Name: 제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 배우세요 제브라피쉬에서 비침습적 공초점 현미경을 이용하여 NASH 관련 간세포암의 간 미세환경과 면역세포 동태를 실시간 분석하는 방법입니다. 이 프로토콜은 Danio rerio의 광학적 투명성을 활용하여 간암 발생 초기의 면역세포 침윤과 혈관신생 변화를 정량화합니다.

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저자는 알버트 아인슈타인 의과 대학 제브라피쉬 핵심 시설 기술자인 클린턴 드파올로와 스파르타크 칼리닌이 제브라피쉬 라인의 지원과 유지 보수에 대해 감사를 표하고 싶습니다. FJMN은 Cancer Research Institute와 Fibrolamellar Cancer Foundation의 지원을 받고 있습니다.

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<li>Evason, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+chemical+inhibitors+of+beta-catenin-driven+liver+tumorigenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification of chemical inhibitors of beta-catenin-driven liver tumorigenesis in zebrafish.</a> PLoS Genetics. 11 (7), 1005305(2015).</li>
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<li>Park, K. H., Ye, Z. W., Zhang, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid-enriched+diet+induces+hepatic+steatosis+and+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid-enriched diet induces hepatic steatosis and injury in adult zebrafish.</a> Zebrafish. 16 (6), 497-504 (2019).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

간세포 암종, 특히 NASH 유발 간세포 암종의 발생률이 증가함에 따라 NASH 관련 간세포 암종과 관련된 세포 및 분자 메커니즘을 연구하기 위해보다 효율적인 모델을 갖는 것이 매우 중요합니다. 간에서 세포-세포 상호 작용의 디콘볼루션은 간 질환 진행과 간세포 생성을 더 잘 이해하는 데 중요합니다. 이 프로토콜에 설명 된 접근법은 생체 내 및 비 침습적으로 간 질환 진행을 분석하는 독특한 방법을 제공합니다.
식이 준비는 NASH 관련 간세포 암종 모델을 성공적으로 확립하는 데 중요합니다. 제브라 피쉬를위한 식단을 준비하는 동안 유해한 영향을 피하기 위해 디 에틸 에테르가 흄 후드 내부에서 완전히 증발하도록하는 것이 중요합니다. 유충과 함께 이러한 식단을 사용하려면 (수정 후 5-12 일), 유충의 음식 섭취를 보장하기 위해 식단을 미세 입자로 분쇄하는 것이 매우 중요합니다. 형광 태그가 붙은 지방산 유사체의 사용은 유충의 음식 섭취를 평가하는 데 사용될 수 있습니다.
유충을 번식 상자에 넣고 먹이 절차를 시작하기 전에 다른 플레이트의 유충을 혼합하여 실험 샘플링을 균일화하는 것이 중요합니다. 이 단계는 Day 0에서 시작하는 다양한 미세 환경이 각 플레이트에서 촉진되고 염증 반응에 영향을 미칠 수 있기 때문에 중요합니다.
또 다른 중요한 단계는 유충을 세어 각 먹이 상자에 필요한 음식의 양을 아는 것입니다. 음식의 양이 각 상자에있는 유충의 수에 적합하지 않으면 두 가지 시나리오 중 하나가 발생합니다 : 1) 유충이 부족합니다. 2) 유충이 넘칠 것입니다. 부정확 한 수유는 간 미세 환경에 큰 영향을 미치는 염증과 같은 영양 실조 또는 영양 과잉과 관련된 건강에 해로운 상태로 이어질 것입니다. 부정확 한 먹이가 발생하면 유충이 움직임 문제를 보입니다. 이 발달 단계에서 유충은 집중적으로 수영해야하므로 운동 문제가 발견되면 유충은 건강에 해로운 조건 (영양 실조 또는 과다 섭취로 인한 독성 용량의 콜레스테롤에 노출)에서 자랐습니다. 이러한 이유로 수유 절차는 정상 및 콜레스테롤이 풍부한 식단 모두에 대해 엄격하게 통제되어야합니다. 일부 분석은 간 비대(간 크기)의 존재와 조직 및 장기, 특히 간 및 장의 염증(호중구 및 대식세포의 눈에 띄는 침윤 증가)을 포함하여 유충의 섭식 및 건강의 정확성을 신속하게 해결하기 위해 수행할 수 있습니다.
