Name: Diamond Light Source의 XChem 시설에서 효율적인 Fragment Screening 달성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 배우세요 Diamond Light Source XChem 시설에서 X선 결정학을 활용한 효율적인 프래그먼트 스크리닝 방법을. 샘플 준비부터 데이터 분석까지 완전한 파이프라인을 통해 단백질 상호작용 부위를 정확히 식별하고 신약 발견 연구를 가속화할 수 있습니다.

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이 작업은 Diamond Light Source와 Structure Genomic Consortium 간의 대규모 공동 노력을 나타냅니다. 저자들은 i04-1 빔라인의 자동화에 기여하고 모든 MX 빔라인에서 공통적으로 실행되는 간소화된 데이터 수집 및 자동 처리 파이프라인을 제공한 Diamond의 다양한 지원 그룹과 MX 그룹에 감사를 표하고자 합니다. 또한 SGC PX 그룹의 복원력에 대해 감사를 표하고 있으며, Evotec은 최초의 진지한 산업 사용자입니다. 이 작업은 유럽연합 집행위원회(European Commission)의 Horizon 2020 프로그램에서 자금을 지원하는 iNEXT-Discovery(보조금 871037)의 지원을 받았습니다.

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

이 백서에 설명된 프로세스는 사용자 커뮤니티에서 광범위하게 테스트되었으며 여기에 설명된 프로토콜의 적응성은 플랫폼에서 일반적으로 발생하는 다양한 프로젝트를 처리하는 데 중요합니다. 그러나 결정계의 몇 가지 전제 조건이 필요합니다.
X선 결정학을 사용하여 수행되는 모든 단편 스크리닝 캠페인의 경우, 재현 가능하고 견고한 결정 시스템이 중요합니다. 표준 XChem 프로토콜은 크리스탈 드롭에 직접 프래그먼트를 추가하는 것을 포함하므로 최적화는 총 크리스탈 수보다는 고품질 크리스탈을 포함하는 드롭의 수에 초점을 맞춰야 합니다. 방울에 여러 개의 결정이 포함되어 있으면 수확 과정을 완화할 수 있지만 효과적으로 중복됩니다. 또한 결정화 프로토콜을 홈 인스티튜트에서 현장 시설로 이전하는 것은 어려울 수 있습니다. 이것은 일반적으로 재현성 핵형성(54)을 촉진하기 위해 결정 시드를 사용하여 가장 잘 달성되며, 따라서, 좋은 관행은 사용자가 그들의 단백질 및 결정화 용액과 함께 종자 스톡을 제공하는 것이다.
우수한 화합물 용해도와 지지력을 보장하기 위해 약한 단편, 단편 라이브러리의 결합을 유도하기 위한 높은 담금 농도가 유기 용매, 특히 DMSO 및 에틸렌 글리콜로 제공됩니다. 두 가지 다른 용매를 제공하면 DMSO를 전혀 견디지 못하거나 관심 부위에서 단편의 결합을 막는 결정에 대한 대안을 사용자에게 제공합니다. 사용자는 수용성 완충액에 대체 라이브러리를 제공할 수 있습니다: 화합물은 액체 분주 로봇과 호환되는 플레이트에 완전히 용해되고 포맷되면 잘 분주됩니다.
라이브러리를 용해시키고 결정 시스템에 의해 허용될 수 있는 적절한 유기 용매를 찾을 수 없는 프로젝트의 경우, 대체 절차는 BESSY55에 설정된 건조 화합물을 사용하는 것입니다.
커뮤니티에서는 높은 염분 농도를 포함하는 결정화 조건에서 성장한 결정에 화합물을 담글 수 있는지에 대한 오랜 질문이 있습니다. 실제로, 수확 단계에서 화합물의 더 많은 침전과 염 결정의 빠른 형성이 관찰되며, 이는 수확 지역 주변에 습한 환경을 적용함으로써 감소됩니다. 일반적으로 고염 결정화 조건에서 결정계의 스크리닝 캠페인은 저염 조건과 유사한 적중률을 제공합니다.
XChem 공정의 초기 단계(용매 내성 테스트 및 사전 스크리닝)는 비교적 소규모의 빠른 실험이지만 프로젝트에 대한 명확한 합격/불합격 결정을 내릴 수 있습니다. 가장 고통스럽게도, 용매가 모두 허용되지 않거나 사전 스크리닝으로 인해 적중률이 매우 낮은 경우 대체 결정 시스템을 찾아야 합니다. 반대로, 성공적일 경우, 결과는 스크리닝 실험에 사용할 담금 조건과 데이터 수집을 위한 최상의 전략을 직접 알려줍니다. 데이터의 품질, 특히 분해능은 히트 식별 및 분석을 위한 전자 밀도의 품질에 영향을 미치기 때문에 회절 품질에 해로운 영향을 미치지 않는 가능한 가장 높은 화합물 농도에 담그는 것이 목표입니다(대부분의 데이터 세트(~80%)가 2.8Å 이상의 분해능으로 회절됨).
