Name: 단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 52 s
Description: 배우세요 단일 입자 저온 전자 현미경법을 활용한 생물대분자 복합체 구조 결정 방법을. 샘플 준비부터 그리드 스크리닝, 원격 데이터 수집까지 전체 파이프라인을 익히고 구조생물학 연구에 활용하세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 유럽 위원회의 호라이즌 2020 프로그램에 의해 투자 iNEXT-디스커버리 (그랜트 871037)에 의해 지원되었다. J B. R. 화이트는 웰컴 트러스트(215064/Z/18/Z)의 자금을 지원받습니다. FEI 티탄 크리오스 현미경은 리즈 대학 (UoL ABSL 상)과 웰컴 트러스트 (108466/ Z / 15 / Z)에 의해 투자되었다. 우리는 그의 현미경 분석 스크립트의 사용에 대한 M Iadanza 감사합니다. 우리는 웰컴 트러스트, MRC 및 BBRSC가 지원하는 영국 국립 전자 바이오 이미징 센터 (eBIC)에서 저온-EM 시설에 대한 액세스 및 지원을 위한 다이아몬드 광원을 인정합니다.

이해 상충이 보고되지 않습니다.

이 프로토콜에서 우리는 일상적인 SPA에 적합한 표본에 적용되는 기본 파이프 라인을 설명했습니다. 박막 형성 및 유리화의이 필터 종이 블로팅 방법은 의심 할 여지없이 현재까지 SPA 프로젝트의 대부분에 사용 주어진 성공이지만, 그것은 단점의 숫자와 함께 제공됩니다. 여기에는 시료 낭비, 박막을 형성하고 시편을 동결하는 데 필요한 느린 시간 척도(초)가 포함되며, 불경정성을 보고하고 필터 용지를 사용하여 과잉 액체50을 멀리 하는 부정적인 효과를 보고하였다. 최근에는 박막 제작의 재현성을 높이기 위해 신기술이 개발되었다51,52. 샘플 응용 분야와 바이트로피화 53,54,55 사이의 시간을 줄이는 다른 기술이 개발되었습니다. 박막 형성을 위한 필터 종이 기반 방법은 작성 시 SPA 극저온 샘플 제제의 가장 유비쿼터스 방법이지만, 이러한 새로운 기술은 그리드 바이트로화의 효율성과 재현성 측면에서 다양한 이점을 가져올 뿐만 아니라, 진동 화 전에 시간 해결 및 신속한 혼합과 같은 추가적인 실험 차원을 가져올 수 있는 새로운 기회를 창출할 수 있다.
대부분의 사용자에 대한 그리드 스크리닝 과정은 현재 낮은 배율 아틀라스를 획득한 다음 그리드 전체에서 높은 배율 이미지를 사용하여 입자 분포를 평가하는 질적 프로세스입니다. 이것은 몇몇 유형의 견본을 위한 충분히 견고한 접근이지만, 표본이 실제로 연구원이 이미지에 바라고 있는 무슨또는 선호하는 방향을 가지고 있는지, 예를 들면 작은 (<200 kDa) 견본을 가진 또는 저해상도 형태학이 입자 분포의 범위가 존재하는 경우에 눈으로 확인하기 어렵게 만드는 경우에 눈으로 평가하기 어려울 수 있습니다. 일부 프로젝트의 경우, 시편이 원하는 지 여부를 결정하는 것은 불가능하며, 예를 들어 리간드가 결합되어 있거나 샘플이 스크리밍되는 위치가 작은(예를 들어, 10kDa) 하위 단위가 여전히 복합체와 연계되어 있는지 여부를 평가하는 것이 불가능합니다. 이러한 프로젝트의 경우 데이터 분석을 위한 완전 자동화된 파이프라인과 '짧은' 0.5- 1-h 컬렉션이 결합되어 이미지 처리 단계를 통해 2D 분류 또는 3D 분류 및 개선으로 진행할 수 있어 더 긴 컬렉션이 보증되는지 여부를 효율적으로 결정하는 데 도움이 됩니다. 이러한 파이프라인은 아직 개발 중이며 현재 널리 구현되지는 않지만, 특히 까다로운 표본의 경우 극저온 그리드 스크리닝의 효율성을 향상시킬 수 있습니다.
직접 전자 검출기의 개선뿐만 아니라 이미지 시프트 데이터 수집과 같은 이미지 처리의 발전과 결합된 현미경 검사법의 수정은 데이터 수집 중에 생성된 이미지의 처리량과 품질을 증가시켰습니다. 수집되는 데이터의 비율이 증가하는 것은 많은 TB의 데이터를 수집하기 전에 극저온그리드를 철저히 검사해야 할 필요성을 강조합니다.
CryoEM SPA는 진정으로 주류 구조 생물학 기술이되었으며, 많은 경우에 이질성 및 음순 거대 분자 복합체와 같은 일부 종류의 표본에 대한 '이동'접근 방식이 되었습니다. 여기에 프로토콜은 SPA 파이프 라인의 기본 개요를 설명하는 동안, 여기에 적용되는 각 섹션 (그리드 바이크리제이션 및 스크리닝, 극저온 EM 및 이미지 처리) SPA 프로젝트의 개발 중에 탐구의 그 자체로 가치가있는 주제입니다. 샘플 준비 및 현미경 기술이 발전하고 새로운 이미지 처리 알고리즘과 접근 방식이 온라인상태가 됨에 따라 SPA는 복잡한 생물학적 시스템에 대한 통찰력을 얻기 위해 연구자들이 지속적으로 파이프라인으로 발전할 것입니다.