E3의 95 %를 매일 청소하고 교체하는 것은 먹이 상자에서 미생물의 성장을 줄이고 유충의 건강과 생존을 개선하는 데 중요합니다. 또는 유충을 독립형 랙 시스템에 배치 할 수 있습니다. 최상의 결과를 얻으려면 60-80 마리의 유충을 3 리터 탱크에 넣으십시오. 흐름을 빠른 물방울 모드로 조정하고 유충에게 하루에 두 번 (AM 및 PM) 3-4mg을 먹이면서 물의 흐름을 최소 수준으로 유지하십시오. 각 탱크의 올바른 흐름을 보장하기 위해 정기적으로 물의 흐름을 점검해야합니다. 우리 실험실에서이 방법은 10 % HCD의 단기 공급으로 95-100 % 생존율을 제공합니다. 또한,이 방법은 설명 된 정적 공급 프로토콜에 필요한 일일 청소 및 물 교환에 내재 된 작업량을 크게 줄였습니다.
단기간에 NASH를 유도하기 위해 10% 콜레스테롤이 풍부한 식단을 사용했지만(5일이면 지방간염을 유발하기에 충분함), 과당 18, 지방산(예: 팔미트산)19 또는 4% 콜레스테롤이 풍부한 식단20을 사용하여 확장할 수 있는 수유 프로토콜을 사용하도록 식단 변경 및 확장할 수 있습니다. 현재 간세포 암종에 대한 성공적인 치료 표적은 거의 없으며 NASH에 대한 표적은 없습니다. 제브라피쉬 모델의 사용은 간세포 형성에 대한 지식을 확장할 수 있는 독특한 기회를 제공할 뿐만 아니라 대규모 처리량의 약물 스크리닝을 수행할 수 있는 비평행 척추동물 시스템을 제공합니다. 이 프로토콜에 설명 된 기술은 간 질환 및 간 세포 형성에 대한 향후 발견 및 치료 표적을 용이하게 할 것입니다.

간세포 암종 (HCC)은 치료 옵션이 제한된 공격적인 암입니다. 모든 간세포 암종 환자의 30 % 이상이 비만이며 NAFLD 1,2,3,4의 공격적인 형태 인 NASH를 가지고있는 것으로 밝혀졌습니다. 칼로리가 풍부한 식단을 섭취하면 지방산 가용성이 급격히 증가하여 국소 및 전신 대사 변화를 유발하고 지방증, 간세포 손상, 염증 및 섬유증을 유발합니다. 간세포 암종으로의 NASH 진행은 간에서 지질의 축적을 수반하며, 이는 염증을 유발하고 면역 세포 구성을 변화시킵니다 5,6,7. 간 미세 환경과 면역 세포 환경이 간 질환 진행 중에 어떻게 변하는지, 그리고 특정 병인으로 인해 어떻게 변하는 지 이해하는 것이 특히 흥미롭고 중요합니다. 콜레스테롤 과잉이 간 미세 환경과 면역 세포 환경에 미치는 영향을 더 잘 식별하기 위해 우리는 NASH 관련 간세포 암종의 독특한 제브라 피쉬 모델을 개발했습니다. 이 모델을 사용함으로써식이 요법과 영양 과잉이 간 미세 환경과 간 질환 진행에 미치는 영향을 더 잘 이해할 수있었습니다.
마우스 및 인간 조직 샘플과 같은 포유동물 모델은 지방간염 및 지방증의 발병기전을 이해하는 데 필수적이었습니다8. 마우스는 간 질환 및 암에 선호되는 모델이지만 세포 수준에서 광학 선명도가 부족한 반면 인간 조직 샘플은 종종 동물 모델이 모방 할 수있는 3D 환경이 부족합니다. 이러한 장애물로 인해 Zebrafish는 연구 커뮤니티에서 강력한 모델이되었습니다. 제브라 피쉬는 적어도 70 %의 유전자 보존으로 인간과 현저한 유사성을 가지고 있습니다. 그들은 간 미세 환경, 간 세포 구성, 기능, 신호 및 부상에 대한 반응을 유지합니다 9,10. HCC의 확립된 형질전환 제브라피쉬 모델과 함께 고콜레스테롤 식단(HCD)을 사용하여 NASH 관련 간세포암종의 제브라피쉬 모델을 개발했습니다.
