Name: 마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: 배우세요 종양 이식을 통해 마우스 종양 침윤 CD8+ T 세포의 역학을 분석하는 방법을. B16F10-OVA 모델에서 면역세포 추적 및 유세포분석 기법으로 항종양 면역 반응을 연구합니다.

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이 연구는 저명한 젊은 학자를위한 국립 자연 과학 기금 (31825011 번에서 LY)과 중국 국립 자연 과학 재단 (QH에 31900643 번, ZW에 31900656 번)의 보조금으로 지원되었습니다.

<ol><li>Blank, C. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+%27T+cell+exhaustion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Defining 'T cell exhaustion.</a> Nature Reviews Immunology. 19 (11), 665-674 (2019).</li>
<li>Leko, V., Rosenberg, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+targeting+human+tumor+antigens+for+T+cell-based+immunotherapy+of+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Identifying and targeting human tumor antigens for T cell-based immunotherapy of solid tumors.</a> Cancer Cell. 38 (4), 454-472 (2020).</li>
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<li>Davis, M. M., Brodin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebooting+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Rebooting human immunology.</a> Annual Review of Immunology. 36, 843-864 (2018).</li>
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<li>Littman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Releasing+the+brakes+on+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Releasing the brakes on cancer immunotherapy.</a> Cell. 373 (16), 1490-1492 (2015).</li>
<li>Verma, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1+blockade+in+subprimed+CD8+cells+induces+dysfunctional+PD-1%28%2B%29CD38%28hi%29+cells+and+anti-PD-1+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">PD-1 blockade in subprimed CD8 cells induces dysfunctional PD-1(+)CD38(hi) cells and anti-PD-1 resistance.</a> Nature Immunology. 20, 1231-1243 (2019).</li>
<li>Hashimoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+T+cell+exhaustion+in+chronic+infection+and+cancer%3A+opportunities+for+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD8 T cell exhaustion in chronic infection and cancer: opportunities for interventions.</a> Annual Review of Medicine. 69, 301-318 (2018).</li>
<li>Dammeijer, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PD-1%2FPD-L1-checkpoint+restrains+T+cell+immunity+in+tumor-draining+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The PD-1/PD-L1-checkpoint restrains T cell immunity in tumor-draining lymph nodes.</a> Cancer Cell. 38 (5), 685-700 (2020).</li>
<li>Buchwald, Z. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-draining+lymph+node+is+important+for+a+robust+abscopal+effect+stimulated+by+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+for+ImmunoTherapy+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumor-draining lymph node is important for a robust abscopal effect stimulated by radiotherapy.</a> Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 8 (2), 000867(2020).</li>
<li>Philip, M., Schietinger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+fate+choice%3A+T+cell+exhaustion+in+cancer+and+chronic+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and fate choice: T cell exhaustion in cancer and chronic infections.</a> Current Opinion in Immunology. 58, 98-103 (2019).</li>
<li>Miller, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subsets+of+exhausted+CD8%28%2B%29+T+cells+differentially+mediate+tumor+control+and+respond+to+checkpoint+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Subsets of exhausted CD8(+) T cells differentially mediate tumor control and respond to checkpoint blockade.</a> Nature Immunology. 20, 326-336 (2019).</li>
<li>Wu, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+T+cell+expansion+predicts+tumour+infiltration+and+clinical+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Peripheral T cell expansion predicts tumour infiltration and clinical response.</a> Nature. 579, 274-278 (2020).</li>
<li>Im, S. J., Konieczny, B. T., Hudson, W. H., Masopust, D., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PD-1%2B+stemlike+CD8+T+cells+are+resident+in+lymphoid+tissues+during+persistent+LCMV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+State+of+America%22%5BJournal%5D)">PD-1+ stemlike CD8 T cells are resident in lymphoid tissues during persistent LCMV infection.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 117 (8), 4292-4299 (2020).</li>
<li>Beltra, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+relationships+of+four+exhausted+CD8%28%2B%29+T+cell+subsets+reveals+underlying+transcriptional+and+epigenetic+landscape+control+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms.</a> Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).</li>
<li>Myers, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+subset+of+CD8%28%2B%29+T+cells+during+chronic+exhaustion+is+defined+by+SIRPalpha+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A functional subset of CD8(+) T cells during chronic exhaustion is defined by SIRPalpha expression.</a> Nature Communications. 10 (1), 794(2019).</li>
<li>Jansen, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+intra-tumoral+niche+maintains+and+differentiates+stem-like+CD8+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An intra-tumoral niche maintains and differentiates stem-like CD8 T cells.</a> Nature. 576, 465-470 (2019).</li>