단일 입자 CryoEM 분자 수준에서 생명을 조사하기 위해 우리는 구조를 이해해야합니다. 단백질 구조를 조사하는 많은 기술은 NMR, X 선 결정학, 질량 분광법 및 전자 현미경 검사법 (EM)과 같은 유효합니다. 현재까지, 단백질 데이터 뱅크 (PDB)에 증착된 구조물의 대다수는 엑스레이 결정학을 사용하여 해결되었습니다. 그러나, ~2012년부터, 극저온 전자 현미경검사(cryoEM)는 단백질 구조 측정을 위한 주류 기술이 되었고 그 사용은 극적으로 증가하였다. 전자 현미경 데이터 뱅크 (EMDB)에 증착 된 EM 지도의 총 수는 2012 년 1,566에 비해 13,421 (그림 1, www.ebi.co.uk)이었다. 2012년 냉동EM 밀도 맵에서 모델링된 원자 좌표의 수는 67개에 불과했지만 2020년 12월 현재 2,309개의 구조물이 35배 증가했습니다. '해상도 혁명'1이라고도 불리는 극저온 밀도 맵의 품질과 수량의 근본적인 성장은 여러 영역에서 발전의 결합에 의해 발생했습니다: 직접 전자 검출기로 알려진 이미징을 위한 새로운 카메라의 개발; 새로운 소프트웨어; 보다 안정적인 현미경2,3,4.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig01.jpg"> 그림 1: 2012년부터 2020년 12월까지 EMDB에 대한 누적 제출. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig01large.jpg" target="_blank"></a>
단일 입자 분석(SPA)은 바이러스7,8, 멤브레인 단백질9,10, 헬리칼 어셈블리11 및 기타 동적 및 이질성 거대 분자 복합체12,13을 포함하여 격리 된 복합체의 고해상도 구조를 해명하여 다양한 샘플 유형에서 생물학적 통찰력을 생성하는 강력한 도구입니다(39kDa에서 크기)의 순서에 따라 달라지는 크기(kDa3)의 크기(kDa에서 크기)에 따라 달라지는 크기(kDa 39)의 크기(kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(kDa 39)의 크기(kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(39kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(kDa에서 39.kDa)의 수주에 따라 달라진 크기(kDa)의 크기(39kDa에서 의 크기)에 따라 달라진 크기(kDa 39)의 수주에 따라 달라진 크기(39kDa)의 크기(kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(kDa 39)의 크기(kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(39kDa에서 크기)에 따라 달라진 크기(39kD 14,15 ~ 수십 메가달톤). 여기서, 샘플에서 구조로 극저온 SPA에 대한 표준 파이프라인에 대한 프로토콜이 설명되어 있다.
이 파이프라인에 착수하기 전에 정제 된 샘플은 다운스트림 성공 가능성을 평가하기 위해 생화학 분석을 받아야합니다. 적합한 시료의 준비는 틀림없이 SPA에 가장 큰 장벽이며, 특히 일시적인 및 이질성 (조성 및 형태 모두) 복합체에 대한 것입니다. 거시 분자 복잡한 제제는 각 극저온EM 마이크로그래프에 많은 입자를 산출하기에 충분한 농도에서 가능한 한 적은 오염 물질을 포함해야 하며, 극저온분석에 적합한 완충조성에 있어야 한다. 자당, 글리세롤 및 높은 (~&gt; 350mMMM의 염 농도, 시료 크기, 특성 및 기타 완충성분에 따라) 특정 완충 성분은 유리화 과정을 방해하거나 이미지의 신호 대 잡음 비율을 감소시킬 수 있어 구조 판정을 저해한다.
전형적으로, 최소크기 배제 크로마토그래피(SEC)와 SDS-PAGE 겔 분석은 샘플 순도17,18을 평가하는 데 사용해야 하지만, 원형 이색성, 기능적 분석, SEC와 다각광 산란, 열 안정성 분석 은 모두 cryoEM 분석 전에 거시분자 복합체 제제의 질적 분석을 위한 유용한 도구이다. 그러나, 이러한 생화학 적 분석에서 결과는 극저온EM 그리드에 샘플의 구조적 이질성과 행동에 약간의 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이러한 이유로, 네거티브 얼룩 EM은 조성 및 형태 이질성을 평가하기 위한 빠르고 저렴하며 강력한 도구로 일상적으로 사용되며, 따라서 정제로부터 어떤 용출 분수가 가장 유망하거나 다른 완충 조성물을 선별하는 좋은 방법입니다19,20. 유망한 샘플이 확인되면 SPA 극저온 파이프라인으로 진행할 수 있습니다. 음의 얼룩이 항상 극저온EM에서 볼 수있는 후속 결과와 일치하지 않습니다; 때로는 샘플은 부정적인 얼룩에 의해 가난한 보이지만 극저온에서 유리체 얼음에서 볼 때 개선됩니다. 대조적으로, 때때로 견본은 음극기 단계 도중 우수해 보이지만 극저온으로 진행할 때 상당한 추가 최적화가 필요합니다. 그러나, 대부분의 경우 네거티브 얼룩은 유용한 품질 관리 단계를 제공한다.
바이트로케이션 전자 현미경의 진공 시스템 내의 가혹한 환경은 고정되지 않은 생물학적 표본에 탈수 및 방사선 손상을 모두 유발합니다21. 따라서, 원어민과 같은 상태에서 샘플을 이미지하기 위해, 생물학적 표본은 이미징 전에 보존되어야 한다. 거시분자 복합체의 정제제제를 위해, 유리화는 단지의 원자적 세부사항을 보존하면서 극저온에 의한 시각화를 가능하게 하는 방안이다. 샘플 제제의 방법으로 유리화의 발견은 두보셰가 2017년 노벨 화학상에서 인정받은 생물학적 표본의 전자 현미경 검사법의 근본적인 발전이었습니다. 시료 진동은 관심 있는 표본을 포함하는 얇은 층의 용액을 만드는 것을 포함하며, 일반적으로 수십 nm 두께의 극저온그리드 지지대에서 매달려 있다. 박막은 다음 ~-175°C에서 액체 에탄과 같은 극저온에서 매우 빠르게 동결된다. 동결속도는 ~106 °C/s로, 비정질 또는 유리체 얼음 형태가 충분히 빠르며, 얇고 단단한 필름22에서 시편을 일시 중단한다.
고려해야 할 초기 변수는 cryoEM 그리드 지원선택23입니다. EM 그리드는 일반적으로 지지 구조를 통해 천공(일반 또는 불규칙)이 있는 비정질 탄소 필름으로 구성됩니다. 상기 지지 구조는 일반적으로 직경 3.05mm의 원형 금속 그리드이지만, 일반적으로 구리로 만들어지지만, 금 또는 몰리브덴(열 팽창 특성24이 선호되는)과 같은 다른 금속을 사용할 수 있다. 때로는 그래핀, 그래핀 옥사이드 또는 얇은(~1-2nm) 비정질 탄소 층과 같은 그리드 전체에 얇고 연속적인 지지가 가해질 때가 있습니다. 표준 극저온(가장 일반적으로 400-200 메쉬 구리)이 천공된 메쉬 구리(1.2 μm 원형 구멍1.3μm(r1.2/1.3)로 분리되거나 탄소 의 2μm(r2/2)로 분리된 2μm) 탄소 지지체-많은 다른 패턴이 사용 가능하지만, 대부분의 구조에서 사용되어 왔다. 전도도 향상 및 표본 이동 감소를 가진 새로운 그리드 기술이 보고되었습니다25 . 선택된 그리드는 광방전/플라즈마 세척 처리를 통해 친수성 및 시료 적용을 가능하게 합니다26.
광선 배출 에 이어 다음 단계는 박막 형성입니다. 이 박막은 가장 일반적으로 그리드에서 여분의 액체를 제거하기 위해 필터 종이를 사용하여 형성된다. 이 수동으로 수행 할 수 있지만, 플런지 동결 장치의 숫자는 비트 로봇 Mk IV (열 피셔 과학), EM GP II (라이카) 및 CP3 (가탄)를 포함하여 시판적으로 사용할 수 있습니다. 이러한 장치를 사용하면 용액의 샘플 ~3-5 μL이 EM 그리드에 적용되고 필터 용지를 사용하여 과도한 용액을 블롯합니다. 박막이 매달려 있는 그리드는 액체 질소(LN2)에 의해 냉각된 액체 에탄으로 뛰어들어 ~-175°C로 떨어지게 된다. 일단 동결되면, 그리드는 편각점(-137°C) 이하의 온도에서 유지되고, 이미징 중에 유지된다.