여기에서는 NASH 관련 HCC 제브라피쉬 모델을 생성하는 방법과 간 미세 환경을 연구하고 생체 내에서 초기 악성 종양 특징을 해결하는 방법을 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 형광 태그가 부착된 간세포막 및 핵이 있는 제브라피쉬 형질전환 라인과 함께 비침습적 컨포칼 현미경을 사용하여 간 형태(면적, 부피 및 표면적), 세포 및 핵 형태(간세포 면적, 핵 면적, N:C 비율, 핵 원형도, 소핵/핵 탈장 점수) 및 혈관신생(혈관 밀도)을 분석하여 초기 악성 종양 특징을 해결할 수 있습니다. 면역 세포 미세 환경은 또한 간 세포 형성11,12,13,14에 중요한 특징이므로 태그가 지정된 면역 세포 (호중구, 대 식세포 및 T 세포)가있는 형질 전환 제브라 피쉬 라인을 사용하여 NASH 관련 간세포 암종 유충에서 간 면역 세포 구성을 분석하는 방법도 보여줍니다. 기술된 기술은 모델에 고유하고 간 질환 진행에서 간 미세환경 및 면역 세포 조성물을 평가하는데 매우 유용하다.

<table><tbody><tr><td>콜레스테롤</td><td>시그마</td><td>C8667-25G</td><td>쉽게 분해됩니다. 상점 -20&deg;C.</td></tr><tr><td>Corning Netwells 캐리어 키트 15mm</td><td>Fisher</td><td>07-200-223</td><td></td></tr><tr><td>Corning Netwells 인서트</td><td>Fisher</td><td>07-200-212</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>Fisher</td><td>60-046-380</td><td>고휘발성.</td></tr><tr><td>Dumont 펜치 #55 dumostar</td><td>Fisher</td><td>NC9504088</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 파스퇴르 피펫 5.75in</td><td>Fisher</td><td>22-183624</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드 (PFA)</td><td>전자 현미경 과학</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>골든 펄 다이어트 5&ndash; 50nm Active Spheres</td><td>염수 새우 직접</td><td>-</td><td>유충을 위한 모든 상업용 건조 분말 식품을 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>졸업 전송 피펫</td><td>피펫 Fisher</td><td>22-170-404</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>Fisher</td><td>BP26181</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH7.4, 10X, 10 팩</td><td>CrystalGen</td><td>221-1422-10</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 100X20MM</td><td>Fisher</td><td>08-747D</td><td></td></tr><tr><td>트리카인</td><td>시그마</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>피셔</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>오일 레드 O 용액 0.5% 이소프로판올</td><td>Sigma</td><td>O1391-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>트윈 20</td><td>Fisher</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Vactrap</td><td>VWR</td><td>76207-630</td><td>유충 수집용 진공 시스템</td></tr><tr><td>Opticss</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Stereomicroscope</td><td>라이카</td><td>M205 FCA THUNDER 이미저 모델 유기체 대형</td><td></td></tr><tr><td>회전 디스크 컨포칼 현미경</td><td>니콘</td><td>니콘 CSU-W1</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>라이카</td><td>S9i 반조명 베이스</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji</td><td>오픈 소스 Java 이미지 처리 프로그램.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris 9.6</td><td>비트플레인; 옥스포드 악기.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석

