Name: 구강에서 공생 사카리박테리아의 안정적인 이진 문화 구축 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 배우세요 구강 사카리박테리아와 숙주 세균의 안정적인 이진 공배양 방법을. 치태 샘플에서 CPR 미생물을 분리하여 생리학 및 게놈 연구를 위한 실험실 배양을 가능하게 합니다.

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저자는 앤 태너, 브루스 파스터, 하이케 보이스버트, 쉬송 그와 바트빌리그 보에게 도움이 되는 토론과 세균균을 제공한 것에 대해 감사를 표하고자 합니다. 우리는 미생물 기술 지원을 수잔 요스트와 제시카 우즈에게 감사드립니다. 이 간행물에 보고된 연구는 수여 번호 R37 DE016937 (연준), R01 DE024468 (연준) 및 T32 DE007327 (AJC)의 밑에 건강의 국가 학회의 치과 및 두개골 면연구의 국립 학회에 의해 지원되었습니다. 이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

이 프로토콜을 개발할 때 IRB 승인을 구하고 승인(#14-10) 모든 과목으로부터 통보된 동의를 얻었습니다.
1. 준비
<ol><li>인간 과목과 함께 작업할 때 필요한 IRB 승인 및 정보에 입각한 동의를 얻습니다.</li>
	<li>초기 고정 단계로 성장 하기에 충분 한 시간으로 호스트 박테리아의 문화를 시작. 예를 들어, 거미표와 함께 0.1% 효모 추출물(TSBY)을 첨가한 트립틱 콩 육수의 2-5mL을 접종하고 24시간 동안 37°C에서 배양한다.</li>
	<li>트랙 에칭 0.2 μm 필터 멤브레인필터 홀더를 조립합니다. 어셈블리를 호일로 감싸고 오토클레이브하여 살균합니다.</li>
	<li>원심분리기 튜브와 캡 어셈블리를 살균합니다.</li>
</ol>2. 구강 박테리아 샘플 획득
참고: 많은 경구 시료에는 사카리박테리아(예: 타액, 편도선 면봉, 혀 스크래핑)가 포함되어 있지만 치과 플라크는 일상적으로 가장 성공적입니다.
<ol><li>멸균 종이 점인 그레이스 큐렛을 사용하여 플라크 를 긁거나 자체 샘플링하는 경우 멸균 이쑤시개 또는 파이펫 팁을 사용하십시오. 최대 복구 희석제(MRD, 0.85% NaCl, 0.1% 펩톤) 또는 PBS와 같은 적합한 버퍼로 플라크를 전송합니다. 즉시 처리되지 않으면 시료를 계속 진행할 때까지 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>작은 파이펫 팁과 소용돌이와 파이펫팅의 조합을 사용하여 MRD 버퍼에서 치과 플라크를 적극적으로 재봉.</li>
	<li>MRD 버퍼의 추가 9mL에 다시 일시 중단된 플라크 샘플을 추가합니다.</li>
</ol>3. 구강 샘플에서 여과를 준비
<ol><li>무균 기술을 사용하여 멸균 필터 어셈블리를 풀수 있습니다. 분기 회전을 풀고 필터 홀더를 다시 조이어 스레드가 제대로 관여하고 장치가 제대로 닫히도록 합니다. 주사기를 사용하여 장치를 통해 MRD 버퍼 10mL를 통과하여 멤브레인을 세척하십시오. 부적절한 조립은 필터 홀더에서 유체 누출에 의해이 단계에서 밝혀집니다. 누출이 발생하면 다른 멸균 필터 조립을 얻고 세척 단계를 반복하십시오.</li>
	<li>세척된 필터에 샘플을 적용합니다. 주사기에서 플런저를 제거하고 필터 장치에 부착합니다. 현재 MRD 버퍼의 10mL에 분산된 치과 샘플을 주사기에 붓고 필터에 로드합니다.</li>
	<li>필터 장치 아래에 멸균 원심분리기를 배치하여 여과를 잡은 다음 플런저에 가벼운 압력을 가하여 필터를 통해 샘플을 밀어넣습니다.</li>
	<li>MRD 버퍼의 또 다른 10mL로 절차를 반복하여 멤브레인을 세척하고 여과된 시료와 동일한 튜브의 흐름을 수집합니다. 무균적으로 튜브를 캡.</li>
</ol>4. 원심분리에 의한 사카리박테리아 세포를 농축
<ol><li>튜브와 캡에 방향 표시를 만들고 상단면에 마크가있는 고속 원심 분리기에 튜브를 놓습니다. 원심분리로 형성된 펠릿은 일반적으로 보이지 않습니다. 마킹은 원심분리가 끝나고 원심분리기에서 튜브를 제거할 때 사카리박테리아 세포의 펠릿이 어디에 있는지 결정하는 데 도움이 됩니다.</li>
	<li>4°C에서 1h에 60,000 x g의 샘플을 원심분리합니다. 참고 : 이 힘과 시간은 모든 사카리박테리아 세포를 pellet에 충분하다. 그러나, 사카리박테리아 세포는 적어도 20,000 x g에서 20 분 동안 원심 분리에 의해 부분적으로 펠렛 될 수 있다.</li>
	<li>원심분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 튜브의 상부에 펠릿을 유지하면서 튜브에서 액체를 붓습니다.</li>
	<li>활발한 소용돌이에 의해 MRD 버퍼의 1-2 mL에서 일반적으로 보이지 않는 펠릿을 다시 중단합니다.</li>
