Name: 크기 배제 크로마토그래피는 세균 외부 막 소포 이질성을 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 배우세요 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 Aggregatibacter actinomycetemcomitans의 세균 외부 막 소포 이질성을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 초원심분리보다 빠르고 재현성이 높아 미생물학 연구에 유용합니다.

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이 작품은 국립 과학 재단 (1554417)과 건강의 국립 연구소 (DE027769)에 의해 투자되었다.

1. 버퍼 준비
<ol><li>ELISA 세척 버퍼를 준비하려면 3.94g 트라이스 베이스, 8.77 g NaCl, 1 g 소 세럼 알부민(BSA)을 1L의 디온화(DI) 물에 넣습니다. 500 μL 폴리소르바테-20을 추가합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.</li>
	<li>블로킹 버퍼를 준비하려면 트라이베이스 3.94g, NaCl 8.77g, BSA 10g을 추가합니다. 500 μL 폴리소르바테-20 ~1L의 DI 물을 추가합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.</li>
	<li>용출 버퍼 (PBS)를 준비하려면, 8.01 g NaCl, 2.7 g KCl, 1.42 g Na2HPO4및 0.24 g KH2PO4 ~ 1 L DI 물을 추가하십시오. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다. 참고: 이 버퍼의 10배 용액을 필요에 따라 DI 물로 만들고 희석할 수 있습니다.</li>
</ol>2. OMV 샘플 준비
<ol><li>A. actinomycetemcomitans 세포를 후기 기하급수적 단계로 성장시다(0.7의 600nm에서 광학 밀도). 10 분 동안 4 °C에서 10,000 x g에서 두 번 원심 분리하여 세포를 펠렛. 0.45 μm 필터를 통해 상체를 필터링합니다.</li>
	<li>50 kDa-분자량 컷오프 필터를 사용하여 박테리아가 없는 상체를 농축합니다. 4°C에서 105,000 x g의 농축 용액을 30분 동안 초원심분리기.</li>
	<li>PBS 및 초원심분리기에서 펠릿을 다시 일시 중지합니다(30분 동안 4°C에서 105,000 x g). PBS의 2 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
</ol>3. S-1000 열 포장
<ol><li>젤 여과 매체의 스톡 병을 유리 교반 봉과 섞어 컬럼을 채우는 데 필요한 부피와 약 50% 초과(약 135mL)를 유리 병에 붓습니다. 이 구슬이 정착될 때까지 앉게 한 다음 여분의 액체를 제거합니다. 용출 버퍼에서 구슬을 다시 중단하여 최종 용액이 약 70 %(부피별) 젤, 30 % 버퍼되도록합니다. 진공 상태에서 용액을 탈가스로 탈가스합니다.</li>
	<li>링 스탠드를 사용하여 유리 기둥을 수직으로 마운트하고 용출 버퍼로 채워 기둥의 벽을 적시다. 열에 약 1cm의 버퍼만 남을 때까지 버퍼를 빼내십시오.</li>
	<li>거품을 만들지 않고 조심스럽게 열에 구슬을 피펫하여 열을 맨 위로 채웁니다. 이 프로세스 전반에 걸쳐 초과 버퍼를 계속 배출합니다. 컬럼 상단에 구슬을 추가하기 전에 구슬이 완전히 정착하지 않도록 하십시오. 기둥은 기둥 저장소 의 아래 약 2cm 높이로 포장되어야 합니다.</li>
</ol>4. 시료를 적재하고 분수를 수집
<ol><li>용출 버퍼를 진공 상태에서 탈가스로 방출합니다. 용출 버퍼의 두 개의 열 볼륨 (180 mL)으로 열을 세척합니다.</li>
	<li>나머지 버퍼가 열을 완전히 입력하도록 허용합니다. 버퍼가 젤 층의 상단에 도달하면, 신중하게 오마이비가 포함 되는 2 mL 샘플 (약 100 - 200 nmol/L의 지질 농도에서) 구슬의 표면에, 열의 상단에 있는 구슬중 어느 구슬을 방해 하지 않도록 주의. 샘플이 젤층 위에 액체가 남아 있지 않을 때, 즉 젤에 완전히 입력되도록 합니다.</li>
	<li>젤 컬럼 위에 용출 버퍼를 신중하게 천천히 추가합니다. 이 샘플 희석을 일으킬 것입니다으로, 젤의 상단 층을 방해하지 마십시오.</li>
	<li>기둥 아래에 50mL 튜브 를 하나 배치하고 열을 엽니다. 용출의 처음 20mL를 수집합니다. 열이 건조하지 않도록 필요에 따라 열 상단에 용해 버퍼를 추가합니다.</li>
	<li>열 아래에 1.5mL 튜브를 배치합니다. 컬럼을 시작하고 각 튜브에서 일련의 1mL 샘플을 수집합니다. 샘플이 수집될 때 필요에 따라 열 상단에 용출 버퍼를 계속 추가합니다. 96개의 분수가 수집될 때까지 반복합니다. 열을 중지합니다. 참고: 샘플은 장기 저장을 위해 -20°C 또는 추가 분석전까지 단기 저장을 위해 4°C로 저장되어야 합니다.</li>
	<li>열을 정리하려면 열을 통해 0.1 M NaOH의 하나의 열 볼륨(90 mL)을 실행합니다. 열을 통해 용출 버퍼의 두 개의 열 볼륨(180mL)을 실행합니다.</li>
</ol>5. 샘플 분석
<ol><li>각 분획에서 지질 농도를 측정하기 위해 각 분획의 파이펫 50 μL을 96웰 플레이트의 단일 웰로 넣습니다. 각 우물에, 지방 성 염료의 2.5 μL을 추가합니다. 15s에 대한 인큐베이션. 515 nm의 난회 파장과 640 nm의 방출 파장을 사용하여 플레이트 판독기의 형광 강도를 측정합니다. 각 샘플의 모든 지질의 분획을 계산하려면 모든 방출 강도를 합산하고 각 개별 강도를 총으로 나눕니다.</li>
	<li>특정 단백질의 농도를 측정하기 위해 각 분획의 파이펫 100 μL을 ELISA 면역 플레이트의 단일 웰로 배피합니다. 3 시간 동안 25 °C에서 배양하십시오.<ol>
<li>샘플을 데산합니다. 각 웰과 데낸에 200 μL의 ELISA 세척 버퍼를 추가합니다. 총 5개의 세시즈를 위해 네 번 반복합니다.</li>
		<li>각 우물에 200 μL의 블로킹 버퍼를 추가하고 25 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오. 데반트.</li>
