이 프로토콜은 인간 뉴런과 미세아교세포를 사용하여 신경면역 상호작용의 기계론적 토대를 연구하기 위해 미세아교세포를 인간 iPSC와 구별하고 iPSC 유래 피질 뉴런과 공동 배양에서 유지하는 방법론을 설명합니다.
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방법 논문
이 프로토콜은 인간 뉴런과 미세아교세포를 사용하여 신경면역 상호작용의 기계론적 토대를 연구하기 위해 미세아교세포를 인간 iPSC와 구별하고 iPSC 유래 피질 뉴런과 공동 배양에서 유지하는 방법론을 설명합니다.
인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)에서 미세아교세포를 생성하는 능력은 건강과 질병에서 미세아교세포의 역할을 조사하기 위한 새로운 도구와 방법을 제공합니다. 또한, iPSC 유래 미세아교세포는 iPSC 유래 피질 뉴런과 공동 배양에서 유지될 수 있으며, 이를 통해 여러 신경 정신 질환에서 조절 장애가 있는 것으로 추정되는 미세아교세포-뉴런 상호 작용에 대한 조사를 수행할 수 있습니다. Fossati 그룹이 개발한 프로토콜의 개조 버전을 사용하여 human iPSC를 분화하여 microglia를 생성하고, iPSC 유래 microglia는 marker 분석 및 real-time PCR을 통해 검증했습니다. 이 프로토콜을 사용하여 생성된 인간 미세아교세포는 CD11C, IBA1, P2RY12 및 TMEM119 마커에 대해 양성이었으며 미세아교세포 관련 유전자 AIF1, CX3CR1, ITGAM, ITGAX, P2RY12 및 TMEM119를 발현했습니다. 30일 동안 분화된 인간 iPSC 유래 피질 뉴런을 미세아교세포로 도금하고 실험이 수행된 60일까지 공동 배양으로 유지되었습니다. 미세아교세포와 공동 배양에서 피질 뉴런의 수지상 가시 밀도는 기준선 조건 하에서 그리고 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)의 존재 하에서 정량화되었습니다. 미세아교세포가 뉴런 기능을 조절하는 방법을 조사하기 위해 칼슘 지시자 Fluo-4 AM을 사용하여 피질 뉴런의 칼슘 이미징 실험을 수행했습니다. 대뇌피질 뉴런의 살아있는 칼슘 활성은 컨포칼 현미경을 사용하여 얻었고, 형광 강도는 ImageJ를 사용하여 정량화했습니다. 이 보고서는 인간 iPSC 유래 미세아교세포와 피질 뉴런을 공동 배양하는 것이 어떻게 피질 뉴런에 대한 미세아교세포의 영향을 조사하는 새로운 접근 방식을 제공하는지 설명합니다.
인간의 뇌에서 미세아교세포는 1차 선천면역세포입니다1. 뇌 발달은 두 가지 경로를 통해 미세아교세포에 의해 조절됩니다: 확산성 인자의 방출과 식세포작용1. 미세아교세포에서 유래한 확산성 인자는 수초화, 신경 발생, 시냅스 형성, 성숙, 세포 사멸 및 세포 생존을 지원하는 데 도움이 됩니다1. Microglia는 또한 뇌 시냅스, 축삭 및 살아있는 세포와 죽은 세포 모두에서 다양한 요소를 식세포화합니다 2,3,4,5,6,7,8. 미세아교세포(microglia)의 수용체(receptor)는 칼레티큘린(calreticulin), ATP, 시알산(sialic acid)과 같은 태그를 인식하고 세포 식균....
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이 연구에 사용된 인간 iPSC는 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받아 건강한 대조군 피험자의 사전 동의를 통해 얻은 섬유아세포에서 재프로그래밍되었습니다. 본 연구에서 사용된 iPSC(ML15, ML27, ML40, ML56, ML141, ML 250, ML292)의 재프로그래밍(reprogramming) 및 특성화는 선행 연구에서 설명되었다51.
1. iPSC의 유지 관리
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프로토콜 검증
iPSC 유래 미세아교세포는 3차례의 분화 과정을 통해 7개의 iPSC 라인에서 생성되었습니다. 대조군 iPSC 계열 ML27, ML56, ML292 및 ML364와 정신분열증 iPSC 계열 ML40, ML141 및 ML250을 활용했습니다. 이러한 iPSC 라인의 특성화는 이전에 설명되었습니다51. 이러한 iPSC 유래 미세아교세포는 ICC 및 qPCR을 사용하여 검증되었습니다. 적응된 프로토콜에서 생성된 미세아교세포는 전형적인 파쇄 미세아교세포 형태학을 나타냈으며(그림 1C), 면역세포화학에 의해 조사된 바와 같이 미세아교세포 마커 CD11c, TMEM119 및 IBA1을 발현했습니다(그림 1D, E). 미세아교세포 마커 CD11c, P2RY12 및 IBA1을 발현하는 핵을 가진 세포를 정량화했습니.......