표본 선별 및 데이터 수집 극저온EM 그리드의 진동에 따라 다음 단계는 그리드를 스크리그하여 품질을 평가하고 그리드가 고해상도 데이터 수집을 진행하는 것이 적합한지 여부를 결정하는 것입니다. 이상적인 저온EM 그리드에는 얼음 두께가 표본의 가장 긴 치수를 수용할 수 있는 유리체 얼음(결정얼음 반대)이 있어 주변 얼음이 가능한 한 작은 소음을 냅니다. 얼음 내의 입자는 생화학과 일치하는 크기와 (알려진 경우) 모양을 가져야하며, 이상적으로 입자 배향의 임의 분포와 함께 단일 분산되어야합니다. 마지막으로 그리드는 원하는 데이터 수집 길이를 충족하기에 충분한 품질 영역을 가져야 합니다. 시편에 따라 최적의 그리드가 생성될 때까지 많은 진동 및 스크리닝이 필요할 수 있습니다. 다행히도 불행히도 극저온EM 그리드의 입자 분포를 변경하기 위해 경험적으로 테스트할 수 있는 다양한 변수가 있습니다(in16,27 검토). 본 원고에서는 막 단백질 프로젝트에 대한 대표적인 결과가 나타났다10.
적절한 그리드가 확인되면 데이터 수집이 진행될 수 있습니다. 생물학적 표본을 위한 저온 전염 전자 현미경의 몇몇 모형은 자동화된 방식으로 고해상도 데이터를 수집하기 위하여 최적화됩니다. 일반적으로 데이터는 300kV 또는 200kV 시스템에서 수집됩니다. EPU(써모 피셔 과학) 28, 레기논29, JADAS30 및 시리얼EM31,32를 포함한 소프트웨어를 사용하여 자동화된 데이터 수집을 달성할 수 있습니다. 최신 검출기가 있는 자동화된 데이터 수집은 일반적으로 24시간 동안 원시 데이터의 테라바이트(TB)를 생성합니다(평균 데이터 집합은 ~ 4TB 크기).
2020년 12월 에 위치한 COVID-19 제한으로 인해 많은 현미경 시설이 원격 액세스를 제공하기 위해 이동했습니다. 그리드가 현미경의 오토로더에 로드되면 원격으로 데이터 수집을 수행할 수 있습니다.
이미지 프로세싱 및 모델 구축 데이터 수집 세션이 일반적으로 0.5-4일 일 수 있는 경우 컴퓨팅 리소스의 가용성에 따라 후속 이미지 처리에는 몇 주 및 몇 주가 걸릴 수 있습니다. 초기 이미지 처리 단계, 즉 모션 보정 및 콘트라스트 전송 기능(CTF) 추정에 대한 표준으로 '즉석' 33,34를 수행한다. 다운스트림 처리를 위해 다양한 소프트웨어 제품군을 사용할 수 있습니다. 입자는 '수확'하고 현미경 그래프35,36에서 추출됩니다. 입자를 추출하면 표준 프로토콜은 여러 단계의 분류(두 차원(2D)와 3차원(3D) 및/또는 특정 관심 영역에 초점을 맞춘 여러 계라운드를 통해 입자를 처리하여 동질적인 입자 하위 집합에 도달하는 것입니다. 그런 다음 입자의 균일한 하위 집합은 3D 재구성을 생성하기 위해 함께 평균됩니다. 이 시점에서 데이터는 CTF 정제, 왜곡 보정37 및 Bayesian 연마38을 통해 가능한 최고 품질의 맵을 생성하기 위해 더 수정되는 경우가 많습니다. 이 이미지 처리의 결과는 관심있는 생물학적 표본의 3D 극저온맵입니다. 300kV 현미경 시스템에서 수집된 데이터는 단백질 복합체의 크기와 유연성에 따라 일반적으로 10Å와 2Å 사이인 충분한 품질의 그리드에서 '표준' 자동화된 단일 입자 실험에 도달한 해상도 범위가 있습니다. 이상적인 표본을 사용하면 이제 SPA 워크플로를 사용하여 ~1.2 Å의 해상도에 도달했습니다. 이 프로토콜은 EM 밀도 맵을 획득하는 단계를 자세히 설명하지만, 일단 이 프로토콜이 손에 들어오면 단백질 모델을 피팅하고 정제하여 추가로 해석될 수 있습니다(해상도가 3.5Å에 &lt; 경우) 또는 건물 드 novo39. 구조 결정 실험과 관련된 데이터는 EM 밀도 맵(전자 현미경 데이터 뱅크)40, 결과 원자 좌표(단백질 데이터 뱅크) 41 및 원시 데이터 세트(전자 현미경 공공 이미지 아카이브)를 포함하여 온라인 공개 저장소에 증착될 수 있습니다.
본 프로토콜에서, 포르피로모나스 진기발리스 로부터의 외부막 단백질 복합체 라그AB(~340 kDa)는 대표적인 거대분자 복합체10 (EMPIAR-10543)으로 사용된다. 극저온에 익숙하지 않은 경우 iNEXT 디스커버리 및 지시와 같은 자금 지원 접근 체계를 통해 샘플에서 구조로 이 파이프라인을 통한 샘플을 지원할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>블런트 핀셋</td><td>Agar Scientific</td><td>AGT5022</td><td></td></tr><tr><td>Cryo EM 라운드 스토리지 박스</td><td>Agar Scientific</td><td>AGG3736</td><td></td></tr><tr><td>CryoEM 자동 그리드 박스</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1084591</td><td></td></tr><tr><td>CryoEM 그리드</td><td>Quantifoil</td><td>N1-C14nCu30-01</td><td></td></tr><tr><td>에탄 가스</td><td>Boc</td><td>270595-F</td><td></td></tr><tr><td>LN2&nbsp; 폼 듀어</td><td>Agar Scientific</td><td>AG81760-500</td><td></td></tr><tr><td>LN2&nbsp; 스토리지 듀어</td><td>Worthington industries</td><td>HC 34</td><td></td></tr><tr><td>피펫</td><td>Gilson</td><td>10082012</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁</td><td>Star labs</td><td>s1111-1706</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD</td><td>BD 300869</td><td></td></tr><tr><td>Type II lab water</td><td>Suez</td><td>select fusion</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot 여과지</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot 스티롭홈 컨테이너 어셈블리</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>1086439</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot 핀셋</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>72882-D</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EPU</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2.8.1.10REL</td><td></td></tr><tr><td>TEM 서버</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>6.15.3.22415REL</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Tia ThermoFisher Scientific</td><td>5.0.0.2896REL</td><td></td></tr><tr><td>Titan krios 현미경</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Titan Krios G2</td><td></td></tr></tbody></table>