		<li>100 μL 차단 버퍼플러스 1차 항체(정제항체의 경우 1:10,000, 정제되지 않은 항체의 경우 1:10)를 4°C에서 하룻밤 사이에 배양한다. 데반트.</li>
		<li>각 웰과 데낸에 200 μL의 ELISA 세척 버퍼를 추가합니다. 총 5개의 세시즈를 위해 네 번 반복합니다.</li>
		<li>ELISA 세척 버퍼 100 μL과 이차 항체(1:30,000)를 각 웰에 추가합니다. 25°C에서 1h의 인큐베이션을 사용할 수 있습니다.</li>
		<li>각 웰과 데낸에 200 μL의 ELISA 세척 버퍼를 추가합니다. 총 5개의 세시즈를 위해 네 번 반복합니다.</li>
		<li>3,3',5'-테트라메틸벤지딘(TMB)의 100μL을 추가하고 15-30분 동안 또는 파란색이 발달할 때까지 인큐베이션을 제공합니다. 정지 용액의 50 μL로 TMB 반응을 중지합니다.</li>
		<li>플레이트 판독기에서 450 nm의 파장에서 각 우물의 흡광도를 읽으십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>총 단백질 농도를 측정하려면 UV-vis 분광광계를 사용하여 각 분획의280nm(A 280)의파장에서 흡광도를 기록합니다.</li>
</ol>프로토콜의 회로도는 그림 1에표시됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62429/62429fig01.jpg"> 그림 1: SEC 절차의 회로도. 기둥은 거품과 불연속을 피하기 위해 조심스럽게 탈가스 젤 여과 매체로 포장된 다음 두 개의 열 볼륨의 용출 버퍼로 세척됩니다. 다음으로, 샘플은 젤 포장을 방해하지 않고 젤 의 상단에 조심스럽게 파이프를 넣습니다. 컬럼이 열리고 샘플이 젤에 완전히 들어갈 때까지 실행됩니다. 이 시점에서 버퍼는 열 의 상단에 배치되고 용출의 첫 번째 20 mL이 수집됩니다. 다음으로 일련의 1mL 분획이 수집됩니다. 이러한 분획은 지질 및 단백질 함량분석을 위해 96웰 플레이트 또는 96웰 면역 플레이트에 배치됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62429/62429fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<ol><li>Kuehn, M. J., Kesty, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+and+the+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction.</a> Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).</li>
<li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).</li>
<li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414(2018).</li>
<li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).</li>
<li>Horstman, A. L., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enterotoxigenic+Escherichia+coli+secretes+active+heat-labile+enterotoxin+via+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles.</a> The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).</li>
<li>Wai, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle-mediated+export+and+assembly+of+pore-forming+oligomers+of+the+Enterobacterial+ClyA+cytotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin.</a> Cell. 115, 25-35 (2003).</li>
<li>Balsalobre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+the+Type+I+secreted+%CE%B1-haemolysin+via+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).</li>
<li>Donato, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+Bordetella+pertussis+adenylate+cyclase+toxin+to+target+cells+via+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles.</a> FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).</li>
<li>Kim, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+of+Vibrio+vulnificus+deliver+cytolysin-hemolysin+VvhA+into+epithelial+cells+to+induce+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).</li>
<li>Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytotoxic+effects+of+Kingella+kingae+outer+membrane+vesicles+on+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells.</a> Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).</li>
