마그나포테 오리자에서 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 방법을 이용한 히스톤 수정 분포의 게놈 전체 분석

이 방법은 식물 병리학에서 곰팡이 병인 동안 후성 유전학 수정을 통해 후보 대상 유전자의 규제의 근본적인 분자 메커니즘을 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다. 크로마틴 면역 침전 시퀀싱 기술은 전체 게놈에서 히스톤 및 전사 인자와 상호 작용하는 DNA 세그먼트를 효율적으로 감지할 수 있습니다. 다른 방법에 비해 효율성과 해상도를 향상시킬 수 있습니다.

100 마이크로리터 파이펫을 사용하여 오트밀 토마토 애거 플레이트에 100 마이크로리터의 액체 완전 매체를 추가하십시오. 접종 루프를 사용하여 야생 형 변형과 녹아웃 변형의 균주를 긁어 냅니다. 미셀리아 파편을 수집하고 액체 완성 매체의 250 밀리리터로 전송합니다.

곰팡이 하이픈을 0.7 어금니 나트륨 염화 나트륨 용액 500 밀리리터로 씻으세요. 그런 다음 곰팡이 균류를 수집하고 무게를 측정합니다. 곰팡이 균셀륨 1 그램 당 약 1 밀리리터의 용해 효소 투과 용액을 추가하십시오.

150 RPM에서 흔들림과 함께 3 ~4 시간 동안 28섭씨에 이가 에 대한 최해를 놓습니다. 0.7 어금니 나트륨 염화 나트륨 용액의 50 밀리리터로 감은 최면을 씻으시다. 샘플을 원심 분리하고 상체를 신중하게 폐기하십시오.

0.7 어금니 나트륨 염화 나트륨 용액의 20 밀리리터에서 프로토프러스를 다시 중단합니다. 최종 농도가 1%가 될 때까지 상호 연결하기 위해 프토프러스트를 함유한 염화 나트륨 버퍼 2밀리리터에 37%의 포름알데히드 드롭55마이크로리터를 첨가하여 반응하지 않은 포름알데히드를 담금질하고 각 튜브에 글리신 10배의 마이크로리터 20개를 추가합니다. 원심 분리 후 상체를 조심스럽게 버리십시오.

0.7 어금니 나트륨 염화 나트륨 용액의 1 밀리리터에서 펠릿을 다시 중단합니다. 상체를 원심분리 후 신중하게 폐기하고 RIPA 버퍼의 750 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하십시오. 프로테아제 억제제의 37.5 마이크로리터를 추가합니다.

초음파 균질화제를 사용하여 8 분 동안 초음파 처리로 크롬을 전단하십시오. 샘플이 초음파 파손된 후, 시료가 초음파 처리된 후에 방출된 모든 DNA 및 단백질을 포함하는 입력으로서 샘플의 일부를 꺼내십시오. DNA 단편의 길이를 분석하려면 초음파 처리 후 1%아가로즈 겔 전기전도를 실행합니다.

원심 분리 후 원심 분리된 상심체를 1.5밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 나중에 사용하기 위해 섭씨 80도에 저장하십시오. IP 실험을 수행하기 전에 각 크로마틴 샘플을 1~10의 비율로 1배 RIPA 버퍼로 희석합니다. 파이펫 50 마이크로리터의 슈퍼 파라자성 단백질 구슬은 2밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다.

자기 스탠드에 튜브를 놓고 자기 구슬이 침전하게하십시오. 그런 다음 상체를 제거합니다. 튜브에 미리 냉각 된 1 밀리리터를 넣고 슈퍼 파라자성 단백질 구슬을 세 번 씻으십시오.

자기 스탠드에 튜브를 놓고 상체를 제거합니다. 각 튜브에 1회 RIPA 버퍼100마이크로리터를 추가합니다. 크롬틴 샘플 30마이크로리터, 초파라자성 단백질 구슬 100마이크로리터, H3K4me3 항체 4개 마이크로리터를 튜브에 추가하여 잘 혼합합니다.

회전 셰이커에 샘플을 배치하여 섭씨 30배G.Wash 슈퍼 파라자성 단백질 비드 항체 및 크로마틴 복합체를 1밀리리터의 1밀리리터RIPA 버퍼로 재연하여 밤새 배양한다. 저염 면역 복합 세척 버퍼 1밀리리터로 샘플을 세척한 다음, 고염 면역 복합 세척 버퍼 1밀리리터로 세척합니다. 리튬 염화물 버퍼의 1 밀리리터로 구슬을 헹구고 상체를 제거합니다.