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure

극저온 전자 현미경 검사법(cryoEM)은 단일 입자 분석(SPA)을 통해 거대 분자 복합체의 구조 적 측정을 위한 강력한 기술입니다. 전체 공정에는 i) 극저온그리드에서 지원되는 박막에서 표본을 유리화하는 과정이 포함됩니다. ii) 입자 분포 및 얼음 품질을 평가하기 위해 표본을 선별; iii) 그리드가 적합한 경우 분석을 위해 단일 파티클 데이터 집합을 수집합니다. 및 iv) 이미지 처리는 EM 밀도 맵을 산출합니다. 이 프로토콜에서는 워크플로 중에 사용자가 수정할 수 있는 변수와 일반적인 문제의 문제 해결에 중점을 두고 이러한 각 단계에 대한 개요가 제공됩니다. 원격 현미경 작업이 많은 시설에서 표준이 됨에 따라 현미경에 대한 물리적 액세스가 제한될 때 사용자가 효율적인 작동 및 이미징을 지원하는 이미징 프로토콜의 변형을 설명합니다.

스크리닝할 때, 그리드는 낮은 배율로 해결된 피쳐가 데이터 수집에 적합하지 않은 그리드를 표시하는 아틀라스 단계에서 버릴 수 있습니다. 예를 들어, 그리드가 대부분의 그리드 사각형이 파손된 경우(그림 2A) 또는 그리드가 유리체 얼음이 없는 '건조'한 것으로 보이는 경우(그림 2B). 이러한 그리드는 일반적으로 그리드 사각형의 가장자리가 선명하고 뚜렷하게 나타나기 때문에 식별할 수 있습니다. 플런지 동결 장치를 사용하여 만들어진 대부분의 그리드에서 얼음 그라데이션이 관찰됩니다(그림 2C,D). 입자 분포는 관심 있는 표본에 따라 얼음 두께에 따라 크게 달라질 수 있으므로 입자 분포를 평가하기 위해 다양한 그리드 사각형을 스크리닝하는 것이 좋습니다. 사용자가 유사하거나 다른 얼음 두께의 그리드 사각형을 식별하는 데 도움이 되는 아틀라스 스크리닝 단계에서 EPU 소프트웨어 내에서 도구가 구현되었으며, 극저온엠 그리드(그림 2E, F)를 검사하는 데 특히 유용할 수 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig02.jpg"> 그림 2: 검사 세션에서 낮은 배율 '아틀라스'몽타주를 예로 들 수 있습니다. A) 대부분의 그리드 사각형이 파손되어 상당한 피해를 입은 그리드 - 수집에 적합하지 않습니다. B) 유리체 얼음이 없는 드라이 그리드 - 수집에 적합하지 않습니다. C) 그리드의 50%를 사용할 수 있는 얼음 그라데이션을 보여주는 그리드입니다. D) 그리드의 ~ 33%가 사용 가능한 얼음 그라데이션입니다. C 와 D 는 사용 가능한 그리드 사각형이 수집에 적합한 얼음 두께를 갖는 경우 데이터 수집에 적합하며 수집의 최소 지속 시간을 만족시키기에 충분한 획득 영역(예: 24h) E) 얼음 두께의 범위가 있는 예제 아틀라스가 있습니다. F) E에 제시된 것과 동일한 아틀라스이지만, 얼음 두께에 따라 EPU 소프트웨어로 분류되고 착색된 그리드 사각형. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
입자 분포를 선별할 때 배율 및 총 전자 용량과 같은 이미징 매개 변수가 예상 결과에 대한 정확한 그림을 제공하기 위해 데이터 수집 중에 사용될 것으로 예상되는 것과 유사합니다. 스크리닝 하는 동안 이상적인 입자 분포는 다양한 입자 배향이 보이는 단일 분산(표본 및 입자 의 형태에 대한 기존 지식에 따라 확인하기가 어려울 수 있음)(그림 3A). 얼음이 너무 얇으면 전자 빔으로 비춰질 때 녹을 수 있는 가장 큰 차원의 입자를 수용하면서 얼음은 가능한 한 얇아야 합니다. 이로 인해 현미경 검사에서 과도한 움직임이 발생하며 이 특성을 표시하는 영역은 피해야 합니다(그림 3B). 집단 경험에서, 이 효력은 완충에 세제가 있을 때 가장 일반적으로 관찰됩니다. 이로 인해 구멍 중앙에 매우 얇은 얼음이 생길 수 있으므로 입자를 물리적으로 배제하고 가장자리를 향해 강제로 만들 수 있습니다. 이 효과는 그림 3C에서 관찰되지만 이 경우 극단적인 예가 아니며 이러한 이미지는 여전히 데이터 집합에 유용하게 기여합니다. 마지막으로, 얼음은 유리체가 되어야 합니다. 촬영한 이미지의 대부분 또는 전부가 데이터 수집에서 결정적 얼음(그림 3D)을 표시하는 그리드(또는 그리드)의 영역을 제외합니다. 종종, 비 유리체 얼음그리드 사각형의 가장자리에서 관찰된다. 독자는 그리드 바이트화16 중에 변경할 수 있는 변수에 대한 자세한 리뷰와 박막 환경에서입자 동작에 대한 설명을 추가로 참조합니다46,47.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig03.jpg"> 그림 3: 다른 입자 분포를 보여주는 대표적인 현미경 사진입니다. A) 다양한 방향을 채택하는 단분산 입자의 '이상적인' 분포입니다. B) 전자 빔에 노출되면 변형되는 구멍 중간에 지나치게 얇은 얼음이 현미경 그래프에서 과도한 움직임을 일으킨다. 이 효과는 버퍼 C에 세제가 있을 때 가장 자주 관찰됩니다) 얼음이 구멍 중앙에 얇아지는 경우, 이것은 물리적으로 중앙에서 입자를 배제하여 구멍 가장자리를 향해 입자의 혼잡을 일으킵니다. 이 경우 이러한 이미지가 유용하지 않도록 충분히 극단적이지 않지만 약간 두꺼운 영역을 선별 할 가치가 있음을 시사합니다. D) 얼음은 유리체가 아니며, 이 예 현미경 과 같은 부위에 데이터를 수집해서는 안됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