<li>Turner, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+outer+membrane+vesicle+size+determines+their+mechanisms+of+host+cell+entry+and+protein+content%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content.</a> Frontiers in Immunology. 9, 1466(2018).</li>
<li>Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+growth+stage+determines+the+size%2C+protein+composition%2C+and+preferential+cargo+packaging+of+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles.</a> Proteomics. 19 (1-2), 1800209(2019).</li>
<li>Rompikuntal, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+localization+of+internalized+outer+membrane+vesicles+carrying+active+cytolethal+distending+toxin+from+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).</li>
<li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414(2018).</li>
<li>Stevenson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+outer+membrane+vesicles+displaying+conserved+surface+polysaccharide+antigen+elicits+broadly+antimicrobial+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).</li>
<li>Gujrati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+as+cell-specific+drug-delivery+vehicles+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy.</a> ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).</li>
<li>Huang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+novel+nanoantibiotics+using+an+outer+membrane+vesicle-based+drug+efflux+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism.</a> Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).</li>
<li>Chen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+foreign+antigens+by+engineered+outer+membrane+vesicle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+displaying+engineered+glycotopes+elicit+protective+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).</li>
<li>Singorenko, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+A+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+isolation+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Science Reports. 7 (1), 15297(2017).</li>
<li>Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher+functionality+of+extracellular+vesicles+isolated+using+size-exclusion+chromatography+compared+to+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation.</a> Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).</li>
<li>Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+immunological+characterization+of+the+domain+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+leukotoxin+that+determines+its+specificity+for+human+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).</li>
<li>Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigallocatechin+gallate+inhibits+leukotoxin+release+by+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+by+promoting+association+with+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane.</a> Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).</li>
<li>Klimentová, J., Stulík, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolation+and+purification+of+outer+membrane+vesicles+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria.</a> Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).</li>
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</ol>