<li>Jadhav, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+signature+of+PD-1%2B+TCF1%2B+CD8+T+cells+that+act+as+resource+cells+during+chronic+viral+infection+and+respond+to+PD-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+State+of+America%22%5BJournal%5D)">Epigenetic signature of PD-1+ TCF1+ CD8 T cells that act as resource cells during chronic viral infection and respond to PD-1 blockade.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United State of America. 116 (28), 14113-14118 (2019).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+CD8+T+cells+form+a+proliferative%2C+dynamically+regulated+compartment+within+human+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional CD8 T cells form a proliferative, dynamically regulated compartment within human melanoma.</a> Cell. 176 (4), 775-789 (2018).</li>
<li>Kurtulus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoint+blockade+immunotherapy+induces+dynamic+changes+in+PD-1%28-%29CD8%28%2B%29+tumor-infiltrating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Checkpoint blockade immunotherapy induces dynamic changes in PD-1(-)CD8(+) tumor-infiltrating T cells.</a> Immunity. 50 (1), 181-194 (2019).</li>
<li>Fransen, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-draining+lymph+nodes+are+pivotal+in+PD-1%2FPD-L1+checkpoint+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Tumor-draining lymph nodes are pivotal in PD-1/PD-L1 checkpoint therapy.</a> JCI Insight. 3 (23), 124507(2018).</li>
<li>E, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29CXCR5%28%2B%29+T+cells+in+tumor-draining+lymph+nodes+are+highly+activated+and+predict+better+prognosis+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD8(+)CXCR5(+) T cells in tumor-draining lymph nodes are highly activated and predict better prognosis in colorectal cancer.</a> Human Immunology. 79 (6), 446-452 (2018).</li>
<li>Snell, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8%28%2B%29+T+cell+priming+in+established+chronic+viral+infection+preferentially+directs+differentiation+of+memory-like+cells+for+sustained+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">CD8(+) T cell priming in established chronic viral infection preferentially directs differentiation of memory-like cells for sustained immunity.</a> Immunity. 49 (4), 678-694 (2018).</li>
<li>Siddiqui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumoral+Tcf1%28%2B%29PD-1%28%2B%29CD8%28%2B%29+T+cells+with+stem-like+properties+promote+tumor+control+in+response+to+vaccination+and+checkpoint+blockade+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Intratumoral Tcf1(+)PD-1(+)CD8(+) T cells with stem-like properties promote tumor control in response to vaccination and checkpoint blockade immunotherapy.</a> Immunity. 50 (1), 195-211 (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+TCF1+preserves+the+effector+function+of+exhausted+CD8+T+cells+during+chronic+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The transcription factor TCF1 preserves the effector function of exhausted CD8 T cells during chronic viral infection.</a> Frontiers in Immunology. 10, 169(2019).</li>
<li>Krishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-like+CD8+T+cells+mediate+response+of+adoptive+cell+immunotherapy+against+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem-like CD8 T cells mediate response of adoptive cell immunotherapy against human cancer.</a> Science. 370 (6522), 1328-1334 (2020).</li>
<li>Yost, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+replacement+of+tumor-specific+T+cells+following+PD-1+blockade%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clonal replacement of tumor-specific T cells following PD-1 blockade.</a> Nature Medicine. 25, 1251-1259 (2019).</li>
<li>Zitvogel, L., Pitt, J. M., Daillere, R., Smyth, M. J., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+oncoimmunology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Mouse models in oncoimmunology.</a> Nature Reviews Cancer. 16 (12), 759-773 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl6+preserves+the+suppressive+function+of+regulatory+T+cells+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Bcl6 preserves the suppressive function of regulatory T cells during tumorigenesis.</a> Frontiers in Immunology. 11, 806(2020).</li>
<li>Yu, D., Ye, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+portrait+of+CXCR5%28%2B%29+follicular+cytotoxic+CD8%28%2B%29+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">A portrait of CXCR5(+) follicular cytotoxic CD8(+) T cells.</a> Trends in Immunology. 39 (12), 965-979 (2018).</li>
<li>Bracci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide+enhances+the+antitumor+efficacy+of+adoptively+transferred+immune+cells+through+the+induction+of+cytokine+expression%2C+B-cell+and+T-cell+homeostatic+proliferation%2C+and+specific+tumor+infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide enhances the antitumor efficacy of adoptively transferred immune cells through the induction of cytokine expression, B-cell and T-cell homeostatic proliferation, and specific tumor infiltration.</a> Clinical Cancer Research. 13 (2), 644-653 (2007).</li>
<li>Salem, M. L., El-Naggar, S. A., Mahmoud, H. A., Elgharabawy, R. M., Bader, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclophosphamide+eradicates+murine+immunogenic+tumor+coding+for+a+non-self-antigen+and+induces+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Immunopathology+and+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Cyclophosphamide eradicates murine immunogenic tumor coding for a non-self-antigen and induces antitumor immunity.</a> International Journal of Immunopathology and Pharmacology. 32, 1-5 (2018).</li>
<li>Thorsson, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Immune+landscape+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The Immune landscape of cancer.</a> Immunity. 48 (4), 812-830 (2018).</li>
</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

