chew, B., Qin, J., Xu, J., Graham, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+protein+methylation+profiling+by+combined+chemical+and+immunoaffinity+approaches+reveals+novel+PRMT1+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deep protein methylation profiling by combined chemical and immunoaffinity approaches reveals novel PRMT1 targets.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 18 (11), 2149-2164 (2019).</li>
<li>Uhlmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+large-scale+identification+of+protein+arginine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method for large-scale identification of protein arginine methylation.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 11 (11), 1489-1499 (2012).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody-free+approach+for+the+global+analysis+of+protein+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Antibody-free approach for the global analysis of protein methylation.</a> Analytical chemistry. 88 (23), 11319-11327 (2016).</li>
<li>Moore, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+molecular+affinity+strategy+for+global+detection+and+proteomic+analysis+of+lysine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">A general molecular affinity strategy for global detection and proteomic analysis of lysine methylation.</a> Molecular cell. 50 (3), 444-456 (2013).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+proteomics+approach+for+global+analysis+of+lysine+monomethylome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A chemical proteomics approach for global analysis of lysine monomethylome profiling.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 14 (2), 329-339 (2015).</li>
<li>Sylvestersen, K. B., Horn, H., Jungmichel, S., Jensen, L. J., Nielsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+arginine+methylation+sites+in+human+cells+reveals+dynamic+regulation+during+transcriptional+arrest%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of arginine methylation sites in human cells reveals dynamic regulation during transcriptional arrest.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 13 (8), 2072-2088 (2014).</li>
<li>Tay, A. P., Geoghegan, V., Yagoub, D., Wilkins, M. R., Hart-Smith, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MethylQuant%3A+A+Tool+for+Sensitive+Validation+of+Enzyme-Mediated+Protein+Methylation+Sites+from+Heavy-Methyl+SILAC+Data%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">MethylQuant: A Tool for Sensitive Validation of Enzyme-Mediated Protein Methylation Sites from Heavy-Methyl SILAC Data.</a> Journal of Proteome Research. 17 (1), 359-373 (2018).</li>
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글로벌 MS 기반 단백질체학에 의한 생체 내 단백질/펩타이드 메틸화의 높은 신뢰도 식별은 높은 FDR의 위험으로 인해 어려운 일이며, 시료 준비 중에 메틸화에 등압성인 여러 아미노산 치환 및 메틸 에스테르화가 발생하고 직교 MS 검증 전략이 없는 경우 잘못된 할당을 유발할 수 있습니다. 이 PTM의 화학량론적 특성은 글로벌 메틸-단백질체학의 작업을 더욱 복잡하게 만들지만, 변형된 펩타이드(10)의 선택적 농축으로 극복할 수 있다.
여기에서는 HpH-RP 크로마토그래피 펩타이드 분획에 결합된 hmSILAC 전략의 적용 및 항-pan-R-메틸-펩타이드 항체 키트를 사용한 친화성 농축을 통해 R-메틸-펩타이드의 글로벌 MS-분석의 효율성과 신뢰성을 높이도록 설계된 생화학 및 분석 워크플로우를 제시합니다. 전자의 전략은 메틸-펩티드의 직교 검증을 허용하고 식별의 FDR을 강력하게 감소시키는 반면, 후자의 프로토콜은 변형되지 않은...