저자는 보고할 이해 상충이 없습니다.

여기에서, 우리는 세균성 OMV 하위 인구의 간단하고 빠르며 재현 가능한 분리를 위한 프로토콜을 제공했습니다. 이 기술은 비교적 직선적이지만 열에서 효율적인 분리가 발생하는지 확인하기 위해 매우 신중하게 수행해야 하는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 기포를 피하기 위해 젤을 조심스럽게 천천히 컬럼에 적재하는 것이 필수적입니다. 우리는 열을적재하기 전에 몇 시간 동안 실온에서 젤을 두면 젤이 열 내의 거품 형성을 평형화하고 최소화할 수 있음을 관찰했습니다. 겔이 기둥에 피펫되면 난기류를 최소화하기 위해 컬럼 측면을 따라 조심스럽게 파이프를 입력해야 합니다. 적재 하는 동안 항상, 초과 버퍼는 정착 된 젤의 불연속을 피하기 위해 열에서 유지 되어야 합니다. disjunction이 발생하면 더 많은 버퍼와 파이펫을 위아래로 추가하여 젤을 다시 일시 중지합니다.
마찬가지로 샘플로 열을 로드하는 것이 매우 중요합니다. 샘플이 컬럼을 통과할 때 희석되기 때문에 로드된 샘플은 SEC에 의해...

그람 음성 박테리아는 성장을 통해 그들의 외부 막, 소위 외부 막 소포 (OMV)에서 파생 된 소포를 방출합니다. 이러한 OmV는 DNA/RNA, 단백질, 지질 및 펩티도글리칸1,2를포함한 다수의 중요한 생체 분자를 운반함으로써 박테리아와 숙주 뿐만 아니라 세균 세포 간 세포 간 통신에서 중요한 역할을 한다. 특히, 세균발생에 있는 OMV의 역할은 특정 독성 인자 및독소3,4,5,6,7,8,9,10,11에있는 그들의 풍부하게 때문에 광범위하게 연구되고있다.
OMV는 부모 박테리아와 성장 단계에 따라 20~450nm의 크기로 보고되었으며, 여러 종류의 박테리아가 이질적으로 크기의 OMV8,12,13,14를방출하며, 이는 또한 숙주 세포항목(12)의단백질 조성 및 메커니즘과 차이가 있다. H. 파일로리는 직경 이 20~450nm에 이르는 OMV를 출시했으며, 더 작은 OmV는 더 큰 OmV보다 더 균일한 단백질 성분을 함유하고 있습니다. 중요한 것은, OMV의 두 집단은 상이한메커니즘(12)을통해 숙주 세포에 의해 내면화되는 것으로 관찰되었다. 또한, 아그레가티박터 액티노미세템코미티안은 소형(<150nm) OMV의 인구와 함께 대형(>350 nm) OMV의 인구를 방출하고, 옴카는 상당한 양의 분비 단백질 독소, 류코톡신(LtxA)15를함유하고 있음을 입증했다. 세포 프로세스에서 OMV 이질성의 역할은 분명히 중요하지만, 소포의 뚜렷한 인구를 분리하고 분석하는 기술적 어려움은 이러한 연구를 제한했습니다.
세균성 병인증의 중요성 외에도, OMV는 백신 및 약물 전달차량(16,17, 18,19,20)을포함한 다수의 생명공학 적 응용 분야에서 사용하기 위해 제안되었습니다. 이러한 접근 방식에서 번역을 사용하려면 소포의 깨끗하고 단분산 된 준비가 필요합니다. 따라서 효과적이고 효율적인 분리 방법이 필요합니다.
가장 일반적으로, 밀도 그라데이션 원심분리(DGC)는 이질적으로 크기의 소포 집단을 기색 및 분비단백질(21)을포함한 세포 이물질로부터 분리하는 데 사용된다. 이 방법은 또한 이질적으로 크기의 OMV하위집단(12,13,14)을분리하는 접근법으로 보고되었다. 그러나 DGC는 시간이 많이 걸리고 비효율적이며 매우 가변적인 사용자 대사용자(22)이므로 확장에 적합하지 않습니다. 대조적으로,크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 OMV21,23,24를정화하는 확장가능하고 효율적이며 일관된 접근 방식을 나타낸다. 우리는 긴 (50cm), 중력 흐름, SEC 열, 젤 여과 매체로 채워진 효율적으로 정화하고 OMV의 하위 집단을 분리하기에 충분하다는 것을 발견했습니다. 특히, 우리는 A. actinomycetemcomitans OMV를 "큰" 및 "작은" 하위 인구로 분리하고 단백질과 DNA 오염을 제거하기 위하여 이 접근법을 이용했습니다. 정화는 4시간 미만으로 완료되었고, OMV 하위 인구의 완전한 분리와 이물질의 제거가 이루어졌습니다.