T 세포 매개 면역은 종양에 대한 면역 반응에 중요한 역할을하며, CTL은 암 세포를 근절하는 데 주도적 인 역할을합니다. 그러나, TME 내의 종양 항원-특이적 CTLs의 기원은 해명되지 않았다(30). 이러한 종양 이식 프로토콜의 사용은 종양내 항원-특이적 CD8+ T 세포가 줄기-유사 TCF1+ 전구 CD8+ T 세포의 존재에도 불구하고 오랫동안 지속되지 않을 수 있다는 중요한 단서를 제공하였다. 주목할 만하게, 종양 덩어리 내로의 주변부 유래 종양 특이적 CD8+ T 세포의 지속적인 유입이 존재한다.
우리의 지식에 따르면, 이것은 TME 내의 항원 특이적 CD8+ T 세포의 유지가 종양 상주 TIL의 자기 재생 대신에 주위 유래 종양 특이적 CD8+ T 세포의 보충에 주로 의존한다는 것을 확인하는 비교적 편리하고 ...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.
Step 6.10 of the Protocol was updated from:
Administer penicillin every 8-12 h after the surgery for 3 days. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The administration of buprenorphine is suggested to prevent post-surgical pain [delete sentence]. The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.
to:
Administer buprenorphine subcutaneously at a dose of 0.1 mg/kg body weight every 8 h three times after surgery to alleviate the pain. Monitor the mouse&#39;s eating, drinking, moving, and the area operated on. Return the transplant recipient to the company of other animals only after it has fully recovered. 
NOTE: The mouse typically recovers from the trauma of the surgery within 3 days. If the mouse is not back to normal feeding and mobility and shows any manifestations of infection, consult a veterinarian for interventions or euthanize it.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62442">Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+&#160;T Cells in Mice</a>. The Protocol&#160;was&#160;updated.