데이터 분석 프로세스는 취약한 바인더를 감지하기 위해 PanDDA 소프트웨어에 의존하는 XChemExplorer 내에서 간소화되며 사용자는 스크리닝 캠페인의 결과를 빠르게 시각화하고 검토할 수 있습니다. XChemExplorer는 각 패키지에 대한 표준 방법(즉, CC1/2 = 0.3)에 의해 결정된 해상도 제한으로 Diamond(DIALS16, autoPROC30, STARANISO31 및 Xia214)에서 사용할 수 있는 패키지에서 데이터 처리 결과를 가져옵니다. 기본적으로, 데이터셋 선택은 I/sigI, 완전성, 및 다수의 고유 반사로부터 계산된 점수에 기초하지만, 특정 처리 결과는 전역적으로 또는 개별 샘플들 모두에 사용하기 위해 선택될 수 있다(25). 또한 분해능, Rfree, 참조 데이터와 타겟 데이터 간의 단위 셀 부피 차이(기본값은 각각 3.5Å, 0.4 및 12%)를 포함한 기준에 따라 PanDDA의 분석에서 데이터를 제외하므로 회절이 불량하거나 중심이 잘못 지정되거나 인덱싱이 잘못된 결정이 분석에 영향을 미치지 않습니다.
PanDDA 알고리즘은 단편 캠페인 중에 수집된 상당한 수의 데이터 세트를 활용하여 표준 결정학 맵에서 볼 수 없는 부분 점유 리간드를 감지합니다. 처음에 PanDDA는 용매 내성 테스트 및 사전 스크리닝 단계에서 수집된 데이터를 사용하여 평균 밀도 맵을 준비한 다음 바닥 상태 모델을 만드는 데 사용합니다. 이 모델은 모든 후속 분석 단계에 사용되므로 단편 스크리닝에 사용되는 조건에서 리간드되지 않은 단백질을 정확하게 나타내는 것이 중요합니다. 그런 다음 PanDDA는 통계 분석을 사용하여 결합된 리간드를 식별하고 결정의 결합된 상태에 대한 이벤트 맵을 생성합니다. 이벤트 맵은 부분 점유 데이터 세트에서 결정의 결합되지 않은 부분을 빼서 생성되며 리간드가 완전 점유 시 결합될 경우 관찰되는 내용을 나타냅니다. 종래의 2mFo-DF c 맵에서 명백하게 나타나는 단편들조차도 이벤트 맵들이 참조되지 않는다면 잘못 모델링될 수 있다32. PanDDA는 평균 맵(일반적으로 단편 결합을 나타냄)과 다른 데이터 세트를 식별하는 강력한 방법이며 정제 중 RSCC, RSZD, B 인자 비율 및 RMSD와 같은 메트릭이 사용자에게 제공되지만, 관찰된 밀도가 예상 리간드와 가장 적합한 형태를 정확하게 나타내는지 여부를 결정하는 것은 궁극적으로 사용자의 책임입니다.
데이터 분석 및 정제 후 모든 사용자가 XChemExplorer를 사용하여 PDB(Protein Data Bank)에 여러 구조를 동시에 예치할 수 있습니다. 각 조각 스크린에 대해 두 개의 그룹 증착이 이루어집니다. 첫 번째 증착에는 MMCIF 파일에 포함된 PanDDA 이벤트 맵을 계산하기 위한 계수와 함께 모든 프래그먼트 바인딩 모델이 포함됩니다. 두 번째 증착은 실험의 모든 데이터 세트의 측정된 구조 계수와 함께 수반되는 기저 상태 모델을 제공합니다: 이 데이터는 PanDDA 분석을 재현하고 향후 알고리즘을 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 히트의 구조에 관해서는, 단편 점유가 낮을 때, 모델이 리간드-결합 및 교란 기저 상태 구조(32)의 복합체인 경우 미세화가 더 잘 거동된다. 그럼에도 불구하고 전체 복합 모델은 일반적으로 복잡하고 해석하기 어렵기 때문에 제한된 상태 분수만 예치하는 것이 좋습니다. 그 결과, PDB에 의해 재계산된 일부 품질 지표(특히 R/Rfree)가 약간 상승하는 경우가 있습니다. Zenodo56과 같은 플랫폼을 사용하여 모든 원시 데이터를 제공하는 것도 가능하지만 현재 XChem 파이프라인에서는 지원되지 않습니다.
전반적으로, 2016년 수술 이후 이 절차를 사용하여 표적의 95% 이상에서 단편 리간드를 식별할 수 있었습니다. XChem이 지원해 온 많은 프로젝트로부터의 경험은 결정 준비(33)를 위한 모범 사례로 정제되었으며, 한편 단편 진행(29)을 돕기 위한 침착한 개념을 구현한 단편 라이브러리가 발전했으며, 또한 라이브러리 구성을 공개하는 관행을 확립하는 데 도움이 되었다. 이 플랫폼은 잘 관리된 인프라와 문서화된 프로세스의 중요성을 입증했으며, 여기에 자세히 설명되어 있으며, 다른 단편 라이브러리(57,58)를 평가하고, 라이브러리(48)를 비교하고, 협업 EUOpenscreen-DRIVE 라이브러리(59,60)의 설계를 알릴 수 있게 했다.