<table><tbody><tr><td>1-Step Ultra TMB-ELISA</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 50 kDa 필터</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>ELISA 면역 플레이트</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Thermo Scientific</td><td>T13320</td><td>1.5 x 50 cm</td></tr><tr><td>Glass Econo-Column</td><td>BioRad</td><td>7371552</td><td></td></tr><tr><td>Infinite 200 Pro 플레이트 리더</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0395-500G</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성 무수(KH2PO4)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>피셔 케미컬</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성 무수(Na2HPO4)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0404-500G</td><td></td></tr><tr><td>트리스 베이스</td><td>VWR</td><td>0497-1KG</td><td></td></tr><tr><td>트윈(R) 20</td><td>에이크로스 유기물</td><td>23336-2500</td><td></td></tr></tbody></table>

크기 배제 크로마토그래피는 세균 외부 막 소포 이질성을 분석

Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity

그람 음성 박테리아의 세포벽은 얇은 펩티도글리칸 층으로 분리된 내부(세포질) 및 외부 막(OM)으로 구성됩니다. 성장을 통해 외부 멤브레인은 구형 외부 막 소포 (OMV)를 형성하기 위해 출혈 할 수 있습니다. 이러한 OmV는 호스트 세포에 화물 전달 및 세균 세포와의 통신을 포함한 수많은 세포 기능에 관여합니다. 최근, OMV의 치료 잠재력은 백신 및 약물 전달 차량으로 의 사용을 포함하여 탐구되기 시작했습니다. OMV는 OM에서 파생되지만 OMV의 지질 및 단백질 화물은 OM과 크게 다르다는 것을 오랫동안 인식해 왔습니다. 최근에는 박테리아가 여러 유형의 OMV를 방출할 수 있다는 증거가 발견되었으며, 크기가 숙주 세포에 의한 섭취 메커니즘에 영향을 미칠 수 있다는 증거가 존재합니다. 그러나, 이 지역에 있는 연구는 이질적으로 크기의 OMV를 효율적으로 분리하는 어려움에 의해 제한됩니다. 밀도 그라데이션 원심분리(DGC)는 전통적으로 이러한 목적을 위해 사용되어 왔습니다. 그러나 이 기술은 시간이 많이 걸리고 확장하기가 어렵습니다. 반면 에 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 덜 번거롭고 OMV의 치료 사용을 위해 필요한 미래 확장에 빌려준다. 여기서는 150nm 미만에서 350nm 이상까지 직경범위의 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 테스트 케이스, OmV를 사용하여 이질적으로 크기의 소포를 재현 할 수있는 분리를 가능하게하는 SEC 접근 방식을 설명합니다. 동적 조명 산란(DLS)으로 검증된 "대형"(350nm) OMV 및 "스몰"(<150 nm) OMV의 분리를 시연합니다. 사용 편의성, 재현성(사용자 간 포함) 및 확장 가능성으로 인해 DGC 기반 기법을 통해 이질적으로 크기의 소포를 분리하는 것이 좋습니다.