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만능 줄기세포에 대한 다양한 궤적을 따른 분화 방법의 개발은 뇌 기능 및 질병 과정을 조사하기 위한 많은 길을 열었습니다 53,54,55. 초기 연구는 특정 뇌 질환에 중요하다고 가정된 특정 신경 세포 유형의 발달에 초점을 맞췄다56,57. 최근에는 뇌 오가노이드(brain organoids)가 환자 맞춤형 3차원 모델을 사용하여 질병 생물학을 연구하는 새로운 방법을 제공하기도 했다51,58. 2차원 및 3차원 세포 모델은 다양한 과학적 질문을 다루려고 할 때 특별한 이점을 제공한다
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이 연구는 미국 국립정신건강연구소(National Institute of Mental Health) Biobehavioral Research Awards for Innovative New Scientists(BRAINS) R01MH113858상(R.K.), 국립정신건강연구소(National Institute of Mental Health) 임상과학자개발상(K08MH086846, R.K.), 도리스 듀크 자선재단(Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Development Award), 라이언 리히트 상 양극성 재단(Ryan Licht Sang Bipolar Foundation, R.K.), Jeanne Marie Lee-Osterhaus Family Foundation 및 Brain & Behavior Research Foundation (A.K.), Phyllis & Jerome Lyle Rappaport Foundation (R.K.), Harvard Stem Cell Institute (R.K.), Steve Willis와 Elissa Freud (R.K.)가 수여하는 NARSAD Young Investigator Award. 연구에 사용된 섬유아세포를 제공해 주신 하버드....
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964 | |
| B-27 보충제 | Gibco | 17504044 | |
| b-FGF | Peprotech | 100-18B | |
| BMP-4 | Peprotech | 120-05ET | |
| Brainphys | StemCell Technologies | 5790 | |
| CD11C 항체 | Biolegend | 337207 | 희석 1:200 |
| Costar Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 07-200-83 | |
| Ctip2 항체 | Abcam | ab18465 | |
| CUTL1 monoclonal 항체 | Abnova | H00001523-M01 | |
| DMEM/F-12, 페놀 레드 | 없음 Gibco | 21041025 | |
| dorsomorphin | Sigma-Aldrich | P5499 | |
| DPBS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음 | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM) | Sigma-Aldrich | D6421 | |
| EasYFlask 세포 배양 플라스크 | Nunc | 156499 | |
| Fisherbrand Cell Lifters | Fisher Scientific | 08-100-240 | |
| Flt3-Ligand | Peprotech | 300-19 | |
| Fluo4-AM | Life Technologies | F-14201 | |
| Geltrex LDEV 무료 RGF BME 1 ML | ThermoFisher Scientific | A1413201 | |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
| GM-CSF | Peprotech | 300-03 | |
| 염소 안티 닭 - IgG H & L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150169 | 희석 1:1000 |
| 염소 안티 마우스- IgG H & L (Alexa Fluor 568) | Invitrogen | A-11004 | 희석 1:1000 |
| 염소 안티 쥐-IgG H & L (Alexa Fluor 405) | Abcam | ab175670 | 희석 1:1000 |
| 염소 안티 기니피그 IgG H & L (Alexa Fluor 405) | Abcam | ab175678 | 희석 1:1000 |
| 염소 혈청 | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| HBSS | Invitrogen | 14170120 | |
| IBA1 항체 | Abcam | ab5076 | 희석 1:500 |
| IL-34 | Peprotech | 200-34 | |
| INF-y | Peprotech | 300-02 | |
| KiCqStart SYBR 그린 프라이머 | 시그마-알드리치 | KSPQ12012 | |
| 라미닌 | 시그마-알드리치 | L2020 | |
| LDN193189 | 시그마-알드리치 | SML0599 | |
| 라이브 셀 이미징 솔루션 | Invitrogen | A14291DJ | |
| MAP2 항체 | 시냅스 시스템 | 188 004 | |
| M-CSF | 페프로텍 | 300-25 | |
| N-2 보충제 | Gibco | 17502001 | |
| Neurobasal 매체 | Life Technologies | 21103049 | |
| NutriStem hPSC XF Medium | Biological Industries | 01-0005 | |
| P2RY12 항체 | Biolegend | 848002 | |
| Paraformaldehyde 16% | Fisher Scientific | 50-980-488 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15140122 | |
| Poly-L-Orthinine | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| SATB2 항체 | Abcam | ab51502 | |
| SB431542 | Sigma-Aldrich | S4317 | |
| SCF | Stemcell Technologies | 78062 | |
| SensoPlate 24-Well Glass-Floor Plate | Greiner-Bio | 662892 | |
| StemPro-34 SFM (1X) | Gibco | 10639011 | |
| TMEM119 항체 | Abcam | ab185333 | 희석 1:1000 |
| TPO | Peprotech | 300-18 | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| VEGF | Peprotech | 100-20 | |
| Versene | ThermoFisher Scientific | 15040066 | |
| Y-27632 이염산염(ROCK 억제제) | 토크리스 | 1254 |
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