FBDD(Fragment-Based Drug Discovery)는 선도 물질 발견을 위해 널리 사용되는 전략으로, 25년 전 등장한 이래 4개의 약물을 임상용으로 전달했으며 40개 이상의 분자가 임상 시험에 진출했습니다 1,2,3. 단편은 일반적으로 분자량이 300Da 이하인 작은 화학 물질입니다. 화학적 복잡성이 낮기 때문에 선택되며, 이는 우수한 물리화학적 특성을 가진 리간드 효율이 높은 억제제 개발을 위한 좋은 출발점을 제공합니다. 이들의 크기는 더 큰 약물 또는 납 유사 화합물의 라이브러리보다 단백질의 결합 환경을 더 철저하게 샘플링하여 핫스팟과 추정 알로스테릭 부위를 드러낸다는 것을 의미합니다. 구조 정보와 결합된 단편은 단백질과 리간드 사이의 잠재적인 분자 상호 작용에 대한 자세한 지도를 제공합니다. 그럼에도 불구하고 표적 단백질에 약하게 결합하는 경향이 있는 개체를 안정적으로 검출하고 검증하려면 표면 플라즈몬 공명(SPR), 핵 자기 공명(NMR) 또는 등온 적정 열량측정법(ITC)4,5과 같은 강력하고 민감한 생물물리학적 스크리닝 방법이 필요합니다.
X선 결정학은 FBDD 툴킷의 필수적인 부분으로, 약한 결합체를 식별할 수 있을 만큼 민감하며 분자 수준에서 상호 작용에 대한 구조 정보를 직접 생성합니다. 그것은 다른 생물 물리학 스크린에 보완적이며 일반적으로 화합물을 선도하는 단편 히트를 진행하는 데 필수적입니다. 이를 위해서는 고품질 결정 시스템이 필요하며, 이는 결정화의 재현성이 높고 결정이 이상적으로 2.8 Å 분해능 이상으로 회절된다는 것을 의미합니다.
역사적으로, 학계나 산업계에서 결정학을 1차 단편 스크리닝 6,7,8로 사용하는 것은 매우 어려웠다. 대조적으로, 싱크로트론은 로봇 공학, 자동화9,10,11 및 검출기 기술(12,13)에서 엄청난 개선을 달성했으며, 동등하게 가속화된 컴퓨팅 성능 및 데이터 처리 알고리즘(14,15,16)과 결합하여 완전한 회절 데이터 세트를 몇 초 만에 측정할 수 있으며 LillyCAT 7에서 개척한 것처럼 많은 수의 데이터 세트를 완전히 무인으로 측정할 수 있습니다 그리고 나중에 MASSIF17,18 (유럽 싱크로트론 방사선 시설 (ESRF)). 이로 인해 싱크로트론은 매우 간소화된 플랫폼을 개발하여 광범위한 사용자 커뮤니티(XChem at Diamond; EMBL/ESRF19에서의 CrystalDirect; 베를린 헬름홀츠-젠트룸(Helmholtz-Zentrum)의 BESSY20; MaxIV21에서 FragMax).
이 논문은 시료 준비부터 3D 모델링 히트의 최종 구조 결과에 이르기까지 X선 결정학에 의한 절편 스크리닝을 위한 XChem 플랫폼을 구성하는 프로토콜을 문서화합니다. 파이프라인(그림 1)은 결정 식별(22), 담금(23) 및 수확(24)에 대한 새로운 접근법을 개발해야 했으며, 데이터 관리 소프트웨어(25) 및 현재 커뮤니티에서 널리 사용되는 단편(26)을 식별하기 위한 알고리즘 접근법을 개발해야 했다. 결정 수확 기술은 현재 한 공급업체에 의해 판매되고 있으며(재료 표 참조), 도구의 개방된 가용성은 다른 싱크로트론이 동등한 플랫폼(21)을 설정하도록 적응시킬 수 있게 했다. 진행 중인 프로젝트는 Fragalysis 플랫폼27을 통한 데이터 분석, 모델 완성 및 데이터 보급을 다룹니다. 시료 전처리 실험실은 빔라인 I04-1에 인접해 있어 수백 개의 동결 시료를 빔라인으로 옮기는 물류를 단순화하고 I04-1의 전용 빔타임을 통해 신속한 X선 피드백을 통해 캠페인을 안내할 수 있습니다.
XChem은 다이아몬드의 사용자 프로그램의 필수적인 부분으로, 1년에 두 번(4월 초와 10월 초) 호출됩니다. 동료 심사 과정은 학계 및 업계의 신약 개발 전문가와의 협의를 통해 개선되었습니다. 강력한 과학적 사례와 함께, 제안 프로세스28 은 신청자가 결정계의 준비 상태뿐만 아니라 생화학 및 직교 생물물리학적 방법에 대한 전문 지식과 후속 화학을 통해 스크리닝 히트를 진행할 수 있는 능력을 자체 평가하도록 요구합니다. 액세스 모드는 또한 여러 분야의 사용자 커뮤니티를 수용하기 위해 발전했습니다.
Tier 1(단일 프로젝트 )은 탐색 단계의 프로젝트를 위한 것이며 적중 검증 도구(생물물리학 또는 생화학 도구)이며 후속 전략이 필요하지 않습니다. 승인되면 프로젝트에 개념 증명에 충분한 빔 시간 이동 횟수가 줄어듭니다.
Tier 2(단일 프로젝트) 는 잘 검증된 프로젝트를 위한 것이며 다운스트림 도구 및 후속 전략이 필요합니다. 승인되면 프로젝트에 전체 조각 스크리닝 캠페인을 위한 충분한 빔 시간이 할당됩니다. 단일 프로젝트(티어 1 또는 티어 2)는 할당 기간(4월-9월 또는 10월-3월)의 6개월 이내에 완료되어야 합니다.
블록 할당 그룹(BAG) 은 그룹 및 프로젝트 컨소시엄을 위한 것으로, 명확한 후속 파이프라인과 함께 BAG 내에서 강력한 대상 선택 및 우선 순위 지정 프로세스가 마련되어 있습니다. BAG에는 다이아몬드 직원과 활동을 조정하고 BAG 회원을 교육하는 XChem 교육을 받은 전문가(수퍼유저)가 한 명 이상 있어야 합니다. 할당된 빔타임 시프트 수는 BAG에서 과학적으로 강력한 프로젝트 수로 정의되며 BAG의 보고서를 기반으로 할당 기간별로 재평가됩니다. 액세스는 2년 동안 사용할 수 있습니다.