</ol>5. 사카리박테리아가 풍부한 여과로 호스트 문화를 감염시다
<ol><li>적절한 성장 매체(예: TSBY, BHI 등)를 튜브에 알리쿼팅하여 배양 튜브를 준비합니다.</li>
	<li>각 튜브에 숙주 유기체의 하룻밤 배양 200 μL을 추가합니다. 각 튜브에 100-200 μL의 재일시 중단된 여과 된 샘플을 추가합니다.</li>
	<li>숙주 유기체(예를 들어, 37°C, A. 프로피오니카용호기성 대기)에 적합한 결합된 샘플을 배양한다.</li>
	<li>새로운 튜브에서 2mL의 신선한 성장 배지로 이진 배양200 μL을 전송하여 2~3일마다 세포를 통과한다. 통로 배양이 성장을 보이지 않는 것으로 보인다면 (즉, 문화의 탁도 / 광학 밀도는 신선한 매체로 통과 한 후 증가하지 않습니다) 사카리박테리아는 압도적이거나 모든 숙주 유기체를 죽일 수 있습니다. 이를 해결하려면 세포를 통과할 때 감염되지 않은 숙주 배양 200 μL을 추가합니다. 적어도 5 개의 구절을 반복하십시오.</li>
</ol>6. PCR에 의한 감염 확인
<ol><li>5 구절 후, PCR감염확인. 5개의 통로는 PCR의 25주기를 사용하여 검출의 한계를 넘어 고갈된 어떤 비 성장 사카리박테리아 세포 보다는 보장할 것입니다.</li>
	<li>PCR 마스터믹스를 준비합니다. 필요한 각 튜브에 대해 다음과 같이 사용 가능한 레시피를 사용하는 것이 좋습니다. 준비 12.5 μL 2x PCR 버퍼, 0.75 μL 10 μM 포워드 프라이머 (580F12 - AYT GGG CGT AAA GAG TTG C), 0.75 μL 10 μM 역 프라이머 (1177R13- GAC CTG ACA TCA TCC CCT CCT CCT CCT CC TCC), 1 μ25 mM. 소용돌이에 의해 혼합.</li>
	<li>0.2 mL PCR 튜브에 마스터 믹스의 알리 쿼트 24 μL. PCR 반응에 사카리박테리아 감염 배양 1μL를 추가합니다. 튜브를 열순환기에 넣고 다음 프로토콜을 수행하십시오: 초기 내분 95°C5 분, 30s용 95°C의 25사이클, 30s용 60°C, 30초당 72°C, 최종 신장72°C에서 2분 동안 최종 유지한 다음 4°C에서 최종 보유합니다.</li>
	<li>1% 아가로즈 젤로 PCR 제품을 로드하고 실행합니다. ~ 600 베이스의 밴드는 사카리박테리아의 존재를 나타냅니다.</li>
</ol>7. 순도를 확인하고 오염 생물을 제거합니다.
<ol><li>숙주 유기체의 성장을 위해 충분한 영양 천에 사카리박테리아의 공동 문화를 도금하여 긍정적 인 문화의 순도를 확인합니다. 멸균 버퍼(예: MRD 또는 PBS)에서 배양 문화를 10배 연속 희석하고 한천 판에 100μL을 퍼뜨리습니다. 한천 판에 약 20-200개의 식민지가 자라게 될 정도로 희석을 수행한다.</li>
	<li>적절한 성장 조건에서 배양하고 오염 유기체를 관찰한다. 참고: 악삭 사카리박테리아 식민지는 관찰된 적이 없기 때문에 숙주 유기체만이 이 판에서 자라는 것을 관찰합니다. 하나 이상의 식민지 유형은 일반적으로 오염을 나타냅니다. 오염이 발생하면 원치 않는 오염 물질을 제거하기 위해 배양을 다시 필터링하고 신선한 숙주에 다시 접종해야합니다.</li>
	<li>때때로 두 개의 사카리박테리아 종이 동일한 호스트를 감염시 이중 감염이 발생시다. 사카리박테리아 종을 분리하려면 20 μL 멸균 PBS에서 개별 식민지를 재중단하고 PCR 반응에서 1 μL의 현탁액을 사용하여 사카리박테리아 감염으로 식민지를 감지합니다.</li>
	<li>이진 문화를 시작하기 위해 성장 매체에 긍정적 인 결과를 준 서스펜션을 전송합니다. 성공률은 배양에 있는 각 사카리박테리아 종의 티터에 달려 있습니다. 50개 이상의 식민지를 선별하여 전파에 감염된 식민지를 찾아야 할 수도 있습니다.</li>
</ol>8. 문화의 저장
<ol><li>하룻밤 동안 충분한 볼륨 (10-50 mL)의 이진 배양을 성장.</li>
	<li>원심분리에 의한 펠릿 세포(10분 동안 4,000 x g). 참고: 사카리박테리아 세포가 숙주의 더 크고 무거운 세포에 부착되고 그들과 함께 펠릿을 할 것이기 때문에 고속 원심분리는 여기에서 필요하지 않습니다.</li>
	<li>냉동 보호제에서 세포를 다시 중단합니다. 성장 매체 중 하나를 보충 5% DMSO 또는 20% 글리세롤은 일반적으로 충분. 숙주 유기체가 극저온 보호제 매체와 호환되는지 확인하십시오 (예 : A. 프로피오니카의 성장이 글리세롤에 의해 억제되고 냉동 된 주식은 부활하지 않을 수 있습니다). 주식이 동결살아남을 수 있도록 극저온 보호제로 감염되지 않은 호스트 문화의 생존 가능성을 테스트합니다.</li>
	<li>배양(10-50mL)의 동일한 부피에서 세포 펠릿을 재중단한다. 알리쿼트 0.5 mL을 표기 된 극저온으로 표시합니다. -80°C에서 세포 배양을 동결합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