아르기닌 (R)-메틸화는 포유류 프로테옴 1의 약1%를 장식하는 번역 후 변형(PTM)입니다. 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼 라제 (PRMT)는 R의 측쇄의 구아니디노 그룹의 질소 (N) 원자에 하나 또는 두 개의 메틸기를 대칭 또는 비대칭 방식으로 증착하여 R- 메틸화 반응을 촉매하는 효소입니다. 포유류에서 PRMT는 모노메틸화(MMA) 및 비대칭 디메틸화(ADMA), MMA 및 대칭 디메틸화(SDMA) 또는 MMA만 각각 2,3. PRMT는 주로 GAR 모티프로 알려진 글리신 및 아르기닌이 풍부한 영역 내에 위치한 R 잔기를 표적으로 하지만 PRMT5 및 CARM1과 같은 일부 PRMT는 프롤린-글리신-메티오닌이 풍부한(PGM) 모티프를 메틸화할 수있습니다4. R-메틸화는 RNA 스플라이싱5, DNA 복구6, miRNA 생물발생7 및 번역2와 같은 여러 생물학적 과정의 단백질 조절제로 등장하여 이 PTM에 대한 연구를 촉진했습니다.
질량분석법(MS)은 단백질, 펩타이드 및 부위 분해능에서 글로벌 R-메틸화를 체계적으로 연구하는 가장 효과적인 기술로 인정받고 있습니다. 그러나 이 PTM은 MS에 의한 높은 신뢰도 식별을 위해 몇 가지 특별한 예방 조치가 필요합니다. 첫째, R- 메틸화는 화학 양 론적이며, 변형되지 않은 형태의 펩타이드는 변형 된 것보다 훨씬 풍부하므로 데이터 종속 수집 (DDA) 모드에서 작동하는 질량 분석기는 고강도 변형되지 않은 펩타이드를 저강도 메틸화 대응 물보다 더 자주 단편화합니다8. 또한 R-메틸화 부위 식별을 위한 대부분의 MS 기반 워크플로우는 생물정보학적 분석 수준에서 한계가 있습니다. 실제로, 메틸 펩타이드의 전산 식별은 높은 거짓 발견률 (FDR)을 갖기 쉽는데,이 PTM은 다양한 아미노산 치환 (예 : 글리신을 알라닌으로) 및 화학적 변형 (예 : 아스 파르 테이트 및 글루타메이트9)의 메틸 에스테르 화에 등압하기 때문입니다. 따라서 세포 배양에서 아미노산을 사용한 중질 메틸 안정 동위원소 표지(hmSILAC)와 같은 메틸기의 동위원소 표지를 기반으로 하는 방법은 생체 내 메틸화의 신뢰할 수 있는 MS 식별을 위한 직교 전략으로 구현되어 위양성 주석의 비율을 크게 줄였습니다10.
최근에는 R-메틸화 단백질을 연구하기 위한 다양한 프로테옴 전체 프로토콜이 최적화되었습니다. R-메틸-펩티드의 면역-친화성 농축을 위한 항체-기반 전략의 개발은인간 세포에서 수백개의 R-메틸화 부위의 주석을 달게 하였다11,12. 또한 많은 연구 3,13에서 항체 기반 농축을 HpH-RP 크로마토그래피 분획과 같은 펩타이드 분리 기술과 결합하면 식별된 메틸 펩타이드의 전체 수를 늘릴 수 있다고 보고했습니다.
이 논문은 hmSILAC 표지 세포에서 단백질 추출, 트립신 및 리사르기나제 프로테아제를 사용한 병렬 이중 효소 분해, MMA-, SDMA-, 및 ADMA-함유 펩티드를 포함한다. 그런 다음 모든 친화도가 풍부한 펩타이드는 DDA 모드에서 고분해능 액체 크로마토그래피(LC)-MS/MS로 분석되고 원시 MS 데이터는 R-메틸 펩타이드 식별을 위해 MaxQuant 알고리즘으로 처리됩니다. 마지막으로, MaxQuant 출력 결과는 무겁고 가벼운 메틸 펩타이드 쌍을 검색하기 위해 자체 개발 한 생물 정보학 도구 인 hmSEEKER로 처리됩니다. 간단히 말해서, hmSEEKER는 msms 파일에서 메틸-펩타이드 식별을 읽고 필터링한 다음 각 메틸-펩타이드를 allPeptides 파일의 해당 MS1 피크와 일치시키고, 마지막으로 중/경량 펩타이드 대응물의 피크를 검색합니다. 각 추정 헤비라이트 쌍에 대해 Log2 H/L 비율(LogRatio), 머무름 시간 차이(dRT) 및 질량 오차(ME) 매개변수가 계산되고 사용자 정의 컷오프 내에 있는 이중선은 참양성으로 레이블이 지정됩니다. 생화학 프로토콜의 워크 플로우는 그림 1에 설명되어 있습니다.