XChem 실험은 3단계로 나뉘며, 각 단계에 대한 결정 지점은 용매 내성 테스트, 사전 스크리닝 및 메인 화면입니다(그림 2). 용매 내성 테스트는 담금 파라미터, 결정 시스템이 견딜 수 있는 용매(DMSO, 에틸렌 글리콜 또는 필요한 경우 기타 동결 보호제)의 양 및 기간을 정의하는 데 도움이 됩니다. 용매 농도는 일반적으로 최소 두 개의 시점에 걸쳐 5%-30% 범위입니다. 회절 데이터가 수집되어 결정계의 기본 회절과 비교됩니다. 이것은 다음 단계에 대한 담금 매개변수를 결정합니다. 사전 스크리닝의 경우 용매 테스트에서 결정된 조건을 사용하여 100-150개의 화합물을 담그고 그 목적은 결정이 해당 조건에서 화합물을 견딜 수 있는지 확인하는 것입니다. 필요한 경우 동결 보호제를 이미 조각이 들어 있는 방울에 첨가합니다. 성공 기준은 결정의 80% 이상이 양호하고 일관된 품질의 회절 데이터를 생성할 수 있을 만큼 충분히 잘 생존하는 것입니다. 이것이 실패하면 일반적으로 담금 시간 또는 용매 농도를 변경하여 담금 조건을 수정합니다. 성공적인 사전 스크리닝 후 실험을 위해 선택된 나머지 화합물은 최종 파라미터를 사용하여 설정할 수 있습니다.
DSI 포세 라이브러리( 재료 표 참조)는 poised chemistry29 를 사용하여 신속한 후속 진행을 허용하도록 의도적으로 설계되었으며 시설의 주요 라이브러리였습니다. DMSO에서 500mM 농도로 사용자가 사용할 수 있습니다. 학술 사용자는 또한 DMSO에서 100-500mM 농도로 공동 연구자(총 2,000개 이상의 화합물)가 제공하는 다른 라이브러리에 액세스할 수 있습니다(전체 목록은 웹사이트28에서 찾을 수 있음). 전체 컬렉션의 대부분은 DMSO를 허용하지 않는 결정 시스템을 위해 에틸렌 글리콜로도 제공됩니다. 사용자는 음향 액체 처리 시스템과 호환되는 플레이트에 있는 경우 자체 라이브러리를 가져올 수도 있습니다( 재료 표 참조).
실험의 세 단계(용매 특성화, 사전 스크리닝 또는 전체 스크린)에서 다음 샘플 준비 절차는 동일합니다(그림 3): 이미징을 통한 화합물 분주 위치 선택 및 TeXRank22를 사용한 결정화 방울 표적화; 용매 및 화합물 모두에 대한 음향 액체 분배 시스템을 사용하여 방울에 분주하는단계(23); 크리스탈 시프터(24)를 이용한 결정의 효율적인 수확; 빔라인 데이터베이스(ISPyB)에 샘플 정보를 업로드합니다. 실험 설계 및 실행을 위한 현재 인터페이스는 플랫폼의 다양한 장비에 필요한 입력 파일을 생성하고 모든 결과를 SQLite 데이터베이스에 추적 및 기록하는 Excel 기반 애플리케이션(SoakDB)입니다. 바코드 스캐너는 샘플 추적을 돕기 위해 프로세스 전반에 걸쳐 다양한 단계에서 사용되며 이 데이터는 데이터베이스에 추가됩니다.
회절 데이터는 빔라인 I04-1의 전용 빔타임을 사용하여 무인 모드에서 수집됩니다. 두 가지 센터링 모드, 즉 광학 및 X선 기반17을 사용할 수 있습니다. 바늘 및 막대 모양의 결정의 경우 X선 센터링이 권장되는 반면, 더 두툼한 결정은 일반적으로 광학 모드를 지원하므로 더 빠르므로 할당된 빔 시간 내에 더 많은 샘플을 수집할 수 있습니다. 크리스탈의 해상도(플랫폼에 들어가기 전에 설정됨)에 따라 데이터 수집은 총 노출이 60초 또는 15초가 될 수 있습니다. 용매 테스트 단계 중 데이터 수집은 일반적으로 빔라인 I04-1의 성능과 가장 잘 어울리는 조합을 알려줍니다.
대량의 데이터 분석은 XChemExplorer(XCE)25를 통해 관리되며, PanDDA26을 사용하여 히트 식별 단계를 시작하는 데에도 사용할 수 있습니다. XCE는 단백질-리간드 구조의 대규모 분석을 지원하는 데이터 관리 및 워크플로우 도구입니다(그림 4). Diamond Light Source(DIALS16, Xia214, AutoPROC30 및 STARANISO31)에서 수집된 데이터에서 자동 처리 결과를 읽고 데이터 품질 및 참조 모델과의 유사성을 기반으로 결과 중 하나를 자동으로 선택합니다. 모델이 XChem 스크리닝에 사용되는 결정 시스템을 대표해야 하며, 모든 용수 또는 기타 용매 분자뿐만 아니라 용매로만 담근 결정에서 볼 수 있는 모든 보조 인자, 리간드 및 대체 형태를 포함해야 합니다. 이 참조 모델의 품질은 모델 구축 및 구체화 단계에서 필요한 작업량에 직접적인 영향을 미칩니다. PanDDA는 모든 데이터를 분석하고 결합 부위를 식별하는 데 사용됩니다. 구조를 기준 구조에 정렬하고, 통계 맵을 계산하고, 이벤트를 식별하고, 이벤트 맵26,32을 계산합니다. PanDDA 패러다임에서는 전체 결정학 모델을 구축할 필요도 없고 바람직하지도 않습니다. 모델링해야 하는 것은 단편이 결합된 단백질의 보기(결합 상태 모델)일 뿐이므로 이벤트 맵32에 따라 리간드 및 주변 잔류물/용매 분자를 구축하는 데만 초점을 맞추면 됩니다.