플라크를 필터링하고 숙주 생물의 순수한 배양에 적용하는 우리의 방법은 주로 첫 번째 배양 사카리박테리아에 대한 이전의 관찰에 기초,'나노 신박터 lyticus' 균주 TM7x11,14,15. 작은 세포 크기를 감안할 때, 우리는 필터를 사용하여 치과 플라크에서 분리되고 원심 분리로 농축 될 수 있다고 추론했습니다. 둘째, 이러한 유기체가 기생충으로 살아 가면서 이러한 세포에게 숙주의 순수한 배양을 제공함으로써 공생에 들어가 이진 배양으로 성장할 수 있습니다.
이 방법의 한 가지 장점은 농축 배양이나 선택적 압력이 필요하지 않다는 것입니다. '나노신박터 리티쿠스' 균주 TM7x는 선택적 제제로서 연쇄절제술을 이용한 농축 배양으로부터 배양되었으며, 시퀀싱은 사카리박테리아의 농축에 효과적일 것이라고 제안했다. 다행히도,'나노신박터 리티쿠스' 샤알리아 오돈토리티카의호스트는 연쇄상 구균16에저항하는 것으로 알려져 있다. 선택적 에이전트로 항생제를 사용 하 여 또한 성장에서 호스트 유기 체를 방지할 수 있습니다., 차례로 사카리박테리아의 성장을 배제 것 이다.
농축 문화를 사용하는 더 큰 문제는 빠르게 성장하는 유기체가 빠르게 관심있는 유기체를 대체할 것이라는 것입니다. 구강 부양에서, 예를 들어, 연쇄상 구균 종은 빠르게 성장할 수 있고, 설탕이 성장 매체에 존재하는 경우에, 매체를 산성화하기에 충분한 산을 생성하고, 관심있는 유기체에 대하여 추가 선택합니다. 농축 문화와 선택적 항생제를 피함으로써, 우리의 방법은 이러한 다른 방법의 합병증없이 사카리박테리아와 잠재적 인 호스트의 넓은 범위에 적용 될 수있는 일반적인 접근 방식을 제공합니다.
여기에 제시 된 방법에 몇 가지 장애물이 있습니다. 첫째,이 방법은 사카리박테리아가 이진 문화에 살고 있다고 가정합니다. 우리는 그들의 효과를 측정하기 위하여 trinary 또는 대동맥 문화의 조합을 시험하지 않았습니다, 그러나 단 하나 숙주 유기체가 공급할 수 없는 성장 인자를 요구하는 가능성이 Saccharibacteria가 있습니다. 사카리박테리아의 성장을 지원할 수 있는 구강 박테리아의 광대 한 조합을 테스트 하는 것은 어려운 작업이 될 것입니다. 둘째, 이 방법은 모든 사카리박테리아가 0.2 μm 필터를 통과할 만큼 작다고 가정합니다. 다른 사카리박테리아가 믿는 것보다 크고 필터가 이러한 유기체에 대해 선택할 수 있습니다. 더 큰 공공 크기를 가진 필터를 사용할 수 있습니다., 하지만이 감염 된 공동 배양에 더 원치 않는 구두 박테리아를 허용의 위험을 실행. 마지막으로, 이미 출판 된 것 이외의 호스트 종을 찾는 것은 매우 어렵습니다. 지금까지, 유일한 성공적인 호스트는 제네라 액티노미세, 샤알리아, 아라크니아 및 셀룰로시마이크로움의종이며, 모든 구성원은 필럼 액티노박테리아15,17,18이다. 그러나, 이러한 호스트는 특정 사카리박테리아의 성장을 지원합니다. 사카리박테리아의 더 많은 종을 문화하기 위해 더 많은 호스트를 탐구해야합니다.
우리는 여기에 제시 된 방법이 사카리박테리아와 다른 심폐 소생술 생물의 미래 연구를 도울 수 있기를 바랍니다. 메타게노믹 시퀀싱은 이러한 유기체가 또한 작은 게놈을 가지고 있으며 공생으로 의심되거나 그들의 생존에 중요한 대사 산물 및 그밖 요인을 공급하기 위하여 현지 미생물 공동체에 의지한다는 것을 건의합니다19. 유사한 필터링 전략은 충분히 작고 숙주 유기체가 배양 될 수 있다면 이러한 유기체를 격리하는 데 사용될 수 있습니다. 여기에 설명된 방법은 실험실 문화의 강력한 도구를 이 크고 다양한 박테리아 그룹에 가져오는 첫 번째 단계입니다.