Analysis of Liver Microenvironment During Early Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease-Associated Hepatocellular Carcinoma in Zebrafish

간암은 현재 전 세계적으로 암 관련 사망의 세 번째 주요 원인이며 간세포 암종 (HCC)은 모든 간암 사례의 75-90 %를 차지합니다. B/C형 간염을 예방하고 치료하기 위한 효과적인 치료법이 도입됨에 따라 비알코올성 지방간 질환(NAFLD)과 비알코올성 지방간염(NASH)으로 알려진 보다 공격적인 형태가 현대 사회에서 간세포 암종 발병의 가장 큰 위험 요소가 되고 있습니다. NASH가 HCC 개발에 미치는 역할을 더 잘 이해하기 위해 우리는 NASH 관련 HCC 제브라 피쉬를 설계했습니다. 제브라 피쉬 유충의 광학적 선명도와 유전 적 다루기 성은 비 침습적 형광 라이브 이미징을 사용하여 간 미세 환경과 면역 세포 구성을 연구하는 매력적이고 강력한 모델입니다. 이 프로토콜은 NASH 관련 간세포 암종 제브라 피쉬 모델을 사용하여 간 미세 환경에서 콜레스테롤 과잉의 영향과 질병의 초기 단계에서 면역 세포 구성에 미치는 영향을 조사하는 방법을 설명합니다. 첫째, 우리는 NASH 관련 간세포 모델을 개발하기 위해 8 일 동안 간세포 특이 적 활성화 베타 카테닌을 발현하는 간세포 특이 적 활성화 베타 카테닌을 발현하는 간세포 암종 유충 (s704Tg)을 10 % 고 콜레스테롤식이 요법으로 공급합니다. 여기에서는 간 영역, 세포 및 핵 형태(간세포 영역, 핵 영역, 핵:세포질 비율(N:C 비율), 핵 원형도, 소핵/핵 탈장 점수) 및 혈관신생과 같은 비침습적 컨포칼 현미경으로 간의 여러 초기 악성 종양 특징을 평가하기 위해 다양한 형질전환 라인을 사용하는 방법을 설명합니다. 그런 다음 태그가 달린 면역 세포 (호중구, 대 식세포 및 T 세포)가있는 형질 전환 라인을 사용하여 NASH 관련 간세포 암종 유충에서 간 면역 세포 구성을 분석하는 방법을 보여줍니다. 설명 된 기술은 초기 간 세포 형성 단계에서 간 미세 환경 및 면역 세포 구성을 평가하는 데 유용하지만 다른 간 질환 모델에서 이러한 기능을 연구하도록 수정할 수도 있습니다.

간세포 특이적 구성 활성 형태의 베타-카테닌(s704Tg; Tg(fabp10a:pt-B-cat, cryaa:Venus)17을 참조하면, NASH 관련 간세포암종의 비포유류 척추동물 모델을 만들 수 있다. 간 질환 진행은 간 지방증, 간 크기, 간세포, 핵 형태, 혈관 신생 및 면역 세포 침윤을 측정하여 조기에 모니터링 할 수 있습니다 (그림 1).
정상적인 식단을 먹인 HCC 유충은 Oil Red O 염색으로 측정한 경미한 간 지방증에 대해 전혀 나타나지 않았습니다. 그러나 고 콜레스테롤식이 요법을 먹인 HCC 유충은 간 지방증이 크게 증가한 것으로 나타났습니다 (그림 2).
간 질환의 잘 알려진 마커는 간 비대17입니다. 간 크기를 평가하기 위해 간세포 암종 유충은 Tg (fabp10a : H2BmCherry)와 같은 간세포에서 형광 마커를 특이 적으로 발현하는 형질 전환 라인으로 교차 될 수 있습니다. 간 비대를 평가하기 위해 간 면적 (2D), 간 표면적 및 간 부피 (3D)의 평가가 수행됩니다. 콜레스테롤 과잉에 노출 된 지 8 일 후, 간세포 암종 유충에서 간 확대가 관찰되었습니다 (그림 3).
비침습적 라이브 이미징을 사용하여 간세포 막(예: Tg(fabp10a:Life-actin-EGFPP) 및 간세포 핵(예: Tg(Fabp10a:H2B-mCherry))에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 어선을 사용하여 간세포의 악성과 관련된 세포 및 핵 형태 변화를 평가할 수 있습니다. 간세포 면적은 NASH 관련 간세포 (그림 4A, B, D)뿐만 아니라 핵 면적 (그림 4C, E) 및 핵 : 세포질 비율 (그림 4F)에서 증가했다. 핵 순환성의 현저한 감소는 HCD + HCC 그룹에서도 관찰되었습니다 (그림 4G). 지방 독성은 소핵이있는 상태에서 발암의 특징 인 DNA 손상을 유발합니다. H2B-mCherry 마커를 사용하여 우리는 고 콜레스테롤식이 요법을 먹인 간세포 암종 유충에서 소핵의 더 큰 발생률을 관찰했습니다 (그림 4H).
간 혈관계는 혈관구조에 라벨을 붙이는 Tg (kdrl : mCherry 또는 Tg (fli : EGFP)와 같은 트랜스 제닉 태그 라인을 사용하여 제브라 피쉬 모델에서 쉽게 평가할 수 있습니다. HCC + HCD 유충에서 혈관 밀도의 상당한 증가가 관찰되었습니다 (그림 5).