<table><tbody><tr><td>DSI 기반 라이브러리</td><td>Enamine</td><td>DSI-896</td><td>프래그먼트 라이브러리</td></tr><tr><td>Echo 550 및 650 시리즈</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td>음향 디스펜싱 시스템</td></tr><tr><td>Echo 마이크로플레이트</td><td>Beckman-Coulter</td><td>001-12380; 001-8768; 001-6025</td><td>1536웰 및 384웰 마이크로플레이트</td></tr><tr><td>Shifter</td><td>Oxford Lab Technology</td><td></td><td>수확 장치</td></tr><tr><td>마이크로플레이트 스윙 아웃 로터가 있는 원심분리기</td><td>Sigma</td><td>모델 11121</td><td>마이크로플레이트 원심분리기</td></tr><tr><td>3방울 결정화 플레이트</td><td>Swissci</td><td>3W96T-UVP</td><td>결정화 플레이트</td></tr><tr><td>Formulatrix 플레이트 이미저 및 Rockmaker 소프트웨어</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>결정화 플레이트 이미징 장치</td></tr></tbody></table>

diamond light source의 xchem 시설에서 효율적인 fragment screening 달성

Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source

단편 기반 약물 발견에서는 ~300Da보다 작은 수백 또는 수천 개의 화합물을 관심 단백질에 대해 테스트하여 강력한 약물 후보로 개발할 수 있는 화학 실체를 식별합니다. 화합물이 작기 때문에 상호 작용이 약하고 따라서 스크리닝 방법이 매우 민감해야 합니다. 더욱이, 구조 정보는 이러한 히트를 납과 같은 화합물로 정교화하는 데 중요한 경향이 있습니다. 그러므로, 단백질 결정학은 항상 황금 표준 기술이었습니다, 그러나 1 차 스크린으로 대폭적인 사용을 찾아내기에는 역사적으로 너무 어려웠습니다.
초기 XChem 실험은 2014년에 시연된 후 학계 및 산업체 공동 연구자들과 함께 프로세스를 검증했습니다. 그 이후로 대규모 연구 노력과 상당한 빔 타임을 통해 시료 전처리를 간소화하고, 신속한 후속 조치가 가능한 절편 라이브러리를 개발하고, 무인 데이터 수집을 위한 I04-1 빔라인의 기능을 자동화 및 개선하고, 데이터 관리, 분석 및 히트 식별을 위한 새로운 도구를 구현했습니다.
XChem은 이제 대규모 결정학적 단편 스크리닝을 위한 시설로, 전체 결정-증착 공정을 지원하며 전 세계 학계 및 산업 사용자가 이용할 수 있습니다. 동료 심사를 거친 학술 사용자 프로그램은 2016년부터 활발히 개발되어 검증된 프로젝트와 탐색 프로젝트를 포함하여 가능한 한 광범위한 과학적 범위의 프로젝트를 수용합니다. 학술적 접근은 동료 심사 제안서에 대한 격년 요청을 통해 할당되며, 독점 작업은 Diamond의 Industrial Liaison 그룹에 의해 주선됩니다. 이 워크플로우는 이미 다양한 치료 분야의 100개 이상의 표적에 일상적으로 적용되고 있으며, 화합물 설계를 위한 고품질 시작점 역할을 하고 결합 부위에 대한 광범위한 구조 정보를 제공하는 약한 결합제(1%-30% 적중률)를 효과적으로 식별합니다. 이 과정의 탄력성은 COVID-19 팬데믹 기간 동안 주요 단백질 분해 효소에 대한 3주 턴어라운드를 포함하여 SARS-CoV-2 표적을 지속적으로 스크리닝함으로써 입증되었습니다.