박테리아의 새로운 종을 배양하고 실험실로 데려 오는 것은 그들의 생리학 및 그들의 미생물 지역 사회 내의 더 넓은 상호 작용을 더 잘 이해하기 위하여 강력한 실험을 허용합니다. 이러한 질문(예: "메타 오믹스")을 심문하는 문화가 없는 방법이 있지만, 다양한 미생물 집단의 복잡한 상호 작용으로 인해 단일 변수를 따로 떼어내고 의미 있는 결론에 도달하기가 어렵습니다. 박테리아를 배양하는 것은 많은 이점이 있는 동안, 박테리아를 고립시키고 순수한 문화에서 그것을 성장하는 많은 잠재적인 장벽이 있습니다. 잠재적인 특정 성장 요구 사항은 pH, 산소 장력, 비타민, 성장 인자, 신호 분자 또는 성장을 유도하기 위해 직접 세포 접촉을 포함한다1. 그러나, 특정 auxo트로피는 박테리아의 새로운 종을 배양하는 1 차적인 억지력이라고 믿어집니다. 표준 미디어 제형은 특정 비타민 이나 탄소 소스와 같은 재배되지 않은 박테리아에 필요한 많은 영양소가 부족합니다. 이 누락된 분자는 배양되지 않은 박테리아의 생리학에 열쇠가 될 수 있고 일반적으로 미생물 지역 사회 또는 숙주 유기체에 있는 다른 유기체에 의해 제공됩니다. 예를 들어, 뮤신과 같은 복잡한 탄수화물은 동물 호스트에 의해 제공 될 수있다. 이를 미디어에 추가하면 아크케르만시아 무키니필라와 무키니보란히루디니스2,3,4등동물 용기에서 여러 박테리아를 재배할 수 있게 되었다. 많은 병원성 박테리아는 경구 병원체 포르피로모나스 치글리발리스5를포함하여 동물 세포에서 헤민에 결합된 철을 사용하는 능력을 진화하였다. 실험실에서, 포르피로모나스 및 기타 유기체의 성장은, 헤민6의첨가에 의해 자극될 수 있다.
최근, 박테리아의 새로운 분리를 배양에 많은 돌파구는 공동 배양을 통해 왔다, "피더" 유기체를 사용 하 여 그들의 성장에 필요한 비 배양 박테리아에 특정 요소를 제공. Vartoukian와 동료에 의해 우아한 연구 보여주었다 사이드 로포어, 박테리아에 의해 생산 된 철 바인딩 분자, 여러 새로운 경구 분리의 성장을 자극. 피오버딘, 의사 모나드 종에 의해 생성 된 사이드 로포의유형, 크게 새로운 Prevotella 종7의성장을 용이하게하기 위해 표시되었다. 같은 연구에서, 필럼 클로로플렉시를 위한 첫 번째 경구 분리는 또한 F. 뉴클레아텀을 사용하여 아직 알려지지 않은 화합물7을제공하는 도우미로 사용되었다. 최근에는 루미노구카아아속의 박테리아가 세균성 연약증을 사용하여 조력유기로서 8을 분리했다. 그것은 나중에 감마 aminobutyric 산 (GABA), 억제 신경 전달 물질, 실험실 미디어에 성장에 대 한 필요 했다 표시 되었다. 피더 유기체를 사용하는 것은 배양되지 않은 박테리아가 성장하는 특정 미세 환경을 모방하는 핵심 전략으로 입증되었으며, 다양한 농도에서 다양한 첨가제로 성장 미디어를 지속적으로 재구성하는 것보다 더 효율적입니다.
비배양박테리아의 가장 큰 그룹 중 하나는 "후보 필라 방사선"(CPR)에 있으며, 여러 후보 세균성 필라9,10의단피성 그룹이다. 이 글을 쓰는 시점에서, 심폐소생술 내의 사카리박테리아 피럼의 구성원만이 실험실에서 성공적으로 배양되었습니다. 첫 번째 분리인'나노신박터 리티쿠스' 균주 TM7x는 비배양식 TM711,12에대한 농축이 예상되었던 항생제 연쇄상 구균증을 사용하여 격리되었다. 이 작품의 주요 발견은 새로운 분리가 세균 호스트, Schaalia odontolytica와의직접 접촉에서 성장하는 기생충으로 성장했다, 현미경 검사는 이러한 기생충이 초소형 박테리아것을 보여 주었다.
이러한 단서를 사용하여, 우리는 신속하게 0.2 μm 필터를 통해 치과 플라크 및 기타 구강 샘플을 필터링하여 파트너와 사카리박테리아의 이진 공동 문화를 설정하는 방법을 고안, 원심 분리에 의해 여과에 세포를 수집하고 후보 호스트 박테리아의 문화를 감염하는 데 사용. 이 방법은 빠르게 성장하는 유기체에 압도 될 수있는 농축 문화를 피하는 장점이 있습니다. 그것은 또한 항생제의 사용을 방지, 대상 된 사카리 박테리아 종 또는 그들의 호스트의 성장을 중지 할 수 있는. 여기에서 입증된 방법을 사용하여, 우리는 성공적으로 사카리박테리아 낭직에서 32개의 분리를 배양했습니다.

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP160-100</td><td></td></tr><tr><td>Alphaimager</td><td>Cell Biosciences</td><td>FluorChem HD2</td><td>또는 동급 UV 젤 이미징 시스템</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-213-101</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion Broth (탈수 분말)</td> <td>Becton-Dickinson</td><td>211059</td><td>또는 대상 유기체</td></tr><tr><td>에 적합한 기타 성장 매체원심분리기 로터 70-Ti</td><td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-500</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 전원 공급 장치</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td></td></tr><tr><td>전기영동 장비</td><td>Bio-Rad</td><td>1704467</td><td></td></tr><tr><td>필터 집게</td><td>Millipore Sigma</td><td>XX6200006P</td><td>필수는 아니며 취급 중 필터에 구멍이 나지 않도록 도와줍니다</td></tr><tr><td>. 글리세롤</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>G33-500</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq Green Mastermix Promega</td><td></td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>950040025</td> 또는 PCR MgCl2 용액 25mM Promega A3513<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>용 동급의 열사이클러분자 생물학 등급 물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2819100</td><td></td></tr><tr><td>O2 제어 InVitro 글러브 박스</td><td>Coy Laoratories</td><td>031615</td><td>필요한 경우 마이크로 호기성 유기체</td></tr><tr><td>Optima L-100 XP 고속 원심 분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>8043-30-1124</td><td></td></tr><tr><td>P-10 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>P-1000 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P-2 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>P-20 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P-200 마이크로 피펫</td><td>Gilson</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP399500</td><td></td></tr><tr><td>PCR 튜브 0.2 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-230-205</td><td></td></tr><tr><td>펩톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1420-500</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 - 10 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-717-157</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 - 1000 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-717-166</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 - 20 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-717-161</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁 - 200 &mu; L</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-717-165</td><td></td></tr><tr><td>폴리카보네이트 필터 - 47mm, 0.2 &mu; m pore size</td><td>Millipore</td><td>GTTP04700</td><td></td></tr><tr><td>Screw-cap 원뿔형 원심분리기 튜브 15 mL</td><td>Falcon</td><td>352096</td><td>또는 다른 튜브는 세균 배양에 적합합니다</td></tr><tr><td>. 염화나트륨</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Swin-Lok Filter&nbsp; - 47mm</td><td>Whatman</td><td>4200400</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel stain</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>주사기 - 20mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>TAE 버퍼(50x) 농축액</td><td>Fisher Scientific</td><td>P1332500</td><td></td></tr><tr><td>Thickwall 폴리카보네이트 25 x 89mm(26.3mL 용량) 캡이 있는 원심분리기 튜브</td><td>Beckman Coulter</td><td>355618</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Blood Agar Plates</td><td>Northeast Laboratory Services</td><td>P1100</td><td>또는 기타 한천 플레이트의 성장에 충분합니다. 숙주 유기체</td></tr><tr><td>: Tryptic Soy Broth (탈수 분말)</td> <td>Becton-Dickinson</td><td>211825</td><td>또는 대상 유기체에 적합한 기타 성장 매체</td></tr><tr><td>: 비닐 혐기성 챔버</td><td>Coy Laboratories</td><td>032714</td><td>혐기성 유기체에 필요한 경우</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1422-500</td><td></td></tr></tbody></table>