NASH 관련 간세포 암종에서 초기에 유발 된 염증 반응을 관찰하기 위해, Tg (mfap4 : tdTomato-CAAX; lyz : BFP)와 같은 대 식세포 및 호중구에서 형광 단백질을 발현하는 형질 전환 어류 계통이 HCC 형질 전환 계통과 교차되었다. 호중구 및 대식세포의 침윤은 HCD가 공급된 간세포 암종 및 간세포 모두에서 발생하며, 이는 간 및 주변(주변 면적 최대 75μm)에서 호중구/대식세포의 수 및 밀도를 정량화하여 평가되었습니다(그림 6A-H). 그럼에도 불구하고 HCC+HCD는 호중구 수와 밀도가 크게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 6F-H). 수정 후 13 일이 지나면 적응 면역 체계가 이미 기능합니다. T-Cells에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 피쉬 라인을 Tg(lck:EGFP)와 같이 사용하고, HCC 형질전환 라인과 조합하여; 우리는 콜레스테롤 과잉이 T 세포의 간으로의 모집에 미치는 영향을 평가했다. HCD를 먹인 HCC 유충에서 T 세포 밀도와 전체 수의 현저한 감소가 관찰되었습니다 (그림 6I-K).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>트랜스 제브라 피쉬 라인</td>
			<td>ZFIN 참조</td>
			<td>시험</td>
		</tr><tr><td>캐스퍼</td>
			<td>로이A9; 미트파W2</td>
			<td>간 발점증</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:금성 / fabp10a:H2B-m체리 )</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg</td>
			<td>간 형태학</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; fabp10a:H2B-mCherry; fabp10a:LIFEACT-EGFP)</td>
			<td>s704Tg / uwm41Tg / uwm42Tg</td>
			<td>간세포와 핵 형태</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_ cryaa:Venus; fli:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / y1Tg</td>
			<td>혈관 신생</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:금성;  mfap4 : 토마토 - CAAX; lyzC:BFP)</td>
			<td>s704Tg / xt6Tg / zf2171Tg</td>
			<td>대식세포와 호중구 모집</td>
		</tr><tr><td>Tg(fabp10a:pt-β-catenin_cryaa:Venus; lck:EGFP)</td>
			<td>s704Tg / cz1Tg</td>
			<td>T 세포 모집</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 다양한 분석에 사용하기 위한 형질전환 제브라피쉬 라인.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>유충의 수</td>
			<td>급지 상자 크기</td>
			<td>하루 음식의 양 (mg)</td>
			<td>E3 용량 (밀리리터)</td>
		</tr><tr><td>30-40</td>
			<td>작은 번식 상자</td>
			<td>3-4</td>
			<td>200</td>
		</tr><tr><td>60-80</td>
			<td>작은/큰 번식 상자</td>
			<td>6-8</td>
			<td>400</td>
		</tr><tr><td>100-150</td>
			<td>큰 번식 상자</td>
			<td>10-15</td>
			<td>500</td>
		</tr></tbody></table>표 2 : 급지 상자의 조건을 설정합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>표현형</td>
			<td>채점 방법</td>
		</tr><tr><td>없음</td>
			<td>정상 핵, 소핵 또는 탈장 없음</td>
		</tr><tr><td>심하지 않음</td>
			<td>적은 수의 소핵(시야당 5개 미만) 및/또는 탈장</td>
		</tr><tr><td>보통/중증</td>
			<td>중등도에서 높은 수의 소핵(시야당 5개 이상) 및/또는 탈장</td>