그런 다음 튜브에 TE 버퍼 1 밀리리터를 추가합니다. TE 버퍼 1밀리리터로 튜브를 다시 놓고 파이펫으로 상퍼를 제거합니다. 각 원심분리기 튜브에 용출 버퍼 100 마이크로리터를 추가합니다.

섭씨 65도에서 15분간 용출을 수행합니다. 원심분리기는 섭씨 4도에서 10, 000배 G로 1분간, 새로운 원심분리기 튜브로 상피물을 수집합니다. 모든 튜브에 염화 나트륨 5개 소리터 8개를 추가하고 DNA 단백질 교차 링크를 반전시키기 위해 섭씨 65도에서 4~5시간 또는 하룻밤 사이에 배양합니다.

Rnase A의 마이크로리터 1개를 추가하고 섭씨 37도에서 30분 동안 배양합니다. 각 튜브에 4마이크로리터의 단백질Ase K를 추가하고 1~2시간 동안 섭씨 45도에서 배양합니다. 원심분리기 튜브에 펜랄 클로로폼과 이소아밀 알코올 혼합물 550마이크로리터를 첨가합니다.

원심분리기는 10, 000배G에서 15분 동안, 슈퍼나티를 흡인시합니다. 3개의 어금니 나트륨 아세테이트 용액의 1/10 부피, 2.5볼륨의 절대 에탄올 및 3개의 글리코겐 마이크로리터를 튜브에 넣습니다. 샘플을 침전시 동안 밤새 음수 섭씨 20도의 냉장고에 놓습니다.

다음 날, 원심 분리 튜브를 폐기하고 상체를 폐기하십시오. 10, 000회 G.50 마이크로리터의 멸균 분해물을 첨가하여 침전물을 충분히 용해시도록 1밀리리터의 75%에탄올로 펠릿을 세 번 씻으십시오. DNA 끝을 복구하여 DNA 끝 수리 키트를 사용하여 무딘 DNA를 생성하고 텍스트 원고에 언급 된 지침.

3개의 주요 끝에 아데닌 기초를 추가하려면, DNA 30마이크로리터, 2개의 마이크로리터, 10배 Taq 버퍼의 5개의 마이크로리터, 1밀리머 dATP의 마이크로리터 및 Taq DNA 폴리머라제 3개의 마이크로리터를 0.2 마이크로리터 PCR 원심분리튜브에 추가합니다. 혼합하여 PCR 기계에서 섭씨 72도에서 10분 동안 반응합니다. DNA 10 마이크로리터, 9.9 마이크로리터의 물, T4 DNA 리구아제 버퍼 2.5 마이크로리터, 어댑터 올리고 믹스0.1 마이크로리터, T4 DNA 리구아제 2.5 마이크로리터를 0.2 마이크로리터 PCR 원심분리튜브에 혼합하여 링커 결찰을 수행합니다.

4 시간 동안 16섭씨에서 튜브를 배양하십시오. PCR 프라이머를 사용하여 DNA를 증폭시키기 위해 DNA 10.5 마이크로리터, 2배 높은 충실도 마스터 믹스의 12.5 마이크로리터를 추가합니다. PCR 프라이머 PE 1.0의 마이크로리터 1개 및 PCR 프라이머 PE 2.0의 마이크로리터 1개에서 0.2 마이크로리터 PCR 원심분리기 튜브및 잘 혼합한다.

폭도2, 모스프1 및 moswd2 삭제 돌연변이의 H3K4me3 신호는 기능적 표적 영역에서 현저히 감소하였다. 야생형 균주 P131에 비해, 강화된 H3K4me3 크로마티아 면역침전 시퀀싱 판독의 신호는 mobre2, mospp1 및 moswd2 삭제 돌연변이체에서 크게 감소하였다. 이 절차에 따라 칩 및 칩 qPCR에 칩을 수행할 수 있습니다.

그(것)들은 일반적으로 단백질의 다운스트림 표적 유전자를 검열하고 알려진 게놈 결합 사이트에 단백질 DNA 상호 작용을 공부하기 위하여 이용됩니다.