즉석 이미지 처리는 데이터 수집에 대한 오류 및 문제를 해결하는 데 도움이 되므로 가능한 경우 항상 권장됩니다. 예를 들어, 마이크로그래프 내의 과도한 움직임은 자동 로더 터보 펌프가 활성화되어 있거나 전자 빔에서 얼음이 크게 움직이는 금이 간 그리드 사각형에서 데이터가 수집되고 있음을 나타낼 수 있으며, 이는 그리드 사각형을 건너뛸 것임을 나타낸다. 즉석에서 CTF 추정은 양초점점(디포커스가 아닌)이 적용되는 상황(CTF 추정 프로그램 및 매개 변수가 이러한 점을 찾는 경우) 및 Volta phase plate48이 사용되는 위상 시프트를 결정할 수 있습니다. 플라이 이미지 처리 파이프라인에는 사용자가 micrograph 품질을 신속하게 평가하고 데이터 수집 수정이 필요한지 여부를 쉽게 결정할 수 있도록 데이터의 그래픽 요약(그림 4A)이 포함되어 있는 경우가 많습니다.
미생물 그래프에서 입자를 선택하는 것은 오염 이나 그리드 지지 필름과 같은 '거짓 긍정'을 피하면서 최적화가 필요할 수 있습니다. 그러나 crYOLO와 같은 파티클 피커는 데이터의 '첫 번째 패스'(그림 4B)에 대한 기본 매개 변수를 사용하여 충분히 잘 작동하므로 데이터의 품질과 다운스트림 성공 가능성을 보다 쉽게 평가할 수 있는 2D 클래스 평균으로 진행이 가능합니다. 대부분의 프로젝트에서 ~ &gt; 10k 입자의 2D 분류는 이차 구조 세부 사항이있는 클래스를 공개하기 시작해야합니다. 3D로 진행하려면 2D 분류 단계는 일반적으로 다양한 파티클 방향을 나타내는 클래스를 표시해야 합니다. 바람직한 방향이 드러나면, 기울어진 시료를 사용하여 샘플 준비16 또는 추가 데이터 수집의 더 많은 반복이 필요할 수 있다49. '정크' 파티클은 폐기되는 동안 보조 구조 세부 사항을 표시하는 모든 클래스를 선택하여 3D 분석을 수행해야 합니다(그림 4C).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig04.jpg"> 그림 4: 초기 이미지 처리 단계입니다. A) '즉석' 이미지 프로세싱 스크립트의 출력. B) crYOLO 일반 모델을 사용하여 식별된 적절하게 자동 고른 입자가 있는 예(왼쪽)는(오른쪽, 적색 사각형으로 경계하는 입자) 스케일 바(흰색)는 50nm이다. C) 빨간색 사각형에서 버려진 클래스를 보여주는 2D 분류 및 녹색으로 추가 처리를 위해 파티클을 선택한 클래스의 결과. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
작은 입자 하위 집합을 사용하여 초기 모델을 생성할 수 있습니다(그림 5A). 그런 다음 이 초기 모델을 3D 분류 및 개선의 시작 모델로 사용할 수 있습니다. RagAB의 경우 데이터 집합에는 3D 분류 중에 분리할 수 있는 세 가지 고유한 순응체가 포함되어 있습니다(그림 5B). 그런 다음 이러한 각 클래스에 기여하는 파티클을 독립적으로 처리하고 EM 밀도 맵을 구체화하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 추가 해석 및 모델 구성의 적용을 받을 수 있습니다.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62415/62415fig05.jpg"> 그림 5: 3D EM 밀도 맵 생성. A) RELION을 사용하여 생성된 일반적인 초기 모델. B) 3개의 별개의 형태 상태로 입자를 분리하는 것을 보여주는 5개 클래스를 넘는 3D 분류: 개방(녹색), 열린 폐쇄(파란색), 닫힌 폐쇄(보라색). C) 마스크 생성 과정. 3D 세련미(왼쪽)의 맵은 키메라에서 시각화되어야 합니다. 그런 다음 볼륨 뷰어를 사용하여 맵이 분리되고 시끄러운 밀도(가운데)가 없는 가장 낮은 임계값을 식별할 수 있습니다. 이 임계값은 RELION 마스크 생성 작업의 초기 바이나화 임계값으로 입력됩니다. 예를 들어 마스크 출력이 회색(오른쪽)으로 표시됩니다. D) 라그AB(EMD-10245)의 개방형 폐쇄 상태의 고해상도 EM 밀도 맵을 필터링하고 로컬 해상도(Å)로 채색합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62415/62415fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

극저온을 이용한 거대 분자 복합체의 구조 결정은 단백질과 복합체의 특정 클래스에 대한 일상이되었습니다. 여기서이 파이프 라인은 요약 (샘플 준비, 스크리닝, 데이터 수집 및 처리) 독자는 더 어려운 표본의 경우 변경 될 수있는 추가 상세한 자원과 변수를 향해 지시된다.