Erratum: Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

CD8+ T 세포-매개 면역 반응은 종양 성장을 조절하는데 중추적인 역할을 한다. 종양 생성 동안, 나이브 CD8+ T 세포는 MHC 클래스 I-제한 방식으로 항원 인식시 활성화되고, 이어서 이펙터 세포로 분화되고 종양 질량 1,2로 침윤된다. 그러나, 종양 미세환경(TME) 내에서, 장기간의 항원 노출, 뿐만 아니라 면역억제 인자는, 침윤된 종양 특이적 CD8+ T 세포를 "고갈"3으로 알려진 저반응 상태로 유도한다. 고갈된 T 세포 (Tex)는 급성 바이러스 감염에서 생성된 이펙터 또는 기억 T 세포와 구별되며, 전사적으로 및 후성유전학적으로 둘 다이다. 이들 텍스 세포는 주로 일련의 억제 수용체의 지속적이고 상승된 발현뿐만 아니라 이펙터 기능의 계층적 손실을 특징으로 한다. 또한, 소진된 CD8+ T 세포의 손상된 증식 능력은 종양 특이적 T 세포의 수의 감소를 초래하여, TME 내의 잔류 CD8+ T 세포가 종양 진행에 대해 충분한 보호 면역을 간신히 제공할 수 있다3. 따라서, 종양내 항원-특이적 CD8+ T 세포의 유지 또는 강화는 종양 억제에 필수적이다.
더욱이, 면역 체크포인트 봉쇄 (ICB) 요법은 T 세포 침윤을 증가시킴으로써 종양에서 텍스를 다시 활성화시키고, 따라서, T 세포 수 및 회춘 T 세포 기능을 활성화시켜 종양 억제를 증진시키는 것으로 여겨진다. ICB 치료의 광범위한 적용은 암 치료 환경을 변화시켰으며, 환자의 상당 부분이 내구성 있는 반응을 경험하고있다 4,5,6. 그럼에도 불구하고, 대부분의 환자와 암 유형은 ICB에 일시적으로 반응하지 않거나 단지 일시적으로 반응한다. TME에서의 부적절한 T 세포 침윤은 ICB 내성 7,8을 차지하는 근본적인 메카니즘 중 하나로 가정되었다.
 몇몇 연구는 환자 및 마우스 모델 9,10,11,12 모두에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포 (TILs)의 이질성을 입증하였다. 종양 덩어리에서 T 세포 인자-1 (TCF1)을 발현하는 CD8+ T 세포의 서브세트가 줄기 세포 유사 특성을 나타내는 것으로 확인되었으며, 이는 말기 소모 된 T 세포를 더 일으킬 수 있으며 ICB 치료 후 증식 파열을 담당합니다 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22년. 그러나, 항원 특이적 TCF1+CD8+ T 세포의 단지 작은 비율만이 TME에 존재하고, ICB23,24,25,26에 반응하여 분화된 자손의 확장된 풀을 생성한다는 것이 입증되었다. 이 집단의 제한된 크기가 종양 진행을 조절하기 위해 세포독성 T 림프구 (CTLs)의 지속성을 보장하기에 충분한지 여부는 알려지지 않았으며, 주변 조직으로부터 보충이 있는지 여부는 추가 조사가 필요하다. 더욱이, 최근의 연구는 기존의 종양 특이적 T 세포의 불충분한 활성화 능력 및 항프로그램된 세포 사멸 단백질 1 처리 후에 신규한, 이전에 존재하지 않는 클론형의 출현을 시사한다. 이는 체크포인트 차단에 대한 T 세포 반응이 T 세포 클론(27)의 별개의 레퍼토리의 새로운 유입에 기인할 수 있음을 나타낸다. TME에서 방관자 비종양 반응성 세포독성 T 세포 분획의 존재와 함께, 이러한 발견은 주변부 유래 CD8+ T 세포11의 역할을 연구하기 위한 종양 동종이식편 모델의 확립을 촉발시켰다.
지금까지, 여러 종류의 종양 이식뿐만 아니라 면역 세포 입양 전달이 종양 면역학28 분야에서 널리 사용되어 왔다. TILs, 말초 혈액 단핵 세포, 및 종양-반응성 면역 세포는 다른 조직으로부터 기원된 이들 방법을 사용하여 잘 특성화될 수 있다. 그러나, 전신 및 국소 항종양 면역 사이의 상호작용을 연구할 때, 이들 모델은 주변부와 TME로부터 유래된 면역 세포 사이의 상호작용을 조사하기에 부적합한 것으로 보인다. 여기서, 종양 조직을 공여자로부터 종양 매칭 수용자 마우스로 이식하여 수용자 유래 면역 세포의 유입을 정확하게 추적하고 TME에서 공여체 유래 세포를 동시에 관찰하였다.
본 연구에서, 대리 신항원 난알부민을 안정적으로 발현하는 B16F10-OVA 흑색종 세포주와 함께 흑색종의 뮤린 신생 모델이 확립되었다. CD8+ T 세포의 90% 이상이 클래스 I MHC 분자 H2-Kb에 결합된 OVA 유래 펩티드 OVA257-264(SIINFEKL)를 특이적으로 인식하는 TCR 트랜스제닉 OT-I 마우스는 B16F10-OVA 종양 모델에서 개발된 항원 특이적 T 세포 반응의 연구를 가능하게 한다. 이 모델을 종양 이식과 결합하여, 종양-고유 및 주변-기원 항원-특이적 CD8+ T 세포의 면역 반응을 비교하여, 이들 두 집단 사이의 동적 전이를 드러냈다. 총체적으로, 이 실험 설계는 TME에서 CD8+ T 세포의 면역 반응을 정밀하게 조사하기 위한 또 다른 접근법을 제공하였고, 이는 TME에서 종양 특이적 T 세포 면역 반응의 역학에 대한 새로운 빛을 발산한다.