구강에서 공생 사카리박테리아의 안정적인 이진 문화 구축

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

많은 세균성 종은 표준 방법을 사용하여 실험실에서 배양 될 수 없으며, 지구상에서 미생물 다양성의 대부분을 연구하는 데 상당한 장벽을 포즈. 새로운 접근은 연구원이 효과적으로 실험실에서 유효한 강력한 공구를 사용하여 그들의 생리학 및 생활양식을 공부할 수 있도록 이 비배양되지 않는 박테리아를 배양하는 데 필요합니다. 후보 필라 방사선 (CPR)은 지구상의 살아있는 다양성의 ~ 15 %를 포함하는 경작되지 않은 박테리아의 가장 큰 그룹 중 하나입니다. 이 그룹의 첫 번째 분리는 사카리박테리아 필럼의 구성원이었다,'나노 신박터 lyticus'균주 TM7x. TM7x는 세균 호스트, Schaalia odontolytica, 균주 XH001과 직접 접촉공생으로 사는 비정상적으로 작은 박테리아이다. 비정상적으로 작은 세포 크기와 공생 유기체로서의 라이프 스타일을 활용하여 치과 플라크에서 사카리박테리아를 빠르게 배양하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 프로토콜은 0.2 μm 필터를 통해 치장 플라크의 현탁액을 필터링한 다음 수집된 사카리박테리아 세포를 농축하고 숙주 생물의 배양을 감염하는 방법을 보여줍니다. 결과 공동 배양은 어떤 정상적인 세균 배양및 감염이 PCR에 의해 확인되기 때문에 통과될 수 있다. 결과 이진 배양은 실험실에서 유지 관리되고 향후 실험에 사용될 수 있습니다. 오염이 가능하지만, 이진 배양은 호스트의 추가 여과 및 재감염또는 감염된 식민지에 대한 이진 배양 및 스크리닝을 도금하여 정제될 수 있다. 우리는 이 프로토콜이 다른 샘플 유형 및 환경으로 확장되어 심폐 소생술에서 더 많은 종의 재배로 이어질 수 있기를 바랍니다.