그림 2에서는 이 메서드의 대표적인 결과를 보여 주어 있습니다. A. actinomycetemcomitans 균주 JP2에 의해 생성된 OMV는 초원심분리기를 사용하여 문화 상류체로부터 먼저 정제되었다15. 우리는 이전에이 균주가 약 300 nm의 직경과 약 100 nm15의직경을 가진 하나, OMV의 두 인구를 생산하는 것을 발견했다. 이러한 OMV 인구를 분리하기 위해 위에서 설명한 SEC 프로토콜을 사용하여 샘플을 정제했습니다. 각 분획은 효소 연계 면역소벤트 분석(ELISA) 또는 면역블롯을 사용하여 리포톨릭 염료 및 독소(LtxA) 함량을 사용하여 지질 함량을 분석하였다. 지질 및 독소 농도는 백분율로 보고되며, 여기서 "%지질"은 샘플의 총 지질 함량의 백분율을 각 분획에 나타내고 "%독소"는 샘플의 총 독소 함량의 백분율을 각 분획에 나타냅니다.
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세균성 소포는 병인에 중요한 역할을 하고 유망한 생명 공학 응용 프로그램이 있습니다. 소포의 이질성은 분석과 사용을 복잡하게 합니다. 따라서 다양한 크기의 소포를 분리하는 간단하고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 여기에서, 우리는 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 이기종 소포를 분리하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 보여줍니다.

The cell wall of Gram-negative bacteria consists of an inner (cytoplasmic) and outer membrane (OM), separated by a thin peptidoglycan layer. Throughout ...