<table><tbody><tr><td>중탄산 암모늄 (AMBIC)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>과황산 암모늄 (APS)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>497363</td><td></td></tr><tr><td>C18 Sep-Pak 컬럼 vacc 6cc (1g)</td> <td>Waters</td><td>WAT036905</td><td></td></tr><tr><td>콜로이드 Coomassie 염색 인스턴트</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>ISB1L-1L</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Mini, EDTA 프리</td><td>로슈 시그마 알드리치</td><td>11836170001</td><td>프로테아제 억제제</td></tr><tr><td>투석 태아 소 세럼 (FBS)</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>26400-044</td><td></td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3483-12-3</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>요청</td><td>&nbsp; 안정 글루타민 포함 및 메티오닌 미포함</td></tr><tr><td>EASY-nano LC 1200 크로마토그래피 시스템</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EASY-Spray HPLC 컬럼</td><td>ThermoFisher</td><td>ES907</td><td></td></tr><tr><td>글리세롤로</td><td>시그마-알드리치</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>HeLa 세포</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마-알드리치</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>요오드아세트아미드(IAA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>144-48-9</td><td></td></tr><tr><td>목성 C12-RP 기둥</td><td>페노메넥스</td><td>00G-4396-E0</td><td></td></tr><tr><td>L-메티오닌</td><td>시그마-알드리치</td><td>M5308</td><td>라이트(L) 메티오닌</td></tr><tr><td>L-메티오닌-(메틸-13C,d3)</td><td>시그마-알드리치</td><td></td><td>299154 헤비 (H) 메티오닌</td></tr><tr><td>LysargiNase</td><td>Merck Millipore</td><td>EMS0008</td><td></td></tr><tr><td>마이크로팁 세포 파괴자 소닉파이어 250</td><td>Branson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime; -Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>GIBCO ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche-Sigma Aldrich</td><td>4906837001</td><td>Phosphatase Inhibitor</td></tr><tr><td>Pierce C18 Tips</td><td>ThermoFisher</td><td>87782</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp; 0.1% Formic Acid (v/v) in Acetonitrile, LC-MS Grade</td><td>ThermoFisher</td><td>85175</td><td>LC-MS 솔벤트 B</td></tr><tr><td>피어스&nbsp; 0.1% 포름산 (v/v) in water, LC-MS 등급</td><td>ThermoFisher</td><td>85170</td><td>LC-MS 솔벤트 A</td></tr><tr><td>피어스&nbsp; 아세토니트릴 (ACN), LC-MS 등급</td><td>ThermoFisher</td><td>51101</td><td></td></tr><tr><td>피어스&nbsp; 물, LC-MS 등급</td><td>ThermoFisher</td><td>51140</td><td></td></tr><tr><td>폴리아크릴아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92560</td><td></td></tr><tr><td>정밀 플러스 단백질&nbsp; All Blue Prestained Protein Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>1610373</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan 항체 &alpha;-ADMA</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13474</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan 항체 &alpha;-MMA</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>12235</td><td></td></tr><tr><td>PTMScan 항체 &alpha;-SDMA</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>13563</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass 분광계</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염기서열분석 등급 변형 트립신</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Ultimate 3000 HPLC</td><td>Dionex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>진공 농축기 5301</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Speed vac</td></tr></tbody></table>

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 r-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