사카리박테리아의 검출을 위한 PCR은 사카리박테리아 공생의 낮은 수 때문에 초기 감염 배양에서 부정적인 나타날 수 있습니다 (즉, 본 제품 없음). 그러나, 몇 구절 후 강한 PCR 제품은 안정적인 감염이 발생했다는 것을 보여주는 나타나야한다(도 1A). 반대로, 몇몇 감염은 처음에 PCR에 의해 긍정적으로 나타납니다, 그러나 1-4 통로 후에 탐지할 수 없을 (표시되지 않음). 이는 다량의 사카리박테리아 세포가 초기 여과에 존재했으나 통로에 의해 희석되었고 호스트 문화와 함께 안정적인 공생을 입력할 수 없었음을 나타냅니다. 구강으로부터 과연 사카리박테리아가 과연 여러 숙주 종을 시험하는 것은 공생호스트 상호작용이 매우 특이하기 때문에 일반적으로 성공률이 낮습니다(도1B). 연구원은 또한 몇몇 다른 과목에서 여과와 동일 호스트를 시험할 수 있습니다. 좋은 숙주 유기체(예: 거미 프로피오니카 또는 샤알리아 오돈토리카)가사용되는 경우 성공률이 50%를 기대할 수 있습니다.
PCR에 의한 테스트는 매우 중요합니다. 숙련 된 연구원은 현미경 검사법에 의한 감염을 확인하려고 시도했습니다, 단지 거짓 긍정을 보고하기 위하여. 사카리박테리아 세포는 작고 불규칙한 세포 봉투 벌수를 구별하기 어렵다. 여러 구절을 통해 안정적인 PCR 신호는 성공적인 감염을 확인하는 열쇠입니다.
감염된 배양이 증가함에 따라 정상적인 탁탁증 성장이 나타나야 합니다. 공생이 확립됨에 따라 감염된 배양은 감염되지 않은 숙주 유기체의 배양(그림2A)보다덜 탁탁하게 나타납니다. 어떤 경우에는 감염된 배양은 완전히 증가하는 것을 멈추고 탁탁이되지 않는 것처럼 보일 수 있습니다. 이것은 사카리박테리아 세포가 호스트 유기체를 압도하는 감염 때문일 지도 모릅니다. 이러한 문화에 "신선한"(감염되지 않은) 호스트를 추가하는 것은 사카리박테리아 기생충의 지속적인 성장을 지원하기 에 충분한 호스트 의 인구를 제공해야한다.
자라나거나 지나치게 탁탁 배양은 실험실 오염물질 또는 0.2 μm 필터를 통과할 수 있었던 다른 작은 구강 박테리아에 의한 오염을 나타낼 수 있다. 캄필로박터와 카노시토파가 스프.는 이러한 실험의 전형적인 구강 오염물질이다. 이는 문화를 도금하고 16S rRNA 시퀀싱다음으로 숙주 유기체의 비정형인 식민지를 찾아서 확인할 수 있다. 오염이 나타나면 0.2 μm 필터를 통해 이러한 배양을 필터링하는 것은 일반적으로 오염 물질을 제거하기에 충분합니다. 여과에 있는 사카리박테리아 세포는 원심분리에 의해 농축될 수 있고 순수한 숙주 문화를 다시 감염시키기 위하여 이용될 수 있습니다.
오염된 문화를 정화하는 또 다른 방법은 감염된 배양을 도금에서 감염된 식민지를 따기하는 것입니다. 감염된 호스트의 식민지는 때때로 감염되지 않은 식민지에 비해 불규칙한 식민지 모양에 의해 식별 될 수있다(도 2B-D). 이러한 불규칙한 식민지는 이진 배양에서 사카리박테리아의 티터에 의존하고 있으며, 티터가 낮으면 식민지의 비율이 작아 불규칙하게 나타납니다. 이렇게 하면 감염된 식민지를 쉽게 식별할 수 있으며, 이는 순수한 이진 문화를 시동하는 데 사용할 수 있습니다. 사카리박테리아 감염 배양에서 도금시 불규칙한 식민지가 보이지 않으면 공생이 낮은 티터에 있거나 불규칙하게 형성된 식민지를 일으키지 않을 수 있습니다. 이러한 경우, 정상적인 외관을 가진 PCR 검열 식민지는 Saccharibacteria에 의하여 감염을 보여줄 수 있습니다, 그러나 낮은 비율에 (모든 식민지의 2-10%).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2.jpg"> 그림 1: 숙주 배양의 사카리박테리아 감염의 전형적인 PCR 결과. (A)사카리박테리아의 존재를 나타내는 PCR 제품은 초기 감염으로 나타나지 않을 수 있지만, 공존이 확립됨에 따라 후속 구절에서 나타나고 강해질 수 있다. (B)사카리박테리아가 풍부한 여과에 감염된 대부분의 호스트는 공생의 특이성으로 인해 성장을 지원하지 않습니다. 이 예에서는, 단지 A. 프로피오니카가 성공적으로 감염되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62484/62484fig02.jpg"> 그림 2: 사카리박테리아 감염 배양의 성장 특성. (A)감염된 배양을 보여주는 A. 프로피오니카의 감염 및 비감염 배양의 성장 곡선은 감염되지 않은 대조군과 동일한 밀도로 성장하지 않고 덜 탁탁하게 나타난다. (B-D) 동문화의 도금은 사카리바테리아 감염으로 인한 불규칙한 식민지를 생성할 수 있습니다. 불규칙한 식민지는 공동 문화에서 사카리박테리아의 티터에 비해 비율이 감소할 것이다. (B)사카리박테리아의 높은 수준으로 호스트. (C)10배 희석 된 사카리박테리아(D)감염되지 않은 숙주 배양. 흰색 화살표는 불규칙한 식민지의 예를 나타냅니다. 배율 막대 = 1cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62484/62484fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

우리는 치과 플라크를 필터링하고 숙주 박테리아와 공동 배양하여 새로운 세균 성 물리, 사카리박테리아의 성장하기 어려운 구성원을 격리하는 방법을 보여줍니다.