크기 배제 크로마토그래피는 이질적으로 크기의 세균 성 소포의 하위 집단을 분리하고 세균 성 초자연체에서 핵산과 단백질을 제거하기위한 유용한 접근 방식입니다. 크기 배제 크로마토그래피는 밀도 그라데이션 초원심 분리를 포함한 다른 분리 기술보다 저렴하고 빠르며 재현이 가능합니다. 우리는 A.actinomycetemcomitans 소포를 사용하여 이 접근의 잠재력을 보여주었습니다, 그러나 우리는 또한 그밖 이기질 크기의 세균성 소포 인구에 적용될 수 있었다는 것을 예상합니다.모든 버퍼와 비드 솔루션을 제대로 탈착하고 거품을 도입하지 않고 천천히 솔루션을 피펫해야하지만 비드가 건조하지 않고 균일하게 포장 할 만큼 빨리. 먼저 유리 막대를 사용하여 젤 여과 매체의 스톡 병을 혼합하고 컬럼을 채우는 데 필요한 부피를 유리 병에 약 50%의 초과물을 붓습니다. 구슬이 여분의 액체를 정착시키고 데큰란트하도록 허용합니다.용출 버퍼에서 구슬을 약 70% 젤 및 30%의 버퍼로 재연하고 진공 상태에서 용액을 탈가스합니다. 기둥을 수직 위치에 있는 링 스탠드에 장착하고 열을 용해 버퍼로 채우고 벽을 적시고 버퍼를 약 1센티미터만 유지할 때까지 버퍼를 배수합니다. 그런 다음 열 저장소 의 바닥 아래 약 2 센티미터높이로 열이 포장 될 때까지 구슬이 침전되는 것을 방지하기 위해 과도한 버퍼를 배수하면서 젤 구슬을 조심스럽게 열로 피펫합니다.시료를 로드하기 전에 용출 버퍼를 진공 상태에서 탈가스로 변환합니다. 용출 버퍼의 약 2배의 열 부피로 컬럼을 세척합니다. 버퍼가 젤 층의 상단에 도달하면, 조심스럽게 표면을 방해하지 않고 젤 층 위에 리터 외부 멤브레인 소포 샘플 당 100 ~ 200 나노 몰라의 두 밀리리터를 추가하고 샘플이 젤에 들어가게한다.젤 층을 방해하지 않고 컬럼에 용출 버퍼를 천천히 추가하고 컬럼 아래에 50 밀리리터 튜브를 놓습니다. 열이 건조되지 않도록 하려면 동시에 열 상단에 용출 버퍼를 추가합니다. 20 밀리리터의 용루를 수집한 후 컬럼 아래에 1.5 밀리리터 튜브랙을 놓습니다.각 튜브에 총 96 개의 1 밀리 리터 분획을 수집합니다. 샘플을 수집하는 동안 열에 용출 버퍼를 지속적으로 추가합니다. 컬럼을 청소하려면 컬럼을 통해 수산화 나트륨0.1의 열 부피를 한 다음 두 개의 열 볼륨의 용출 버퍼를 실행합니다.지질 농도를 측정하기 위해 각 분획의 파이펫 50 마이크로리터를 96개의 웰 플레이트로 넣습니다. 각 웰에 2.5 마이크로리터의 리포마이트 염료를 넣습니다. 15초 후, 꽃의 강도를 측정합니다.관심 있는 단백질의 농도를 측정하려면 각 분획의 100마이크로리터를 ELISA 면역 플레이트의 개별 우물에 추가합니다. 섭씨 25도에서 3 시간 후, 접시 내용물. 세척 할 때마다 접시를 탈수 하는 세척 당 ELISA 세척 버퍼의 200 마이크로 리터와 함께 접시를 5 번 세척.25°C에서 1시간 동안 각 웰에 200마이크로리터의 블로킹 버퍼를 추가합니다. 인큐베이션의 끝에서, 플레이트를 데킹하고 4섭씨에서 하룻밤 잠복에 대한 버퍼를 차단하는 1차 항체의 마이크로리터를 추가한다. 다음 날, 접시를 데치고 ELISA 세척 버퍼로 접시를 5 번 세척하는 것으로 입증되었습니다.마지막 세척 후, ELISA 세척 버퍼에 이차 항체의 100 마이크로리터를 섭씨 25도에서 1시간 배양에 각각 양립할 수 있습니다. 인큐베이션이 끝나면, 입증된 대로 플레이트를 세척하고 실온에서 15~30분 동안 각 웰에 100마이크로리터의 TMB 용액을 추가합니다. 파란색이 발달하면 각 웰에 50 마이크로리터의 정지 용액을 추가하고 450 나노미터에서 흡광도를 측정합니다.A.actinomycetemcomitans 배양 체퍼넌트의 크기 배제 컬럼 정화 후, 이 균주에 의해 생성된 크고 작은 외부 막 소포에 대응하는 두 개의 뚜렷한 지질 봉우리가 관찰되었다. 샘플 분획의 ELISA 분석은 독소가 주로 큰 외부 막 소포의 하위 집단과 연관되어 있음을 밝혔다. 면역 얼룩 분석은 이 접근이 ELISA 보다는 보다 더 적게 민감하다는 것을 나타내는 유사하지만 더 시끄러운 결과를 주었습니다.관찰된 바와 같이, 이 크로마토그래피 기술은 외부 막 소포의 준비에서 상당한 양의 무료 단백질을 제거할 수 있습니다. 그러나, 총 단백질 농도 반드시 특정 단백질의 농도와 상관 관계가 되지 않습니다 주의 하는 것이 중요 하다. 기둥의 포장 및 실행 중에 거품을 피하고 기둥이 건조되는 것을 방지하는 것이 중요합니다.다이나믹 광 산란, 입자 추적 및 이두산 법은 분리된 외부 멤브레인 소포의 크기 및 기타 특성을 결정하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 수행할 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

출처: Watson, DC, et al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 박테리아 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포(EV)를 분리하기 위해 다공성 수지 비드를 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 방법을 보여줍니다. 더 큰 EV는 수지 기공을 우회하여 조기에 용리되는 반면, 더 작은 단백질은 기공으로 들어가 나중에 용리됩니다.

크기배제 크로마토그래피를 이용한 박테리아 세포외 소포의 분리 

이 비디오에서는 박테리아에서 유래한 외막 소포 또는 OMV의 이질적인 집단을 분리하는 기술(크기 배제 크로마토그래피)을 시연합니다. 이러한 소포는 나노 크기의 구형 구조이며 크기 배제 크로마토그래피를 통해 크기에 따라 크고 작은 하위 모집단으로 분리됩니다.