Cryo-electron microscopy (cryoEM) is a powerful technique for structure determination of macromolecular complexes, via single particle analysis (SPA). The ...

단일 입자 저온-EM 분석은 막 단백질, 아밀로이드 피브릴, 핵산 결합 단백질 및 바이러스를 포함한 광범위한 표본에 적용되는 구조 생물학자의 툴박스에서 일상적인 기술이 되었습니다. 샘플 준비가 완료되고 현미경에 로드된 그리드가 완료되면 Astbury 바이오 구조 연구소 및 eBIC와 같은 많은 극저온-EM 시설에서 원격으로 데이터 수집을 수행할 수 있습니다. 성공적인 구조 결정에 대한 주요 장벽은 종종 이 프로세스를 통해 여러 번 반복이 필요한 샘플 준비 및 그리드 스크리닝 단계에 있습니다.여기에서 원격 그리드 스크리닝 및 단일 파티클 데이터 수집을 시연합니다. 현미경 사용자 인터페이스의 자동 로더 탭에서 화살표를 사용하여 옵션 대화 상자를 탭하고 인벤토리 버튼을 누릅니다. 이렇게 하면 카세트의 각 위치를 순차적으로 검사하여 카트리지가 있는지 확인합니다.인벤토리는 각 슬롯에서 순차적으로 실행됩니다. 점유된 모든 슬롯이 매핑되면 인벤토리가 중지됩니다. 현미경 열로 전송할 그리드를 강조 표시하고 부하를 클릭합니다.그리드가 성공적으로 스테이지에 로드되면 슬롯 레이블이 파란색에서 노란색으로 바뀝니다. 그리드를 검사하려면 EPU 소프트웨어를 엽니다. 준비 페이지에서 획득 광학 및 설정을 선택한 다음 드롭다운 메뉴에서 아틀라스 사전 설정을 선택합니다.적절한 빔 설정 사전 설정을 선택하고 매개 변수를 현미경으로 푸시하도록 설정된 프레스를 선택합니다. 컬럼 밸브를 열고 독감 화면을 삽입하려면 누릅니다. 빔이 표시되고 충분히 확산되고 검출기를 덮을 중앙에 있는지 확인합니다.필요한 경우 조이스틱 또는 가상 손 패널을 사용하여 그리드의 더 얇은 영역으로 이동하여 X및 Y.Lift에서 단계 의 움직임을 제어하고 EPU의 미리 보기 버튼을 사용하여 이미지를 찍습니다. EPU에서 아틀라스 페이지로 이동하여 새 세션을 누릅니다. MRC 이미지 형식을 선택하고 스크리닝 세션을 저장하기 위한 적절한 폴더 이름과 위치를 입력한 다음 적용을 클릭합니다.왼쪽의 메뉴에서 스크리닝을 선택합니다. 각 그리드 옆의 확인란을 선택하여 아틀라스 몽타주를 획득한 다음 EPU에서 스크리닝 세션을 시작합니다. 각 검사된 그리드에 대해 아틀라스가 획득되고 사용 가능한 그리드 사각형이 완료되면 나열됩니다.각 아틀라스는 상영 페이지에서 강조 표시하여 볼 수 있습니다. 완료되면 수집된 아틀라스를 검토하고 더 높은 배율로 샘플 품질을 평가하는 데 적합한 그리드를 식별합니다. EPU 스크리닝 메뉴에서 선택한 그리드를 강조 표시하고 로드 샘플을 클릭합니다.아틀라스 스크리닝 메뉴에서 현재 로드된 그리드를 선택하고 그리드 이미지에서 원하는 위치를 마우스 오른쪽 단추로 클릭하고 여기에서 이동 단계를 선택하여 채워진 구멍이 포함된 그리드 사각형으로 스테이지를 이동합니다. EPU 준비 페이지로 돌아가 그리드 정사각형 사전 설정을 선택합니다. EPU 자동 기능 페이지를 열고 그리드 정사각형 사전 설정으로 스테이지 기울기로 자동 유중심을 실행하여 샘플을 동심 높이로 이동합니다.EPU 준비에서 새 그리드 사각형 미리 보기 이미지를 가져 가라. 다른 얼음 두께를 나타내는 다른 구멍에 걸쳐 회색 값을 유의하십시오. 오른쪽 단추를 클릭하고 스테이지를 이동하여 구멍을 통해 스테이지를 이동합니다.구멍 또는 유중심 높이 사전 설정을 선택한 다음 미리 보기를 클릭합니다. 데이터 수집 사전 설정을 선택하고 파티클을 쉽게 식별할 수 있는 배율을 설정합니다. 디포커스 오프셋을 음수 3~5마이크로미터로 설정합니다.그리드 전체의 입자 분포, 방향 및 오염에 대한 다양한 얼음 두께를 재평가하기 위해 단계를 반복합니다. 현미경 가용성에 따라 다른 사이트를 포함하여 향후 수집을 위해 현미경에서 데이터 수집 또는 그리드로 직접 계속 제거할 수 있습니다. 아틀라스 설정을 설정하고 아틀라스를 획득하기 위해 그리드를 선택하여 스크리닝에서 사용할 수 없는 경우 아틀라스를 수집합니다.아틀라스를 획득하고 그리드 위치를 클릭하여 출력을 확인합니다. 아틀라스가 완료되면 프로젝트의 실험적 요구에 따라 각 빔 설정 사전 설정을 정의합니다. 이미지 시프트 교정을 수행합니다.EPU 페이지 세션 설정을 선택한 다음 기본 설정에서 새 세션 또는 새 세션을 선택하여 EPU 세션을 설정합니다. 새 세션을 선택한 후 이전 설정을 사용할 수 있는 옵션을 제공하는 팝업이 나타납니다. 설정은 이전 세션에서 현재 EPU 세션으로 자동으로 로드됩니다.또는 기본 설정에서 새 를 선택하고 저장된 기본 설정이 있는 파일을 선택하여 이 정보를 현재 EPU에 미리 로드합니다. 세션 이름을 유익한 것으로 채웁니다. 유형에서 설명서를 선택합니다.획득 모드의 경우 수차 없는 이미지 시프트 컬렉션을 사용할 수 있고 원하는 경우 정확한 구멍 중심을 선택하거나 더 빠른 수집을 선택합니다. 원하는 이미지 형식을 선택한 다음 저장소 폴더를 선택하고 EPU는 세션 이름으로 디렉토리를 만듭니다. 그리드 구멍 간격이 사용되는 지 에 따라 적절한 그리드를 선택하고 적용을 누릅니다.초기 그리드 정사각형을 선택하고 획득 템플릿을 설정합니다. 