단백질 아르기닌(R)-메틸화는 RNA 처리, 신호 전달, DNA 손상 반응, miRNA 생물 발생 및 번역을 포함한 여러 세포 경로의 조절에 관여하는 광범위한 단백질 번역 후 변형(PTM)입니다.
최근 몇 년 동안 생화학 및 분석 개발 덕분에 질량분석법(MS) 기반 단백질체학이 단일 부위 분해능으로 세포 메틸-단백질체를 특성화하는 가장 효과적인 전략으로 부상했습니다. 그러나 MS에 의한 생체 내 단백질 R- 메틸화를 식별하고 프로파일 링하는 것은 주로 이러한 변형의 화학 양 론적 특성과 다양한 아미노산 치환의 존재 및 메틸화에 등압 인 산성 잔기의 화학적 메틸 에스테르 화로 인해 여전히 까다롭고 오류가 발생하기 쉽습니다. 따라서 R-메틸-펩타이드의 식별을 향상시키기 위한 농축 방법과 메틸-단백질체학 연구에서 거짓 발견률(FDR)을 줄이기 위한 직교 검증 전략이 필요합니다.
여기에서는 세포의 대사 표지와 중위원소 암호화 메티오닌(hmSILAC) 및 전체 세포 추출물의 이중 프로테아제 용액 내 분해를 결합한 후 안티-pan-R-메틸 항체를 사용한 R-메틸-펩타이드의 오프라인 고pH 역상(HpH-RP) 크로마토그래피 분획 및 R-메틸 펩타이드의 친화성 농축을 결합한 후 세포 샘플에서 신뢰도가 높은 R-메틸 펩타이드 식별 및 정량을 위해 특별히 설계된 프로토콜에 대해 설명합니다. 고분해능 MS 분석 시 원시 데이터는 먼저 MaxQuant 소프트웨어 패키지로 처리된 다음 MaxQuant 출력 파일 내에서 가볍고 무거운 메틸-펩타이드에 해당하는 MS 피크 쌍의 심층 검색을 위해 설계된 소프트웨어인 hmSEEKER에 의해 분석됩니다.

이 기사에서는 단백질 추출물의 효소 분해와 두 개의 별개의 프로테아제를 병렬로 결합한 후 단백질 분해 펩타이드의 HpH-RP 액체 크로마토그래피 분획화 및 항-pan-R-메틸 항체를 사용한 R-메틸 펩타이드의 면역친화성 농축을 기반으로 하는 글로벌 단백질 R-메틸화의 신뢰도 높은 식별을 위한 워크플로에 대해 설명합니다(그림 1).
세포는 천연 (Light, L, Met-0) 또는 동위 원소 표지 (Heavy, H, Met-4) 메티오닌의 존재하에 성장시켰다. Met-4 단독 추출물의 작은 부분 표본에 대한 MS 분석에 의해 시험 된 전체 동위 원소 표지시, 중질 및 경세포를 수확하고 그림 1A에 도시된 바와 같이 1 : 1 L / H 비율로 혼합했습니다. 13CD3- 메티오닌 대사 표지시, 메틸기는 메틸 공여체 S- 아데노 실 - 메티...

단백질 아르기닌 (R)- 메틸화는 여러 생물학적 경로를 조절하는 광범위한 번역 후 변형입니다. 질량분석법은 변형된 펩타이드 농축을 위한 생화학적 접근법과 결합될 때 R-메틸-프로테옴을 전 세계적으로 프로파일링하는 최고의 기술입니다. 인간 세포에서 글로벌 R-메틸화의 높은 신뢰도 식별을 위해 설계된 워크플로우가 여기에 설명되어 있습니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...