Size Exclusion Chromatography Based Separation of Bacterial Extracellular Vesicles: A technique to separateing of gram-negative bacterial outer membrane vesicles (박테리아 세포외 소포체의 이질성 집단을 크기에 따라 분리하는 기술)

이 비디오에서는 세제 가용화 후 대장균에서 녹색 형광 단백질(GFP) 융합 막 단백질 안정성을 스크리닝하기 위한 형광 검출 크기 배제 크로마토그래피 기술을 시연합니다. 유리 GFP가 거의 또는 전혀 없는 크기 배제 프로파일에서 대칭적인 피크를 나타내는 단백질은 분해 및 응집이 최소화된 정제된 단백질을 나타내며, 이는 이후에 구조 기능 분석을 위해 선택될 수 있습니다.

Fluorescence-Detection Size-Exclusion Chromatography: A technique to Identify the Integrity of Fluorescent Membrane Proteins on Detergent Solubilization(형광 검출 크기 배제 크로마토그래피: 세제 용해 시 형광 멤브레인 단백질의 무결성을 확인하는 기술)

이 동영상은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis, Mtb)의 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포체(EV)를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 기술을 보여줍니다. 이 기술은 다공성 수지 충전 컬럼을 사용하여 EV의 정제된 분획을 얻습니다. 다공성 입자는 더 작은 단백질이 기공으로 들어가도록 선택적으로 허용하여 용리 속도를 늦춥니다. 동시에 EV는 크기가 크기 때문에 모공으로 들어가는 것이 배제되고 먼저 용출됩니다.

Mycobacterial Extracellular Vesicles를 정제하기 위한 크기 배제 크로마토그래피 기술

박테리아는 생리 활성 생물학적 분자를 운반하는 나노 미터 크기의 세포 외 소포 (EV)를 분비합니다. EV 연구는 생물 발생, 미생물-미생물 및 숙주-미생물 상호 작용 및 질병에서의 역할, 잠재적 인 치료 응용 프로그램을 이해하는 데 중점을 둡니다. EV 연구의 표준화를 촉진하기 위해 다양한 박테리아로부터 EV를 확장 가능한 분리를 위한 워크플로우가 제시됩니다.

대장균 및 다른 박테리아로부터의 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제

본 프로토콜은 시아노박테리아 배양물로부터의 세포밖 소포의 분리, 농도 및 특성화에 대한 상세한 설명을 제공한다. 서로 다른 규모의 문화에서 소포를 정화하기위한 접근법, 방법론 간의 절충점 및 현장 샘플 작업을위한 고려 사항도 논의됩니다.

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

여기서 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 세포외 소포가 컨디셔닝 세포 배양 배지로부터 적절하게 분리될 수 있음을 보여줍니다.

조절된 세포 배양 배지에서 세포외 소포를 분리하기 위한 크기 배제 크로마토그래피

이 프로토콜은 크기 배제 크로마토그래피, 배양 상청액으로부터 Mycobacterium tuberculosis 세포밖 소포를 풍부하게하기 위한 용이하고 재현 가능한 기술을 기술한다.

마이코박테리움 결핵 크기 배제 크로마토그래피를 통한 세포밖 소포 농축

세포외 소포체는 생물의학 응용 분야에 엄청난 가능성을 가지고 있지만, 현재의 분리 방법은 시간이 많이 걸리고 임상적으로 사용하기에는 비실용적입니다. 이 연구에서는 최소한의 단계로 연속적으로 많은 양의 생체 유체에서 세포외 소포체를 직접 분리할 수 있는 미세유체 장치를 제시합니다.

분기된 A4F 미세유체 장치를 사용한 대용량 시료에서 세포외 소포의 단일 단계 분리

이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

배우세요 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 Aggregatibacter actinomycetemcomitans의 세균 외부 막 소포 이질성을 분석하는 방법입니다. 이 기술은 초원심분리보다 빠르고 재현성이 높아 미생물학 연구에 유용합니다.

크기 배제 크로마토그래피는 세균 외부 막 소포 이질성을 분석

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