X선 결정학에 의한 절편 스크리닝을 위한 XChem 파이프라인이 광범위하게 간소화되어 과학계에서 이를 활용할 수 있게 되었습니다(그림 5). 이 프로세스는 적중률이 1%에서 30% 사이인 150개 이상의 스크리닝 캠페인에서 검증되었습니다.47,48,49,50,51,52 그리고 많은 반복 사용자에 의해 검증되었습니다. 적합하지 않거나(낮은 분해능, 결정화 또는 회절 품질에서 일관성이 없음) DMSO 또는 에틸렌 글리콜을 견딜 수 없는 결정 시스템은 공정 초기에 제거되어 시간, 노력 및 자원을 절약할 수 있습니다. 성공적인 캠페인은 표적 단백질에 대한 잠재적 상호 작용 부위의 3차원 지도를 제공합니다. 일반적인 결과는 SARS-CoV-2의 주요 단백질 분해 효소의 XChem 스크리닝입니다(그림 6). 전형적으로, 단편 히트는 다음에서 발견된다: (a) 효소 활성 부위 및 서브-포켓(48)과 같은 관심의 공지된 부위; (b) 추정적 알로스테릭 부위, 예를 들어, 단백질-단백질 상호작용53; (c) 일반적으로 거짓 양성으로 간주되는 크리스털 패킹 인터페이스(그림 6). 이 구조 데이터는 일반적으로 단편 히트를 납과 같은 작은 분자 1,3으로 병합, 연결 또는 성장시키기 위한 기초를 제공합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig01.jpg"> 그림 1: XChem 파이프라인. 이 플랫폼은 프로젝트 제안부터 샘플 준비, 데이터 수집 및 히트 식별에 이르기까지 개략적으로 표현됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig02.jpg"> 그림 2: 스크리닝 전략. 워크플로는 각 마일스톤의 목적, 실험의 요구 사항 및 결정 지점을 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig03.jpg"> 그림 3: 시료 전처리 워크플로우. 샘플 준비에 대한 중요한 단계는 SQLite 데이터베이스에 기록되는 각 단계의 정보와 함께 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig04.jpg"> 그림 4: XCE를 사용한 데이터 분석. 데이터 분석의 중요한 단계는 관련 소프트웨어 패키지가 포함된 워크플로 다이어그램으로 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig05.jpg"> 그림 5: XChem 사용자 프로그램의 진화: 이 차트는 2015년부터 2019년까지 사용자 프로그램의 활용 및 통합, 2019년 BAG 생성, 2020년 COVID-19 팬데믹을 통한 플랫폼의 복원력을 보여줍니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig06.jpg"> 그림 6: XChem fragment screen의 대표적인 결과. SARS-CoV2 주요 프로테아제(Mpro) 이량체는 활성 부위 히트가 노란색으로 표시된 표면, 추정 알로스테릭 히트가 자홍색으로 표시되고, 표면/결정 패킹 인공물이 녹색으로 표시됩니다. 이 수치는 그룹 증착 G_1002156의 Chimera 및 Mpro PDB 항목을 사용하여 만들어졌습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 백서는 결정 기반 단편 스크리닝을 위한 전체 XChem 프로세스를 설명하며, 액세스 신청부터 데이터 보급에 이르는 모든 후속 단계를 설명합니다.

Diamond Light Source의 XChem 시설에서 효율적인 Fragment Screening 달성

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify ...