정사각형 선택으로 이동합니다. 모든 사각형이 녹색인 경우 왼쪽 상단의 모든 선택 취소를 클릭합니다.오른쪽 단추를 클릭한 다음 열린 타일을 선택하여 타일을 엽니다. 선택 선택을 클릭한 다음 마우스 오른쪽 단추를 클릭하고 이동 단계를 그리드 정사각형으로 선택하여 그리드 사각형을 추가하거나 선택합니다. 구멍 선택으로 이동하여 자동 유중심을 누릅니다.그리드 정사각형 이미지가 촬영될 때까지 기다립니다. 자동 기능이 실패하면 높이가 크게 꺼져 있기 때문일 수 있습니다. 그리드 제곱 배율에서 독감 화면을 사용하여 수동으로 조정할 수 있습니다.구멍 크기를 측정하려면 노란색 원을 이동하고 조정하여 올바른 크기와 간격으로 구멍 위에 있습니다. 구멍을 찾아보세요. 구멍이 올바르게 발견되었는지 확인합니다.그렇지 않은 경우 구멍 크기를 변경하고 다시 구멍을 찾습니다 누릅니다. 이 프로세스가 일관되게 실패하면 그리드 제곱 배율에서 더 낮은 숫자 또는 더 밝은 스팟 크기로 이동하는 것이 좋습니다. 오른쪽의 필터 얼음 품질 히스토그램을 사용하여 구멍 선택을 조정합니다.이것은 두꺼운 얼음과 얇은 얼음이있는 영역을 제외하는 데 유용 할 수 있습니다. 세션 중에 선택한 향후 그리드 사각형에 대해 기억됩니다. 상단의 선택 메뉴의 도구로 구멍 선택을 최적화합니다.예를 들어 그리드 막대 에 가까운 구멍을 제거하려면 클릭합니다. 템플릿 정의로 이동하여 획득을 누릅니다. 찾기 및 중앙 구멍을 클릭합니다.단계 이동 후 지연을 변경하고 이미지 시프트 시간 후 지연 시간을 1~5초로 변경한 다음 가능한 경우 최대 이미지 시프트 값이 원하는 대로 확인합니다. 획득 영역을 클릭하고 이미지의 어느 곳을 클릭합니다. 획득 영역을 원하는 위치로 이동합니다.오른쪽 상단에 디포커스 범위를 추가합니다. 멤브레인 단백질 프로젝트의 전형적인 디포커스 목록은 음수 0.8에서 음수 3마이크로미터 디포커스로, 다른 획득 영역을 추가하여 획득 영역이 빔으로 이중으로 노출되지 않도록 배열합니다. 자동 초점 영역을 추가한 다음 이미지의 어느 곳을 클릭합니다.자동 초점 영역을 구멍을 둘러싼 탄소로 이동합니다. 표준 관행은 제곱정에 걸쳐 Z 높이 변화에 따라 AFIS 또는 5 ~ 15 마이크로미터를 사용할 때 중심을 이윤을 사용하는 것입니다. 드리프트 측정 영역을 추가하려면 클릭합니다.드리프트 측정은 그리드 스퀘어당 한 번 수행되었으며 표준 설정으로 초당 0.05 나노미터의 설정된 임계값을 측정했습니다. 드리프트 측정 영역은 자동 초점 영역과 직접 겹칠 수 있습니다. 드리프트나 자동 초점 영역이 획득 영역과 겹치지 않도록 합니다.정사각형 선택으로 돌아가 그리드에서 수집할 사각형을 선택합니다. 수집 영역 수와 예상 데이터 수집 률을 사용하여 필요한 수집 영역 수를 예측합니다. 원하는 사각형을 모두 선택하면 모든 사각형을 준비합니다.각 사각형이 수집되면 그리드 사각형 사이를 탐색하고 선택 브러시를 사용하여 구멍을 미세 조정합니다. 시편의 스테이지 위치로 이동하고 자동 기능을 사용하여 동심 높이를 설정합니다. 이전에 설명된 바와 같이 현미경 소프트웨어를 사용하여 현미경 정렬을 수행하고 텍스트에 있습니다.목표 조리개를 다시 삽입하고 중앙에 조정하고 EPU로 객관적인 렌즈 난시를 수정하기 전에 자동 기능 내에서 혼수 상태에 관계없이 혼수 상태에 관계없이 정렬을 수행합니다. 두 선형이 모두 적절한 값에 수렴되는지 확인합니다. 자동 인수 실행을 시작하기 전에 자동 로더 터보 펌프가 꺼지고 필요한 경우 목표 조리개가 삽입되었는지 확인합니다.자동화된 인수에서 자동화된 데이터 수집을 시작하기 위해 프레스 실행을 시작합니다. 이 프로토콜을 사용하면 아틀라스 단계에서 깨진 또는 건조 그리드를 선별하고 폐기할 수 있습니다. 대부분의 그리드에서 얼음 그라데이션이 관찰됩니다.스크리닝 하는 동안 이상적인 입자 분포는 다양한 파티클 방향을 볼 수 있는 단일 분산됩니다. 얼음이 너무 얇으면 전자 빔으로 비춰지면 녹아 마이크로 그래프에 과도한 움직임을 일으킬 수 있습니다. 버퍼에 세제가 있을 때 가장 일반적으로 관찰됩니다.얼음은 유리체여야 하므로 대부분의 이미지가 결정적인 얼음을 보여주는 그리드 영역은 제외되었습니다. 현미경 사진 품질을 평가하고 데이터 수집 수정이 필요한지 여부를 결정하기 위해 데이터의 그래픽 요약이 포함되었습니다. crYOLO와 같은 파티클 피커는 데이터의 첫 번째 패스를 위해 충분히 잘 작동하므로 2D 클래스 평균으로 진행이 가능합니다.정크 파티클을 폐기해야 하는 동안 3D 분석을 위해 보조 구조 세부 사항을 표시하는 클래스를 선택해야 합니다. 파티클의 하위 집합을 사용하여 3D 분류 및 미세 조정을 위한 초기 모델을 생성할 수 있습니다. RagAB의 경우 데이터 집합에는 3D 분류 중에 분리할 수 있는 세 가지 구분 순응자가 포함되어 있습니다.데이터 수집 및 후속 이미지 분석 단계의 성공은 스크리닝 단계에서 최적화된 그리드를 획득하고 식별하는 데 의존한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 3D EM 밀도 맵이 얻어지면 단백질 모델을 피팅 및 정제하거나 원자 모델 드 노보를 구축하여 더욱 해석될 수 있습니다. Cryo-EM 단일 입자 분석을 통해 이전에는 불가능했던 많은 대상을 구조화한 측정할 수 있습니다.특히 이러한 워크플로우는 최근 COVID-19 관련 거대 분자의 구조를 해결하는 데 사용되었습니다.