		</tr></tbody></table>표 3 : 소핵 및 핵 탈출증 점수.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig01.jpg"> 그림 1: 주요 실험 단계와 분석 접근 방식을 요약한 프로토콜 다이어그램. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig02.jpg"> 그림 2: 간 지방증에 대한 대조 분석 - ORO 염색. HCC 유충에 정상 또는 고 콜레스테롤 식단을 공급하고 간 지방증을 평가하기 위해 Oil Red O (ORO) 염색을 수행했습니다. (a) 메쉬 웰 삽입물을 이용하여 순차적 ORO 염색을 수행하는 12웰 플레이트의 다이어그램. (B) 유충을 조작하는 데 사용되는 속눈썹 도구의 이미지. (c) 오일 레드로 염색된 간의 대표 이미지; 간세포 암종 및 HCC + HCD 유충. (D) 간 지방증의 상이한 스코어링을 갖는 유충의 백분율을 보여주는 카이-제곱 그래프. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig03.jpg"> 그림 3: 간 크기의 대표 이미지. 간 마커(Tg(fabp10a:H2B-mCherry))를 발현하는 형질전환 간세포 암종 유충을 zWEDGI를 사용하여 도립 회전 디스크 컨포칼 현미경에서 라이브 및 비침습적으로 이미지화했습니다. (A) HCC 및 HCC + HCD 유충에서 간의 대표적인 3D 재구성. (B-D) HCC 및 HCC + HCD 유충의 간 면적 (B) 간 표면적 (C) 및 간 부피 (D)를 포함한 간 형태 학적 변화를 보여주는 그래프. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig04.jpg"> 그림 4: 간세포와 핵 형태의 대표 이미지. 간세포 막(Tg(fabp10a:Life-actin-EGFP) 및 간세포 핵(Tg(fabp10a:H2B-mCherry)에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 HCC 라인을 이미지화하였다. (A-C) HCC 및 HCC + HCD 유충의 F- 액틴 및 간세포 핵의 대표적인 3D 재구성. 열린 화살촉은 확대 된 핵을 보여줍니다. 흰색 화살촉은 모양이 변경된 핵을 보여줍니다. 빨간색 화살표는 소핵과 핵 탈출증을 나타냅니다. (디지) HCC 및 HCC + HCD 13 일 된 유충의 세포 및 핵 매개 변수의 평균을 보여주는 그래프. (D) 간세포 영역. (e) 원자력 지역. (F) 핵 : 세포질 비율. (G) 핵 순환성. 각 점은 유충 당 평균을 나타냅니다. 점도표는 평균 ±SEM(H) 카이제곱 그래프를 보여주며, 소핵과 핵 탈출증의 점수가 다른 유충의 백분율을 보여줍니다. 스케일 바 = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig05.jpg"> 그림 5: 간 혈관계의 대표 이미지. 간세포 핵 (Tg (Fabp10a : H2B-mCherry) 및 내피 세포 (Tg) fli : EGFP))에서 형광 단백질을 발현하는 트랜스 제닉 HCC 라인). (A) HCC 및 HCC + HCD 유충에서 간 혈관계의 대표적인 3D 재구성. (B-C) HCC 및 HCC + HFCD 유충의 간 표면적 (B) 부피 (C)에 의한 혈관 밀도 지수를 보여주는 그래프. 점도는 평균 ±SEM을 보여줍니다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62457/62457fig06.jpg"> 그림 6: 간 면역 세포 풍경의 대표 이미지. 대식세포 및 호중구(Tg(mfap4:tdTomato-CAAX; lyz:BFP) 또는 T 세포(Tg(lck-EGFP)에서 형광 단백질을 발현하는 형질전환 HCC 라인. (ᅡ, ᄃ, 금) 13일 된 간세포 암종 및 HCC+HCD 유충에서 간 및 간 영역에 대한 백혈구 모집의 대표적인 3D 재구성. (B) 이미징 된 간 영역의 다이어그램. (D-E) HCC 및 HCC + HCD 유충의 간 영역에서 대 식세포 밀도 (D)와 수 (E)를 보여주는 그래프. (지에이치) HCC 및 HCC + HCD 유충의 간 영역에서 호중구 밀도 (G)와 수 (H)를 보여주는 그래프. (G) HCC 및 HCC + HCD 유충의 간 영역에 대한 T 세포 모집의 대표적인 3D 재구성. (H-I) HCC 및 HCC + HCD 유충의 간 영역에서 T 세포 밀도 (H) 및 수 (I)를 보여주는 그래프. 점도는 평균 ±SEM을 보여줍니다. 스케일 바 = 50μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/62457fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 표 1: 버퍼 및 솔루션 표 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62457/JoVE_Table_of_buffersandsolutions.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

여기에서는 콜레스테롤 과잉이 간 미세 환경 및 면역 세포 환경에 미치는 영향을 연구하기 위해 비 알코올성 지방간 질환 (NAFLD) 관련 간세포 암종 (HCC) 제브라 피쉬 모델을 생성하는 방법을 제시합니다.

Liver cancer is currently the third&#160;leading cause of cancer related death worldwide, and Hepatocellular Carcinoma (HCC) accounts for 75-90% of all ...