Diamond Light Source의 XChem Facility는 정기적이고 대규모 결정 그래픽 단편 스크리닝을 제공하여 전체 결정에서 증착 공정을 지원합니다. X선 결정학은 FBDD 툴킷의 필수적인 부분입니다. 약한 결합체를 식별할 수 있을 만큼 민감하며 분자 수준에서 상호 작용에 대한 구조적 정보를 직접 생성합니다.단편 기반 약물 발견은 선도 물질 발견을 위해 널리 사용되는 전략입니다. 6개의 약물을 임상용으로 전달했으며 50개 이상의 분자가 임상 시험에 진행되었습니다. XChem 플랫폼이 제공하는 발전과 효율성이 기존의 담금 방법, 데이터 수집 및 분석 방법에 미치는 영향은 시각적으로 가장 잘 입증되었습니다.크리스탈과 화합물 위치를 선택하여 시작하십시오. PC에서 TextRank를 열고 오른쪽 하단의 목록에서 또는 왼쪽 상단의 상자에 바코드를 입력하여 크리스탈 트레이를 선택합니다. 올바른 이미지 형식과 단일 웰 보기를 선택합니다.결정에 부딪히지 않고 방울에 용매 또는 화합물을 추가하려면 방울 이미지를 이동하는 동안 실험에 적합한 결정이 발견되면 방울 내부를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하되 결정에서 멀리 떨어뜨립니다. Echo 소프트웨어를 열고 새로 만들기를 선택하여 음향 디스펜서를 사용하여 용액을 분배합니다. 올바른 소스 웰 플레이트와 액체 등급을 선택하십시오.올바른 플레이트 유형이 대상 플레이트로 선택되었는지 확인하십시오. 그런 다음 사용자 지정 상자를 선택하고 계속하십시오. 가져오기를 선택하고 관련 배치 파일을 선택합니다.그런 다음 소프트웨어의 프롬프트에 따라 가져오기 단계를 완료합니다. 플레이트 맵을 사용하여 분주할 용액과 대상 위치를 확인합니다. 그런 다음 프롬프트가 나타나면 프롬프트에 따라 프로토콜을 실행합니다.소스 플레이트의 용액이 선택한 크리스탈 방울에 분배됩니다. 필요한 시간 동안 인큐베이터에 플레이트를 보관하십시오. 반자동 결정 수확 장치를 사용하여 결정을 수확하려면 작업 흐름 시작 버튼을 눌러 첫 번째로 선택한 웰 위치로 이동합니다.크리스탈이 살아남았다면 루프에 장착하고 액체 질소에 담그고 목록의 첫 번째 퍽에서 1번 위치에 놓습니다. 인터페이스에서 크리스탈에 대한 적절한 설명을 선택합니다. 드롭이 복합 담금인 경우 복합 상태에 대한 설명을 기록합니다.크리스탈이 성공적으로 마운트되면 마운트됨을 선택하고, 그렇지 않으면 실패를 선택합니다. 크리스탈이 채취되면 퍽을 바코드 스캐너로 가져가 홀더에 한 번에 하나씩 넣어 퍽을 스캔하고 바코드를 고정합니다. 스캔이 완료되면 퍽에 뚜껑을 덮고 액체 질소 저장 듀어에 보관합니다.중심이 잘못 잡힌 샘플을 수집하려면 ISPyB의 샘플 체인저 보기를 보고 AP 해상도별 순위를 선택하여 녹색에서 빨간색으로 색상 눈금이 있는 자동 처리 해상도로 샘플을 등급화합니다. 샘플을 클릭하여 빨간색 또는 노란색 샘플이 있는지 확인합니다. 그런 다음 크리스탈 스냅샷을 확인하여 크리스탈이 중앙에 있는지 확인합니다.XChem Explorer 또는 XCE를 통해 Diamond의 자동 처리 결과를 검색하고 분석하려면 터미널에서 하위 폴더 처리로 이동하여 별칭 XCE를 사용하여 XChem Explorer를 엽니다. 개요 탭에서 데이터 원본에서 테이블 업데이트 단추를 선택하여 실험 데이터의 요약을 새로 고칩니다. 설정 탭에서 데이터 수집 디렉터리를 선택하고 데이터 세트 탭을 엽니다.대상 선택 드롭다운 메뉴에서 대상을 선택하고 데이터 세트 드롭다운 메뉴에서 자동 처리에서 새 결과 가져오기를 선택한 다음 실행을 클릭합니다. 딤플을 사용하여 초기 맵을 계산하려면 맵 탭을 열고 드롭다운 메뉴에서 참조 모델을 선택한 다음 원하는 데이터 세트를 선택한 다음 선택한 MTZ 파일에서 딤플을 실행합니다. 리간드 억제를 생성하려면 원하는 데이터 세트를 선택한 다음 맵 및 구속 드롭다운에서 선택한 화합물의 SCF 또는 PDB 또는 PNG 파일을 생성합니다.Panda를 사용하여 히트를 식별하려면 Pandas 탭을 선택하고 출력 디렉터리가 올바르게 정의되었는지 확인한 다음 panda를 실행합니다. Analyze from Hit Identification(히트 식별 드롭다운 메뉴에서 분석). Panda로 식별된 히트를 분석하려면 panda를 실행합니다.Hit Identification 드롭다운 메뉴에서 검사합니다. Panda 제어판으로 Coot를 열려면. 이벤트 맵 및 모델과 비교하기 위해 Dimple에서 평균 및 2mFo-DFc 맵을 로드합니다.리간드가 장착되면 결합 상태 모델에 대한 변경 사항이 손실되지 않도록 다른 이벤트로 이동하기 전에 모델과 리간드 병합 및 모델 저장을 클릭합니다. event comment 필드를 사용하여 바인딩 이벤트에 주석을 달고 레코드 사이트 정보를 사용하여 바인딩 사이트에 주석을 추가합니다. 실행 가능한 모든 리간드가 이벤트 맵을 기반으로 모델링, 병합 및 저장되면 panda.inspect를 닫습니다.Panda 검사 모델을 프로젝트 디렉터리로 다시 내보내고 선택한 데이터 세트에 대한 초기 미세 조정을 시작하면 이제 미세 조정이 미세 조정 탭에 표시됩니다. X선 결정학에 의한 절편 스크리닝을 위한 XChem 파이프라인이 광범위하게 간소화되어 과학계에서 이를 활용할 수 있게 되었습니다. 이 차트는 2015년부터 2019년까지 사용자 프로그램의 활용 및 통합, 2019년 블록 할당 그룹 생성, 2020년 COVID-19 팬데믹을 통한 플랫폼의 복원력을 보여줍니다.성공적인 캠페인은 표적 단백질에 대한 잠재적 상호 작용 부위의 3차원 지도를 생성합니다. 전형적인 결과는 SARS-CoV-2의 주요 단백질 분해 효소의 XChem 스크리닝입니다. 효소 활성 부위 및 서브 포켓과 같은 알려진 관심 부위는 노란색으로 표시됩니다.단백질-단백질 상호 작용에 관여하는 것과 같은 추정 알로스테릭 부위는 자홍색으로 표시되고 일반적으로 위양성으로 간주되는 결정 패킹 계면은 녹색으로 표시됩니다. 역사적으로 결정학을 주요 단편 스크리닝으로 사용하는 것은 어려웠습니다. 이 연구는 샘플 준비에서 최종 구조에 이르기까지 XChem 파이프라인 프로토콜을 문서화했습니다.결정학적 단편 스크리닝은 다른 생물물리학 기법을 보완하며 일반적으로 선도 화합물에 대한 단편 적중을 진행하는 데 필수적입니다. 모든 신약 개발 타겟 클래스에 적용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Chemistry

화학

이 보고서에서 우리는 고급 광자 소스에서 GSECARS 13 BM-C의 빔라인에서 다이아몬드 앤빌 셀과 단결정 X 선 회절 실험을 수행하기위한 세부 절차에 대해 설명합니다. ATREX RSV 및 프로그램 데이터를 분석하는데 사용된다.