<table><tbody><tr><td>0.22 &무; m 필터</td><td>Millipore</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>1mL 투베르쿨린 주사기</td><td>KDL</td><td>BB000925</td><td></td></tr><tr><td>1.5mL 원심분리기 튜브</td><td>KIRGEN</td><td>KG2211</td><td></td></tr><tr><td>100 U 인슐린 주사기</td><td>BD Biosciences</td><td>320310</td><td></td></tr><tr><td>15mL 원추형 튜브</td><td>BEAVER</td><td>43008</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol (Avertin)</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>2- 메틸 -2- 부탄올</td><td>시그마</td><td>240486-100ML</td><td></td></tr><tr><td>70 & m 나일론 세포 여과기</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>APC 안티 마우스 CD45.1</td><td>BioLegend</td><td>110714</td><td>클론 : A20</td></tr><tr><td>B16F10-OVA 세포주</td><td>bluefbio</td><td>BFN607200447</td><td></td></tr><tr><td>BSA-V (소 혈청 알부민)</td><td>Bioss</td><td>bs-0292P</td><td></td></tr><tr><td>BV421 마우스 안티 마우스 CD45.2</td><td>BD Horizon</td><td>562895</td><td>클론 : 104</td></tr><tr><td>세포 배양 접시</td><td>BEAVER</td><td>43701/43702/43703</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5810R-A462/5424R</td><td></td></tr><tr><td>cyclophosphamide</td><td>Sigma</td><td>C0768-25G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco의 Modified Eagle Medium</td><td>Gibco C11995500BT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EasySep 마우스 CD8+ T 세포 분리 키트</td><td>Stemcell Technologies</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>EDS-500g</td><td></td></tr><tr><td>FACS 튜브</td><td>BD Falcon</td><td>352052</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>유세포 분석기</td><td>BD</td><td>FACSCanto II</td><td></td></tr><tr><td>혈구계</td><td>PorLab Scientific</td><td>HM330</td><td></td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>RWD 생명 과학</td><td>R510-22-16</td><td></td></tr><tr><td>KHCO3 </td><td>Sangon Biotech</td><td>A501195-0500</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD 고정 가능한 근적외선 데드 셀 염색 키트, 633 또는 635nm 여기용</td><td>Life Technologies</td><td>L10199</td><td></td></tr><tr><td>바늘 캐리어</td><td>RWD Life Science</td><td>F31034-14</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501569-0500</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Beyotime</td><td>P0099-500ml</td><td></td></tr><tr><td>PE 안티 마우스 TCR V &alpha; 2</td><td>BioLegend</td><td>127808</td><td>클론:B20.1</td></tr><tr><td>펜 스트렙 글루타민(100x)</td><td>Gibco</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>PerCP/Cy5.5 안티 마우스 CD8a</td><td>BioLegend</td><td>100734</td><td>클론:53-6.7</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma</td><td>R8758-500ML</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>시그마</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>수술용 겸자</td><td>RWD 생명 과학</td><td>F12005-10</td><td></td></tr><tr><td>외과 용 가위</td><td>RWD 생명 과학</td><td>S12003-09</td><td></td></tr><tr><td>봉합사</td><td>스레드 RWD 생명 과학</td><td>F34004-30</td><td></td></tr><tr><td>트립신 - EDTA</td><td>시그마</td><td>T4049-100ml</td><td></td></tr></tbody></table>