single-particle-cryo-electron-microscopy-from-sample-to-structure

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 논문은 거의 네이티브 상태의 거대분자의 고품질 현미경 이미지를 얻는 데 사용되는 초저온 전자 현미경 검사 방법론에 대해 설명합니다. 이 방법은 거대분자의 3D 재구성을 생성하기 위해 고안된 단일 입자 접근 방식을 사용하여 추가 컴퓨터 처리에 적합한 이미지를 생성합니다.

거대 분자 3D 재건을위한 샘플 준비에 프라이머 높은 품질 데이터 수집 : 곳을 알아내는 - 전자 현미경의 것과하지 말아야를 수행

악기 및 전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 nanoliter 크기의 샘플 볼륨의 준비를 위한 방법 제공 됩니다. 아무 종이 blotting 단계 필요, 따라서이 단백질, 크게 샘플 손실을 감소 시키고 단일 세포 lysate 시각적 proteomics에 대 한 분석을 사용에 대 한 가질 수 해로운 결과 피하는.

전송 전자 현미경 검사 법에 대 한 소형된 샘플 준비

극저온 전자 현미경 검사법의 단일 입자 분석은 고해상도에서 생물학적 앙상블의 구조를 결정하는 데 사용되는 주요 기술 중 하나입니다. Scipion은 현미경에 의해 획득된 정보를 처리하고 생물학적 표본의 3D 재구성을 달성하기 위해 전체 파이프라인을 만드는 도구를 제공합니다.

Scipion을 가진 극저온 EM 및 단일 입자 분석

우리는 극저온 전자 단층 촬영을 통해 대용량 분자의 고해상도 구조 연구를 위해 극저온 중심이온 빔 마이크로머시닝에 의한 급락 냉동 생물학적 표본의 라멜라 제제를 위한 프로토콜을 제시합니다. 제시된 프로토콜은 사카로미세스 세레비시아에내부의 거대 분자의 구조적 특성화를 위한 높은 재현성을 가진 고품질 라멜라의 제조를 위한 지침을 제공한다.

냉동 전자 단층 촬영을위한 사카로미세스 cerevisiae의 준비 및 Cryo-FIB 마이크로 매칭

이 원고는 단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위해 생물학적 표본을 수동으로 동결하는 블롯 앤 플런지 방법을 설명합니다.

단일 입자 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 생물학적 표본의 수동 블롯 및 플런지 동결

이 문서에서는 3개의 cryo-EM 처리 플랫폼(예: cryoSPARC v3, RELION-3 및 Scipion 3)을 효과적으로 활용하여 고해상도 구조 결정을 위한 다양한 단일 입자 데이터 세트에 적용할 수 있는 단일하고 강력한 워크플로우를 만드는 방법을 설명합니다.

cryoSPARC, RELION 및 Scipion을 사용한 견고한 단일 입자 Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) 처리 워크플로우

거대분자의 고분해능 cryo-EM 맵은 또한 200kV TEM 현미경을 사용하여 달성할 수 있다. 이 프로토콜은 200kV TEM을 사용하여 고해상도 데이터 세트를 성공적으로 수집하는 데 필수적인 정확한 광학 정렬, 데이터 수집 체계 및 이미징 영역 선택을 설정하는 모범 사례를 보여줍니다.

200KV 투과 전자 현미경을 사용한 고해상도 cryo-EM 데이터 세트의 일상적인 수집

본 프로토콜은 Cryo-EM 실험에서 기울어진 단일 입자 데이터 수집을 위한 일반화되고 구현하기 쉬운 체계를 설명합니다. 이러한 절차는 공기-물 계면의 부착으로 인해 우선적인 방향 편향을 겪는 샘플에 대한 고품질 EM 맵을 얻는 데 특히 유용합니다.

Leginon을 사용한 스테이지 틸트를 이용한 단일 입자 Cryo-EM 데이터 수집

이 프로토콜은 시료 전처리 최적화를 통해 불균일한 입자 분포를 해결하기 위한 Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5)를 예로 사용하는 실용적인 방법을 제시하며, 연구자가 극저온 전자 현미경(cryo-EM)을 사용하여 고분자 구조를 효율적으로 규명할 수 있는 참고 자료를 제공합니다.

극저온 전자 현미경을 위한 시료 전처리 최적화

이 논문은 소프트웨어 스위트 인 SPHIRE를 사용하여 저온 EM 이미지를 처리하기위한 프로토콜을 제시합니다. 현재의 프로토콜은 원 자면 해상도를 목표로하는 거의 모든 단일 파티클 EM 프로젝트에 적용될 수 있습니다.

SPHIRE를 사용한 전자 저온 현미경 이미지의 고해상도 단일 입자 분석

배우세요 단일 입자 저온 전자 현미경법을 활용한 생물대분자 복합체 구조 결정 방법을. 샘플 준비부터 그리드 스크리닝, 원격 데이터 수집까지 전체 파이프라인을 익히고 구조생물학 연구에 활용하세요.

단일 입자 저온 전자 현미경 검사법: 샘플에서 구조로

더 많은 동영상 탐색