고압 PX에서 단결정 회절 ^ 2

구 균 에서 탄수화물 기질 의무적인 단백질의 광범위 한 생 화 학적 및 구조 특성화를 수행 하기 위한 효율적인된 프로토콜 제공 됩니다.

탄수화물 전송 기질 바인딩 단백질 SP0092의 생 화 학적 및 구조적 특성

빠른 2 차원 x 선 형광 및 x 선 microdiffraction 매핑 라우에 (색채 방사선) 또는 분말 (단색 방사선) 회절을 사용 하 여 단일 결정 또는 분말 샘플의 수행을 의미 beamline 설치를 설명 합니다. 결과 지도, 방향, 위상 분포, 긴장과 플라스틱 개 악에 대 한 정보를 제공합니다.

싱크 로트 론 엑스레이 Microdiffraction 및 광물 및 암석 샘플의 형광 이미징

여기, 우리는 일부 싱크 로트 론 beamlines에 자동화 심사 및 사용할 수 있는 데이터 수집 옵션을 사용 하는 방법을 설명 합니다. 과학자는 싱크 로트 론 cryocooled 샘플 보내기 회절 속성은 상영, 데이터 세트는 수집 처리 그리고, 구조 솔루션은 실행 가능한-모든 인간의 개입 없이.

완전히 자치 특성화 및 생물학 고분자의 결정에서 데이터 수집

다이아몬드 빔라인 I24에서 직렬 싱크로트론 결정예촬영을 위한 고정 대상 샘플 준비, 데이터 수집 및 데이터 처리에 대한 포괄적인 가이드를 제시합니다.

다이아몬드 광원의 대상 시리얼 데이터 수집 수정

헬름홀츠 젠트럼 베를린의 결정적 단편 스크리닝은 전용 복합 라이브러리, 크리스탈 처리 도구, 빠른 데이터 수집 시설 및 대부분 자동화된 데이터 분석이 있는 워크플로우를 사용하여 수행됩니다. 제시된 프로토콜은 다운스트림 구조 기반 리간드 설계에 대한 유망한 출발점을 제공하기 위해 이러한 실험의 출력을 극대화할 계획입니다.

헬름홀츠 젠트럼 베를린에서 결정화 조각 검사를 위한 워크플로우 및 도구

데이터의 신호 대 잡음 비율은 마이크로 결정에서 X 선 회절 측정을 수행하는 데 가장 중요한 고려 사항 중 하나입니다. VMXm 빔라인은 이러한 실험을 위한 저소음 환경과 마이크로빔을 제공합니다. 여기서는 VMXm 및 기타 마이크로포커스 대식분자 결정학 빔라인에 대한 미세 결정의 장착 및 냉각을 위한 샘플 준비 방법을 설명합니다.

VMXm 빔라인의 미세 결정을 위한 샘플 준비 파이프라인

여기서, 우리는 다이아몬드 광원에서 빔 라인 I23에 진공 엔드 스테이션으로 결정의 극저온 샘플 준비 및 전송을위한 프로토콜을 제시, 긴 파장 대식차 X 선 결정학 실험.

다이아몬드 광원에서 빔라인 I23의 진공 장거리 결정예 촬영을 위한 샘플 준비 및 전송 프로토콜

표적단백질(즉,열시프트 분석, TSA)의 용융 온도의 변화를 모니터링하는 것은 수백 개의 화합물의 단편 라이브러리를 선별하는 효율적인 방법입니다. 당사는 본질적인 트립토판 형광 및 단편 스크리닝을 위한 가벼운 백 산란을 모니터링하기 위한 로봇 보조 나노 차분 스캐닝 플루오리미터(나노 DSF)를 구현하는 TSA 프로토콜을 제시합니다.

단편 기반 리드 디스커버리에서 스크리닝을 위한 나노 차분 스캔 형광

여기서는 EMBL 그르노블의 HTX 연구소의 CrystalDirect 기술을 기반으로 단백질-투 구조, 신속한 리간드 단백질 복합 분석 및 대규모 단편 스크리닝을 위해 자동화된 거대 분자 결정도 파이프라인을 사용하는 방법을 설명합니다.

그르노블의 EMBL HTX 시설의 자동 결정화 파이프라인

당사는 Harwell의 Research Complex에 있는 결정화 시설을 사용하여 단백질의 결정화를 위한 프로토콜을 제시하고 Diamond의 Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi) 빔라인에서 플레이트 내의 결정으로부터 후속 in situ X선 결정학 데이터 수집을 제시합니다. 시료 요구 사항, 결정화 프로토콜 및 데이터 수집 지침에 대해 설명합니다.

Harwell 및 Beamline VMXi의 결정화 시설을 사용한 결정화 및 현장 실온 데이터 수집, Diamond Light Source

배우세요 Diamond Light Source XChem 시설에서 X선 결정학을 활용한 효율적인 프래그먼트 스크리닝 방법을. 샘플 준비부터 데이터 분석까지 완전한 파이프라인을 통해 단백질 상호작용 부위를 정확히 식별하고 신약 발견 연구를 가속화할 수 있습니다.

Diamond Light Source의 XChem 시설에서 효율적인 Fragment Screening 달성

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