마우스에서 종양 침윤성 cd8+ t 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

Tumor Transplantation for Assessing the Dynamics of Tumor-Infiltrating CD8+ T Cells in Mice

T 세포 매개 면역은 종양에 대한 면역 반응에 중요한 역할을하며, 세포독성 T 림프구 (CTLs)는 암 세포를 근절하는 데 주도적 인 역할을합니다. 그러나, 종양 미세환경(TME) 내의 종양 항원-특이적 CD8+ T 세포의 기원 및 보충은 모호한 채로 남아있다. 이 프로토콜은 대리 신항원, 난알부민 (OVA) 및 TCR 트랜스제닉 OT-I 마우스를 안정적으로 발현하는 B16F10-OVA 흑색종 세포주를 채용하며, 여기서 CD8+ T 세포의 90% 이상이 클래스 I 주조직 적합성 복합체 (MHC) 분자 H2-Kb에 결합된 OVA 유래 펩티드 OVA 257-264 (SIINFEKL)를 특이적으로 인식한다. 이러한 특징들은 종양발생 동안 항원-특이적 T 세포 반응의 연구를 가능하게 한다.
이 모델을 종양 이식 수술과 결합하여, 기증자의 종양 조직을 종양과 일치하는 합성 수용자 마우스에 이식하여 이식된 기증자 조직으로의 수용자 유래 면역 세포의 유입을 정확하게 추적하여, 종양 고유 및 주변부 기원 항원 특이적 CD8+ 의 면역 반응을 분석할 수 있게 하였다. T 세포. 이 두 집단 사이에서 역동적 인 전환이 일어나는 것으로 나타났습니다. 총체적으로,이 실험 설계는 TME에서 CD8+ T 세포의 면역 반응을 정확하게 조사하기위한 또 다른 접근법을 제공했으며, 이는 종양 면역학에 대한 새로운 빛을 비출 것입니다.

이 프로토콜의 회로도는 그림 1에 나와 있습니다. 종양 접종 8일 후, CD45.1+ 및 CD45.1+CD45.2+ OT-I 세포를 B16F10-OVA 종양 보유 C57BL/6 마우스에 주사하였다. 종양을 이식 후 8일째에 CD45.1+ OT-I 세포 이식 마우스(공여자)로부터 외과적으로 해부하고, 이식된 종양과 동일한 쪽의 등쪽 옆구리에 종양-매칭된 CD45.1+CD45.2+ OT-I 세포 이식된 마우스(수용자)에 이식하였다. 유세포 분석기(도 2에 도시된 게이팅 전략) 분석을 통해, CD44+CD8+ 종양 항원-특이적 T 세포의 2개 집단은 CD45.1+ 공여자 유래 및 CD45.1+CD45.2+ 수용자 유래 TIL을 포함하는...

여기에서, 마우스 종양 모델에서 종양 내재 및 주변부 유래 종양 침윤된 림프구의 특성화를 위한 종양 이식 프로토콜을 제시한다. 유세포 분석기를 사용한 수용자 유래 면역 세포의 유입에 대한 특이적 추적은 항종양 면역 반응 동안 이들 세포의 표현형 및 기능적 변화의 역학을 드러낸다.

마우스에서 종양 침윤성 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

T cell-mediated immunity plays a crucial role in immune responses against tumors, with cytotoxic T lymphocytes (CTLs) playing the leading role in ...