이 프로토콜은 질량 분석법에 의한 단백질 아르기닌 메틸화의 글로벌 분석을 위한 최첨단 워크플로우를 나타내기 때문에 매우 중요합니다. 이것은 다른 생화학 기술로는 달성할 수 없는 단일 스타일 분해능으로 R-메틸화 단백질을 식별하고 프로파일링하는 유일한 방법입니다. 임상 시험 및 항암제에있는 PRMT 억제제의 사용과 함께이 프로토콜은 작용 메커니즘에 대한 심층 분석을 허용합니다.시작하려면 최종 농도 4.5 밀리몰의 초순수에 용해 된 DTT 원액을 사용하여 단백질의 티올 그룹 환원을 수행하고 섭씨 55도에서 30 분 동안 반응을 진행하십시오. 10 밀리몰 농도의 요오도 아세트 아미드를 첨가하고 어두운 곳에서 실온에서 15 분 동안 배양하여 단백질의 티올 그룹의 알킬화를 수행하십시오. 단백질 분해 효율을 확인하려면 후속 분석을 위해 단백질 추출물의 분취량을 SDS-PAGE Coomassie 염색 젤에 저장하고 분해 시 해당 양의 샘플과 비교합니다.나머지 단백질 추출물을 pH 8.0에서 4 부피의 20 밀리몰 헤페스로 희석하여 최종 요소 농도 2 몰에 도달합니다. 샘플을 두 부분으로 나눈 다음 시퀀싱 등급 변형 트립신을 하나에 추가하고 LysargiNase 프로테아제를 다른 부분에 추가합니다. 효소 분해를 위해 ThermoMixer에서 섭씨 37도에서 밤새 600회전으로 샘플을 그대로 두십시오.각 크로마토그래피 그래디언트에 대해 모든 분획을 깊은 96웰 플레이트에 수집합니다. 그라디언트가 시작되기 전에 수집된 분수를 pre라는 이름의 단일 분수로 풀링합니다. 높은 pH 역상 액체 크로마토그래피 그래피에서 60개의 분획을 인접하지 않은 방식으로 풀링하여 14개의 최종 분획으로 연결합니다.비연속 연결을 얻으려면 텍스트 원고에 설명된 대로 높은 pH 역상 분획을 풀링합니다. 그라디언트 후에 수집된 분수를 post라는 고유한 분수로 풀링합니다. 트립신 및 LysargiNase 소화로부터의 두 샘플에 대해 개별적으로 변형된 펩티드의 순차적 면역친화성 농축을 수행한다.10X 농축된 면역친화성 정제 또는 IAP 완충액을 10배 희석한다. 동결건조된 펩티드를 2, 000 G에서 5분 동안 원심분리하여 펩티드를 튜브의 바닥으로 스핀다운시킨다. 15 밀리리터 튜브 당 250 마이크로 리터의 희석 된 IAP 버퍼로 펩타이드를 재현탁하고 1.5 밀리리터의 저 결합 튜브로 옮깁니다.리트머스 종이를 사용하여 pH가 6보다 큰지 확인하십시오. 후속 MS 분석을 위한 입력으로 각 분획의 작은 부분 표본을 유지하십시오. 각 분획을 두 부분으로 분할하여 비대칭 디메틸화 또는 ADMA 및 대칭 디메틸화 또는 SDMA 펩타이드의 면역 농축을 병렬로 수행합니다.초기 단백질 추출물 10 밀리그램 당 단백질 A 아가로스 비드에 접합된 선별된 항-팬 R 메틸화 항체의 3개 바이알을 준비한다. 각 바이알을 2, 000 G에서 30초 동안 원심분리하고 비드로부터 완충액을 제거하여 아가로스 비드에 접합된 정확한 양의 항체를 제조한다. 비드를 1X PBS 1 밀리리터로 2, 000 G에서 30 초 동안 원심 분리하여 3 회 세척하십시오.마지막 세척 후 각 바이알에 대해 40마이크로리터 1X PBS에 비드를 재현탁하고 풀링한 다음 마지막으로 16개의 분획으로 균등하게 나눕니다. 