당사의 제브라피쉬 간암 모델과 프로토콜은 생체 내 현미경을 사용하여 생체 내, 비침습적으로 간 미세 환경과 면역 환경을 시각화할 수 있는 독특한 기회를 제공합니다. 제브라 피쉬 유충의 투명성은 의심 할 여지없이이 시스템의 주요 장점으로, 비 침습적 생체 내 현미경 검사를 수행하고 간과 같은 깊은 조직 및 기관의 미세 환경 및 면역 세포 침투에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 우리의식이 유도 신 모델과이 프로토콜에 설명 된 이미징 기술은 대사 증후군 및 심혈관 질환을 포함한 다른 간 질환 또는 연구 분야의 복잡한 세포-세포 상호 작용에 쉽게 적용될 수 있습니다.이 절차를 시연하는 것은 실험실 기술자 인 Cassia Michael과 내 실험실의 박사후 연구원 인 Francisco Juan Martinez-Navarro 박사가 될 것입니다. 시작하려면 제브라 피쉬 유충을위한 상업용 건조 식품 식단 4g을 25 밀리리터 유리 비커 2 개에 달아 하나는 일반 식단 용이고 다른 하나는 10 % 고 콜레스테롤 식단 (HCD)입니다. 10 밀리리터 유리 비커에 0.4g의 콜레스테롤을 달고 비커를 호일로 덮으십시오.흄 후드에서 20 게이지 바늘이 달린 10 밀리리터 주사기를 사용하여 5 밀리리터의 디 에틸 에테르를 측정하십시오. 그런 다음 일반 다이어트 비커에 디 에틸 에테르를 넣고 주걱을 사용하여 즉시 건조 식품과 혼합하십시오. 동일한 주사기와 바늘을 사용하여 5 밀리리터의 디 에틸 에테르를 측정하고 HCD 함유 비커에 첨가하십시오.주사기로 위아래로 흡인하여 즉시 혼합하십시오. 콜레스테롤 용액을 HCD 비커에 빠르게 넣고 용액이 균일해질 때까지 주걱과 즉시 혼합하십시오. 비커를 후드에 최대 24시간 동안 그대로 두어 디에틸 에테르를 완전히 증발시키십시오.다음날, 유봉과 박격포를 사용하여 다이어트를 미세 입자로 분쇄하십시오. 각 식단을 라벨이 붙은 작은 비닐 봉지 또는 50 밀리리터 원심 분리기 튜브에 옮기고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 1 일에서 1 일을 뺀 날에 형질 전환 물고기 줄을 설정하십시오.0 일째에는 물고기가 산란 한 후 메쉬 스트레이너에 알을 모으십시오. E3가 함유 된 세척 병을 사용하여 계란을 철저히 헹구고 E3 배지가있는 10cm 페트리 접시에 조심스럽게 옮깁니다. 미생물의 통제되지 않은 성장과 그에 따른 유충 발달의 결함을 피하기 위해 죽은 알이나 수정되지 않은 알을 포함하여 번식 상자에 쌓였을 수 있는 모든 파편의 판을 청소하십시오.그런 다음 25 밀리리터의 E3를 함유 한 접시 당 70 또는 80 개의 계란의 밀도로 계란을 나눕니다. 첫날에는 투과 조명베이스가 장착 된 해부 스코프 아래에서 죽은 배아 또는 발달 결함이있는 배아를 확인하고 청소하십시오. 5 일째에 모든 접시의 유충을 15 센티미터의 페트리 접시에 넣고 메틸렌 블루없이 E3를 첨가하십시오. 유충을 먹이 상자에 나누고 텍스트 원고에 설명 된대로 먹이십시오.유충을 제브라 피쉬 룸이나 인큐베이터에서 섭씨 28 도의 어두운 빛주기로 보관하고 5 일부터 12 일까지 하루에 두 번 먹이십시오. 매일 음식물 찌꺼기를 제거하고 1 밀리리터 피펫 팁에 부착 된 진공 시스템을 사용하여 배지의 90-95 %를 제거하십시오. 그런 다음 유충이 손상되지 않도록 메틸렌 블루가없는 새 E3를 먹이 상자의 한쪽 모서리에 조심스럽게 붓습니다.또는 유충을 시스템 용수가있는 3 리터 탱크로 나누고 물 흐름이 적은 독립형 시스템 장치로 배치 할 수 있습니다. 