이 방법은 말초 조직에서 종양 특이 면역 세포의 보충이 있는지 여부, 종양 미세 환경 내에서 새로 침윤 된 면역 세포와 이미 존재하는 면역 세포 간의 전이 및 면역 요법에 대한 반응을 포함하여 종양 면역학의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 종양 침윤된 면역 세포로부터 주변부 유래 세포를 구별하고 종방향 분석에서 이들 세포의 동적, 페노티픽 및 기능적 변화를 추적하기 위해 편리하고 따라하기 쉬운 기술이다. 먼저 제조된 B16F10-OVA 세포 현탁액 100 마이크로리터를 1 mL 투베르쿨린 주사기 내로 인출한다.배럴을 탭하여 거품을 위쪽으로 이동시키고 플런저를 부드럽게 밀어 기포를 제거합니다. 마우스를 제지하여 복부를 노출시킵니다. 새끼 손가락으로 왼쪽 뒷다리를 눌러 왼쪽 사타구니 부위의 피부를 조입니다.전기 면도기로 왼쪽 하복부에서 마우스의 머리카락을 제거하십시오. 75 % 에탄올에 적신 면화를 사용하여 왼쪽 복부의 후부 사분면을 청소하십시오. 주사기를 0도에서 15도 사이의 얕은 각도로 잡고 바늘의 경사가 위쪽을 향하게하여 왼쪽 위 허벅지 측면에 삽입하십시오.바늘을 0.5 ~ 1 센티미터로 피하 조직을 통해 사타구니 영역으로 밀어 넣으십시오. 주입하기 전에 플런저를 뒤로 당깁니다. 음압이있는 경우 플런저를 완전히 누르고 서브 큐티스에 작은 유체 주머니 또는 볼루스가 형성되는 것을 관찰하십시오.주사가 수행 된 후 바늘을 제거하십시오. 마우스를 떼어 케이지에 다시 넣습니다. B16F10-OVA 이식 후 6일째 내지 여덟 일째에, 버니어 스케일로 종양 크기를 측정한다.대략 세 밀리미터 직경 또는 녹두 크기의 종양을 가진 마우스를 선택하고 동등하고 무작위로 두 그룹으로 나눕니다. 200 마이크로리터의 OT-1 세포 현탁액을 100 유닛 29 게이지 인슐린 주사기로 회수하고 기포를 제거하십시오. 마우스를 케이지에 별도로 놓고 새장 위에 적외선 램프를 두어 5 ~ 10 분 동안 꼬리 정맥을 확장시킵니다.적절한 크기의 억제 장치로 마우스를 고정시킵니다. 꼬리를 잡고 곧게 펴고 75 % 에탄올을 뿌려 정맥을 보이게하십시오. 주사기를 정맥에 평행하게 잡고 0 ~ 15도 각도로 정맥에 삽입하십시오.플런저를 약간 뒤로 당기고 혈액이 배럴에 들어가면 천천히 그리고 꾸준히 분당 한 밀리리터 이하의 속도로 현탁액을 주입하십시오. 주사가 완료된 후, 주사기를 제거하고 주사 부위를 삼 ~ 다섯 초 동안 부드럽게 눌러

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Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

종양 세포 - T 세포 상호 작용의 분석을 위해 실험적인 폐 전이와 CTL immunotherapy 마우스...

실험 전이 및 CTL 입양 전송 Immunotherapy 마우스 모델

이 프로토콜은 마우스 종양 모델에서 종양 미세환경 내의 백혈구 하위 집합을 자세히 평가하는 방법을 설명합니다. Chemerin-발현 B16 흑색종 세포를 syngeneic 마우스에 피하로 이식했습니다. 그런 다음 종양 미세환경의 세포를 염색하고 유세포 분석으로 분석하여 상세한 백혈구 부분 집합 분석을 가능하게 했습니다.

피하 종양 모델에서 종양 침투 백혈구 하위 집합의 평가

종양 microenvironment 공부 immunotherapy 임상 응답의 전조 또는 예측 생체를 식별할 수 있습니다. 여기에 제시, 혁신적인 방법을 기반으로 현장에서 형광 multispectral 이미징 분석 하 고 CD8의 자동으로 다양 한 부분 모집단을 계산+ T 세포. 이 재현 하 고 신뢰할 수 있는 기술은 대형 코 호트 분석에 적합 합니다.

면역 형광 분석 및 Intratumoral+ PD-1 팀-3+ CD8의 정량화를 다중화+ T 세포

여기, 선물이 orthotopic 인간의 기본 뇌 종양을 들고 immunodeficient 마우스에 준비 및 수용자 인간 림프 톨의 stereotaxic 관리에 대 한 프로토콜. 이 연구는 타당성과 세포 immunotherapies intrabrain 전달의 antitumor 효능에 대 한-의 증거-개념을 제공합니다.