각 튜브에 250마이크로리터의 1X IAP 버퍼를 추가하고 반전하여 혼합합니다. 그런 다음 회전하는 바퀴에서 튜브를 섭씨 4도에서 2 시간 동안 배양하십시오.인큐베이션 후, 펩티드 및 pan R-메틸 항체 접합 비드를 함유하는 1.5 밀리리터 튜브를 2, 000 G에서 30 초 동안 원심분리하여 비드를 펠릿화하고 각 분획으로부터 유동을 깨끗한 1.5 밀리리터 저 결합 튜브로 옮긴다. R-모노메틸화에 대한 항체에 접합된 플로우스루에 비드를 추가하고 PBS에 재현탁을 반복하고, IAP 완충액으로 인큐베이션하고, 원심분리합니다. 펩타이드 샘플을 모노메틸화 또는 MMA 비드로 인큐베이션하는 동안, 이전에 항-ADMA 및 SDMA로 면역침전된 분획을 250마이크로리터 IAP 완충액으로 2회 세척하고 각 세척 후 상청액을 폐기합니다.그런 다음 LC-MS 등급의 물로 세 번 씻으십시오. 각 튜브에 50마이크로리터의 0.15 TFA를 첨가하여 아가로스 비드로부터 친화성이 풍부한 SDMA 또는 ADMA 펩타이드를 용출시킵니다. 이 용액을 실온에서 10 분 동안 그대로두고 2-3 분마다 튜브를 뒤집습니다.첫 번째 용출을 깨끗한 1.5 밀리리터 저 결합 튜브로 옮기고 50 마이크로 리터의 0.15 TFA로 용리를 반복합니다. 두 개의 용리 분획을 하나의 튜브에 모읍니다. 항-MMA 항체 비드와 함께 인큐베이션된 R-모노메틸화 펩티드에 대해 이 과정을 반복합니다.가벼운 표지된 세포와 무거운 표지된 세포를 혼합한 후, 단백질을 추출하고 트립신 및 LysargiNase에 의해 소화시켰다. SDS-PAGE 쿠마시 염색 겔을 사용하여 펩타이드에서 총 단백질의 효율적인 효소 소화를 확인했습니다. C18 Sep-Pak 컬럼에 의해 수행된 정제 단계의 효율을 평가하여, C18 컬럼의 플로우스루와 1차 및 2차 세척에서 펩타이드의 부재와 용리액에 이들이 존재할 것으로 예상되는 것을 확인하였다.무거운 채널에서 적절한 MET4 혼입 및 올바른 무겁거나 가벼운 혼합이 평가되었습니다. 펩타이드의 오프라인 고pH 역상 액체 크로마토그래피 분획과 분획의 후속 비연속 연결의 크로마토그램이 여기에 표시됩니다. 펩티드는 250 나노미터 UV에 의해 검출되었고, 잠재적으로 남아 있는 소화되지 않은 단백질은 280 나노미터 UV에 의해 평가되었다. 참양성 메틸 펩티드 주석을 나타내는 펩티드의 전체 MS 스펙트럼을 수득하였다.3개의 피크 사이에서 관찰된 M 대 Z 차이는 효소적으로 메틸화된 잔기의 존재와 일치한다. 위양성 메틸 펩티드 주석을 나타내는 펩티드의 전체 MS 스펙트럼을 수득하였다. 가벼운 메틸화 펩타이드와 그의 징벌 적 무거운 대응 물 사이에서 관찰 된 M over Z 차이는 예상 값에서 0.0312만큼 벗어납니다.프로토콜 워크플로는 전체적으로 선형이지만 특별한 주의가 필요한 몇 가지 단계가 있습니다. 예를 들어, 비연속 분획 연결을 사용한 IPH 크로마토그래피 분리 및 IP 설정. 동일한 프로토콜을 표준 SILAC 또는 무표지 정량화에 결합하여 다양한 섭동에 대한 반응으로 아르기닌 메틸화 역학을 프로파일링할 수 있습니다.이 프로토콜은 PRMT에 초점을 맞춘 기초 및 중개 연구의 모든 측면을 지원하는 여러 세포 유형 및 모델 시스템에서 단백질 메틸화의 범위와 역학을 특성화하는 길을 열어줍니다.