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

사카리박테리아는 적절한 숙주 박테리아와 공동 배양을 필요로하는 필수 기생충입니다. 인간 구강 사카리박테리아는 알려진 숙주 세균 종을 사용하여 대부분의 개인을 위해 쉽게 격리될 수 있기 때문에. 이 프로토콜은 모든 조사자 또는 실험실이 이진 공동 배양에서 자신의 균주를 격리 할 수 있습니다.이 기술은 대부분의 미생물 실험실에 존재하는 간단한 장치 및 장비를 사용하고 성공적으로 사카리박테리아의 6 종을 나타내는 30 개 이상의 격리를 배양하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 적절한 활성소균 숙주를 식별하고 분리할 수 있는 경우 다른 후보 추적 방사선 종뿐만 아니라 다른 환경 및 기타 포유류로부터의 사카리박테리아의 격리에 유용할 수 있다. 절차를 시연하는 것은 앤드류 콜린스, 내 실험실에서 전 박사 후 동료가 될 것입니다.시작하려면 거미성 프로니키카와 같은 숙주 박테리아의 배양을 시작하여 초기 고정 단계로 성장할 수있는 충분한 시간을 가지고 있습니다. 문화를 개시하기 위해, 거미성 프로니키아와 0.1%효모 추출물을 함유한 트립틱 콩 육수 2~5밀리리터를 접종하고 24시간 동안 섭씨 37도에서 배양한다. 다음으로 트랙 에칭 0.2 마이크로미터 필터 멤브레인필터 홀더를 조립합니다.원심분리기 튜브및 캡 어셈블리와 함께 호일에 싸서 오토클레이빙으로 소독합니다. 비멸 표면과 우발적으로 접촉하는 경우 추가 소모품을 살균하십시오. 잇몸 라인을 따라 긁어 내고, 멸균 종이 점, 우아한 곱슬거또는 멸균 된 이쑤시개 또는 파이펫 팁을 사용하여 치과 플라크를 수집하고 MRD 또는 PBS와 같은 적절한 버퍼로 옮길 수 있습니다.더 이상 진행할 준비가 될 때까지 샘플을 얼음 위에 보관하십시오. 작은 파이펫 팁으로 소용돌이와 파이펫팅의 조합을 사용하여 치과 플라크를 적극적으로 다시 중단한 다음 MRD 버퍼 9밀리리터를 포함하는 튜브에 다시 매달린 플라크 샘플을 추가합니다. 무균 기술을 사용하여 멸균 필터 어셈블리를 조심스럽게 풀수 있습니다.분기 회전을 풀고 필터 홀더를 다시 조여 스레드가 제대로 관여되고 장치가 제대로 닫히도록 합니다. 주사기를 사용하여 장치를 통해 MRD 버퍼 10 밀리리터를 전달하여 멤브레인을 세척합니다. 세척된 필터에 샘플을 적용하려면 주사기에서 플런저를 제거하고 필터 장치에 부착합니다.여과 장치를 필터 아래에 멸균 원심분리기 튜브를 놓고 분산된 치과 샘플을 주사기에 붓고 필터에 적재합니다. 그런 다음 플런저에 가벼운 압력을 가하여 샘플을 필터를 통과합니다. MRD 버퍼의 또 다른 10 밀리리터로 멤브레인을 세척하고 여과된 시료와 동일한 튜브로 흐름을 수집합니다.그런 다음 튜브를 무균으로 캡하고 얼음을 유지합니다. 원심 분리 후 세포 펠릿의 위치를 식별하기 위해 튜브와 캡에 방향 표시를 확인합니다. 상부에 마크가 있는 고속 원심분리기에 튜브를 놓고 샘플을 섭씨 4도에서 1시간 동안 60G, 000 G의 원심분리기로 놓습니다.원심 분리 후, 조심스럽게 상체를 부어 튜브의 상단에 펠릿을 유지합니다. 그런 다음 적극적으로 소용돌이에 의해 MRD 버퍼의 1 ~ 2 밀리리터에 펠릿을 다시 일시 중지합니다. 적절한 성장 매체의 두 밀리리터를 튜브에 알리싱하여 배양 튜브를 준비합니다.그런 다음 숙주 유기체의 하룻밤 문화의 200 마이크로리터와 각 튜브에 100~200개의 미세리터를 재일시 중단된 여과시로 추가합니다. 숙주 유기체에 적합한 조건하에서 결합된 샘플을 배양한다. 새로운 튜브에서 신선한 성장 배지의 2 밀리리터로 이진 배양의 200 마이크로리터를 전송하여 2 ~3 일마다 세포를 통과.통과 된 배양이 감염되지 않은 숙주 문화의 200 마이크로 리터에서 성장을 보여주지 않으면 세포를 통과할 때 접종 된 튜브를 인큐베이터로 반환합니다. 0.2 밀리리터 PCR 튜브에 PCR 마스터 믹스의 알리따옴표 24 마이크로 리터. 사카리박테리아 감염 배양의 한 마이크로리터에서 튜브를 열 사이클러에 놓습니다.텍스트 원고에 설명된 대로 PCR 프로그램을 설정합니다. 1% 아그로스 젤로 PCR 제품을 로드하고 실행합니다. 약 600 개의 기지의 밴드는 사카리박테리아의 존재를 확인합니다.양성 배양의 순도를 확인하기 위해 멸균 완충제에서 사카리박테리아의 공동 배양에 대한 10배 연속 희석을 수행하고, 100마이크로리터를 한천 판에 퍼뜨리도록 한다. 적절한 성장 조건하에서 문화를 배양하고 오염 유기체를 관찰한다. 약 600 개의 기지의 밴드는 사카리박테리아의 존재를 확인합니다.PCR 검출은 사카리박테리아 공생의 낮은 수 때문에 초기 감염 배양에서 부정적인 나타날 수 있습니다. 그러나 몇 구절 후에 강력한 PCR 제품이 나타나므로 안정적인 감염이 발생했음을 나타냅니다. 동일한 사카리박테리아 여과와 여러 호스트 종을 테스트하는 것은 일반적으로 낮은 성공률을 가질 것이다.공생 호스트 상호 작용은 매우 구체적입니다. 감염된 배양이 증가함에 따라 정상적인 탁탁증 성장이 나타나야 합니다. 공생이 확립됨에 따라 감염된 배양은 감염되지 않은 숙주 생물의 배양보다 덜 탁탁하게 됩니다.오염된 배양은 도금 후에 감염된 식민지를 따기로 정해질 수 있습니다. 감염된 식민지는 때때로 감염되지 않은 식민지에 비해 불규칙한 식민지 모양에 의해 확인될 수 있습니다. 일반 식민지의 비율은 이진 배양에서 사카리박테리아의 티터에 따라 달라집니다.티터가 낮으면 불규칙한 식민지가 적어 감염된 식민지를 쉽게 선택하고 순수한 이진 문화를 시작할 수 있습니다. 문화는 여러 구절에 대해 긍정적으로 나타나지 않을 수 있습니다. 그래서 몇몇 환자는 필요할 것입니다.또한 이진 문화의 오염을 정기적으로 검사할 필요가 있습니다. 이진 배양은 모든 종류의 실험실 실험에 사용할 수 있습니다. DNA와 RNA는 게놈 시퀀싱 및 전사 분석을 위해 각각 추출될 수 있다.병원성 또한 동물 모델을 사용하여 조사 될 수있다.

establishing-stable-binary-cultures-symbiotic-saccharibacteria-from

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

출처: Collins, AJ, et al., 구강에서 공생 사카리박테리아의 안정적인 이진 배양 확립. J. Vis. Exp. (2021년)이 비디오는 Saccharibacteria와 숙주 박테리아를 숙주 특이적 성장 배지에서 순차적으로 공동 배양하여 이진 배양의 확립 및 유지를 보여줍니다.