정위 적 입양 전송 Orthotopic 인간 세포종 님 Xenografts Murine 모델에서 세포 독성 면역 세포의

여기의 미리 활성화 CD8 세포 독성을 조사 하는 프로토콜 설명 apoptotic 암 세포를 통해 실시간으로 현미경을 감지 하 여 암 세포에 대 한+ T 세포. 이 프로토콜 골수성 세포 유도 된 T 세포 억제 뒤에 메커니즘을 조사 하 고 면역 진압 골수성 세포의 봉쇄를 통해 T 세포를 보충 하기 위한 화합물을 평가할 수 있습니다.

실시간 탐지의 체 외 종양 세포 Apoptosis에 CD8에 의해 유도 된+ T 세포 종양 침투 골수성 세포의 면역 진압 기능 연구

여기에서는 종양 항 원에 대 한 세포 독성 T 림프 구 (CTL) 반응에서 면역 우세의 검사를 가능 하 게 하는 유 세포 분석 기반의 생체 사 멸 분석 법을 설명 한다. 이 우아한 분석을 기계 론 적 연구와 약물 효능 테스트에 사용 하는 방법의 예를 제공 합니다.

종양 특이 CD8+ T 세포 반응에서 면역 우세를 연구 하기 위한 생체 내 세포 독성 분석 법

이 프로토콜은 정형 외과 췌장 종양의 외과 생성 및 갓 단송된 뮤린 췌장 종양의 급속한 소화를 기술합니다. 소화 후, 실행 가능한 면역 세포 집단은 유세포 세포 분석에 의한 세포내 사이토카인 검출을 위한 T 세포의 생체내 자극을 포함하는 추가하류 분석을 위해 사용될 수 있다.

종양 침투 T 세포 독성의 정형 외 췌장 종양 및 Ex 생체 특성의 생성

이 프로토콜은 Flt3L 발현 B16-F10 흑색종으로 세포 기반 종양 백신 접종을 사용하는 암 면역 요법 모델을 제시합니다. 이 프로토콜은 배양된 종양 세포의 준비, 종양 이식, 세포 조사, 종양 성장 측정, 종양내 면역 세포의 분리 및 유세포 분석을 포함한 절차를 보여줍니다.

조혈 사이토카인을 사용한 종양 백신 접종을 이용한 실험적 흑색종 면역요법 모델

여기에 제시된 실험 설계는 림프절(LN) 전이 중 항원 특이적 CD8+ T 세포 연구에 유용한 생식 모델을 제공하며, 이는 방관자 CD8+ T 세포의 섭동을 배제합니다.

종양 형성 중 항원 특이적 CD8+ T 세포의 역학을 평가하기 위한 배액 림프절 전이 모델

우리는 양자 세포 전달을 위해 유세포 분석을 통해 마우스의 종양 침윤 림프구(TIL)를 활용하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 syngeneic pancreatic cancer 마우스 모델에서 종양에 대한 TIL의 특정 세포 독성을 검증하여 췌장암에 대한 입양 세포 요법 개발에 대한 통찰력을 제공하는 것을 목표로 합니다.

췌장암의 마우스 모델에서 종양 침윤 림프구의 유세포 분석 기반 분리 및 치료 평가

종양 내 면역치료에 대한 관심이 높아짐에 따라, 접근 가능하고 실용적인 종양 모델을 선택하는 것이 필수적입니다. 피하 종양은 쉽게 진단할 수 있지만, 시각화하고 조작하는 것은 어렵습니다. 이 프로토콜에서는 가시성과 접근성을 높이는 피내종양을 생성하는 방법을 설명합니다.

생쥐암 종양 내 면역치료 연구의 강력한 모델로서의 피내종양 이식

배우세요 종양 이식을 통해 마우스 종양 침윤 CD8+ T 세포의 역학을 분석하는 방법을. B16F10-OVA 모델에서 면역세포 추적 및 유세포분석 기법으로 항종양 면역 반응을 연구합니다.

마우스에서 종양 침윤성 CD8⁺ T 세포의 역학을 평가하기 위한 종양 이식

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