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캡처 화합물 사진 crosslinking 및 정화하여 다음 기능을 가역 작은 분자 - 단백질 상호 작용에 의한 프로테옴의 복잡도를 줄이기 위해 trifunctional 작은 분자 수 있습니다. 여기있는 캡처 컴파 운드를...

Methyltransferases의 프로 파일링 및 기타 S - adenosyl - L</sub캡처 컴파 운드 질량 분광법 (CCMS)에서> - 호모 시스테인 결합 단백질

기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.

ChroP 접근은 염색질의 궤적 특정 프로테오믹스 풍경을 해부하는 칩 및 질량 분석을 결합

BSAS(Bisulfite amplicon sequencing)Bisulfite 앰플리콘 염기서열분석(BSAS)은 관심 대상 게놈 영역에서 시토신 메틸화를 정량화하는 방법입니다. 이 방법은 차세대 염기서열분석 전에 표적 영역의 PCR 증폭과 쌍을 이루는 중아황산염 변환을 사용하여 염기 특이적 수준에서 DNA 메틸화의 절대 정량을 생성합니다.

DNA 메틸화 분석 차세대 시퀀싱 대상

이 프로토콜은 질량 분석기 (MS)를 사용하여 히스톤 번역 후 변형을 특성화하기위한 완벽하게 통합 된 워크 플로우를 설명합니다. 워크 플로는 나노 흐름 액체 크로마토 그래피 및 데이터 분석을위한 지침을 사용하여 세포 배양 또는 조직, 히스톤 유도체 및 소화, MS 분석에서 히스톤 정화를 포함한다. 삼일 -이 프로토콜은 2 내에 완성을 위해 설계되었습니다.

히스톤 추출에서 데이터 분석에 : 상향식 질량 분석 사용 히스톤 번역 후 변형 분석을위한 완벽한 워크 플로우

우리는 복잡한 생물학적 샘플에서 유비퀴틴화 된 단백질에서 유래 한 diGly 펩티드의 정제, 검출 및 식별방법을 제시합니다. 제시된 방법은 유비퀴티노메 분석의 깊이 수준에 대하여 공표된 방법을 재현가능하고 견고하며 능가합니다.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

이 프로토콜은 엔지니어링 가뭄 내성 작물을 돕기 위해 잠재적 후성 유전학 마커역할을 할 수 있는 번역 후 변형 후 프로파일링을 위해 사탕수잎 재료로부터 손상되지 않은 히스톤을 효과적으로 추출하기 위해 개발되었습니다.

잠재적 인 후성 유전학 마커의 하향 식 질량 분광프로파일링을위한 수줌 잎 조직에서 히스톤의 격리

설명된 프로토콜은 라벨 기반 및 라벨 자유 양수의 두 가지 접근법을 사용하여 조직 샘플의 최적화된 정량 적 프로테오믹스 분석을 제공합니다. 라벨 기반 접근법은 단백질의 보다 정확한 양을 얻을 수 있는 장점이 있으며, 라벨없는 접근법은 비용 효율적이며 코호트의 수백 가지 샘플을 분석하는 데 사용됩니다.

조직 샘플의 질량 분광계 기반 산탄총 프로테오믹스의 포괄적인 워크플로우

이러한 프로토콜은 세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라아제(PRMT) 제품군의 개별 구성원의 효소 활성을 평가하는 데 사용되는 방법론을 제공한다. 내인성 및 외인성 바이오마커, 메틸-아르기닌 인식 항체 및 억제제 툴 화합물을 이용한 PRMT 활성 평가에 대한 상세한 지침이 설명되어 있다.

세포에서 단백질 아르기닌 메틸 트랜스퍼라제 1-9 활성을 연구하는 정량적 방법

이 프로토콜은 다양한 임상 샘플에서 효율적인 히스톤 추출을 가능하게 하여 LC-MS/MS를 통한 후속 번역 변형 분석에 활용합니다. 주요 히스톤 변형의 견고한 검출을 촉진함으로써, 대규모 임상 코호트에서 포괄적인 후생유전학적 프로파일링을 위한 귀중한 도구로 활용됩니다.

질량분석법을 이용한 후생유전학적 프로파일링을 위한 임상 표본에서 히스톤 추출

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환 질량 분석 단백질 구조와 역학 연구를위한

배우세요 질량분석법 기반 단백질체학을 활용한 단백질 아르기닌 메틸화의 전역적이고 고신뢰도 분석 방법입니다. 이 프로토콜은 hmSILAC 대사 표지, 이중 프로테아제 소화, 고pH 역상 크로마토그래피 및 면역친화적 농축을 통합하여 정량적 메틸-프로테오믹스를 가능하게 합니다.

글로벌 및 신뢰도가 높은 단백질 R-메틸화 분석을 위한 질량분석법 기반 단백질체학 접근법

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