숙주 박테리아를 사용한 Saccharibacteria의 이원 배양 확립

출처: Arroyo, M. C. 외 시험 관 내 숙주-미생물 인터페이스에서 합성 박테리아 컨소시엄의 생존 가능성 평가. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 모의 구강, 위장, 장 소화 과정에서 합성 구강 미생물 군집의 생존 가능성 평가를 시연합니다. 각 단계 후 세균 생존율이 수치화되며, 소화 스트레스로 인한 점진적인 감소가 나타납니다.

합성 구강 박테리아 군집을 소화의 시뮬레이션 단계에 노출시키기

출처: Collins, A. J. 외, 구강에서 공생 당류박테리아의 안정적인 이원 배양 확립. J. Vis. 경험 (2021)이 영상은 분쇄효소 연쇄 반응(PCR)을 사용해 박티노마이세스 가 있는 이진 배양에서 당류박테리아를 검출하는 방법을 보여줍니다. 프로토콜은 숙주-기생충 상호작용의 안정을 확인하기 위해 DNA 증폭과 겔 전기영동을 개략적으로 설명합니다.

중합효소 연쇄 반응을 이용한 이원 배양에서 당류박테리아 검출

출처: Schlafer, S, Frost Kristensen, M. 교차 생물막에서 공초점 현미경을 이용한 세포외 pH 모니터링. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 구강 환경에서 Streptococcus mutans 와 Candida albicans 교차 생물막을 배양하여 박테리아-곰팡이 상호작용을 모델링하는 과정을 시연하며, 구강 병인에서 미생물 시너지, 글루칸 매개 부착, 산성 병원성 연구를 가능하게 합니다.

구강 병원 연구를 위한 박테리아-곰팡이 교차 생물막 구축

출처: 미켈 게녹, C. 외. 공초점 및 전자현미경을 이용한 섬유성 곰팡이 군락의 박테리아 바이오필름 정성적 다척도 분석에 관한 새로운 방법. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 콜로판 형성과 방사형 성장을 지원하기 위해 처리된 셀로판 막 위에 곰팡이 배양물을 준비하는 과정을 보여줍니다. 그 후 상호작용 분석에 대한 토양 박테리아 세포의 배양 및 준비 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 박테리아 세포가 곰팡이 집락에 어떻게 부착하여 바이오필름을 형성하는지를 보여주어 박테리아-곰팡이 간 상호작용 연구를 가능하게 합니다.

바이오필름 형성을 위한 곰팡이-박테리아 공동 배양 확립

출처: 칼라타유드 아로요, M. 외. 시험관 내 숙주-미생물 인터페이스에서 합성 박테리아 컨소시엄의 생존 가능성 평가. J. Vis. 경험 (2018).이 영상은 박테리아의 생존 가능성을 연구하기 위한 시험관 내 장 숙주-미생물 모델을 시연합니다. Caco-2와 HT29-MTX 세포의 공동 배양은 모의 소화 조건 하에 사전 처리된 박테리아와 함께 배양됩니다. 상피 장벽의 완전성을 경상피 전기 저항을 이용해 평가하며, 배양지에서 분획, 용해된 점액, 세포 용해액, 세포 잔해물을 수집하여 후속 분석을 수행합니다.

박테리아 부착 및 내부 흡수를 평가하기 위한 시험관 내 장 모델

Source: Calatayud Arroyo, M., et al. Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface. J. Vis. Exp. (2018)The video demonstrates a method to evaluate the viability of anaerobic oral bacteria using fluorescent dyes and flow cytometry. It begins with culturing bacteria in oxygen-free broth, followed by resuspending a single colony from a blood agar plate. After incubation and dilution, the culture is stained with membrane-permeable and...

Fluorescence-Based Viability Assessment of Oral Anaerobic Bacteria

창 자 미생물 호스트 상호 작용은 합성 구두 커뮤니티, 생체 외에서 위장 소화, 그리고 소장 상피의 모델을 결합 하 여 새로운 접근 방식을 사용 하 여 평가 됐다. 우리 세포 침입 병원 체와 다중 종 biofilms의 평가 또는 테스트 probiotic 정립 생존 적응 될 수 있는 방법 제시.

생체 외에서 직감 호스트 미생물 인터페이스에 합성 세균 컨소시엄의 생존 능력을 평가

이 프로토콜은 박테리아 종간 상호 작용의 영향을 탐구하는 데 사용할 수 있는 낭포성 섬유증(CF) 폐 관련 4종 다미생물 생물막 모델을 설명합니다.

커뮤니티 표현형을 조사하기 위한 낭포성 섬유증 관련 다미생물 생물막 성장

이 프로토콜은 광독립영양 설탕 분비 시아노박테리아 및 종속영양 효모를 포함한 공동 배양의 설정 및 정량적 모니터링을 위한 포괄적인 지침을 제공합니다.

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria(종속영양 효모와 광영양성 설탕 분비 시아노박테리아를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화)

배우세요 구강 사카리박테리아와 숙주 세균의 안정적인 이진 공배양 방법을. 치태 샘플에서 CPR 미생물을 분리하여 생리학 및 게놈 연구를 위한 실험실 배양을 가능하게 합니다.

구강에서 공생 사카리박테리아의 안정적인 이진 문화 구축

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