이 대안은 일일 세척 과정에 필요한 시간을 절약하고 여과 시스템은 종말점까지 유충을 건강하게 유지하는 데 도움이 됩니다. 13 일째에 설정된 실험 조건의 수에 따라 수집 요리를 준비하십시오.각 접시의 바닥을 덮을 수 있도록 메틸렌 블루없이 충분한 E3를 붓습니다. 그런 다음 조심스럽게 진공 시스템을 사용하여 공급 상자에서 물을 흡입하십시오. 수위가 낮아지기 시작하면 먹이 상자를 천천히 들어 올려 유충이 모서리 중 하나로 수영 한 다음 반대 방향으로 흡인합니다.약 20-30 밀리리터의 액체 만 남으면 유충을 준비된 수집 페트리 접시에 조심스럽게 따라 내고 접시 뚜껑의 먹이 상자에서 라벨이 붙은 테이프를 놓습니다. 형광 실체 현미경에서 마취된 유충에서 원하는 형광 마커를 스크리닝합니다. 그런 다음 트리카인 E3를 상처 및 포착 장치의 챔버에 첨가하십시오.P-200 마이크로 피펫을 사용하여 챔버와 억제 채널에서 기포를 제거하십시오. 여분의 트리카인 E3를 모두 제거하고 챔버를 채우기에 충분한 양만 남겨 둡니다. 다음으로, 마취 된 유충을 상처 및 포획 장치의 로딩 챔버로 옮기고 속눈썹 도구를 사용하여 왼쪽 엽의 이미징을 위해 배치합니다.간에서 필요한 모든 세포의 형태를 텍스트 원고에 설명 된대로 컨 포칼 현미경으로 이미지화합니다. 피지 소프트웨어를 엽니다. 그런 다음 이미지 파일을 열고 채널 분할 옵션에서 바이오 포맷 가져오기 옵션 탭.각 채널에 대한 최대 강도 투영을 만든 후 유충 간을 둘러싼 ROI를 만들고 간 영역을 측정합니다. 그런 다음 스케일 바를 참조로 추가하고 간 영역과 주변 영역의 75마이크로미터를 포함하는 두 번째 ROI를 만듭니다. 플러그인 메뉴에서 분석 옵션을 선택한 다음 Cell Counter를 선택하고 모집 영역 내의 면역 세포를 계산합니다.모집 된 면역 세포의 수를 스프레드 시트에 기록하십시오. 간 영역당 면역 세포 수를 정규화하여 호중구, 대식세포 및 T 세포 밀도를 계산합니다. 정상적인 식단을 먹인 HCC 제브라피쉬 유충은 Oil Red O 염색으로 측정한 바와 같이 간 지방증을 나타내지 않습니다.그러나 HCD를 먹인 HCC 유충은 간 지방증이 크게 증가합니다. 콜레스테롤 과잉에 노출 된 지 8 일 후, 간세포 암종 유충에서 간 확대가 관찰되었습니다. 간 비대를 평가하기 위해 간 면적, 간 표면적 및 간 부피를 평가했습니다.비 알코올성 지방 간염 관련 간세포 암종에서 핵 영역과 함께 간세포 영역 및 핵 대 세포질 비율이 증가했다. 핵 순환성의 현저한 감소는 또한 고지방 식이 요법을 먹인 HCC 그룹에서도 관찰되었다. H2B-mCherry 마커를 사용하여 HCD를 먹인 HCC 유충에서 더 큰 소핵 발생률이 검출되었습니다.간 혈관계 평가는 HCD를 먹인 HCC 유충에서 혈관 밀도의 상당한 증가를 보였다. 대 식세포와 호중구의 침윤은 HCD 유충을 먹인 HCC와 HCC 모두에서 발생했습니다. 간 및 그 주변의 대 식세포에서 호중구의 정량화는 HCD를 먹인 HCC 유충에서 세포의 수와 밀도가 현저하게 증가한 것으로 나타났다.대조적으로, HCD를 먹인 HCC 유충에서 전체 수의 T 세포 밀도의 현저한 감소가 관찰되었다. 탱크의 청소와 먹이는 유충의 생존력을 보장하고 수질이 좋지 않거나 부적절한 먹이로 인해 지방증이나 간 및 전신 만성 염증의 발병을 피하는 가장 중요한 단계입니다. 타임 랩스 현미경 검사 및 간을 채우는 다른 세포 간의 상호 작용 분석과 같은 다른 방법을 수행 할 수 있습니다.또한 다른 간암 단계에서 해부 된 간의 단일 세포 RNA 탐색을 수행하여 간 면역 환경이 질병 진행에 따라 어떻게 진화하는지 완전히 이해할 수 있습니다.

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