HiBiT 기반 바이오 리포터를 사용하여 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 항체 검출

내 실험실은 COVID-19 연구에서 일하고 있다, 우리는 최근에 우리가 빠르고 정확하게 SARS-CoV-2 항체를 검출할 수 있는 새로운 분석서를 개발했습니다. 이 프로토콜은 현재 전염병을 감안할 때 중요한 환자 혈청 샘플에서 항 SARS-CoV-2 항체를 검출하기위한 높은 처리량 분석서를 간략하게 설명합니다. 현재 의 혈청 학적 학적 극의 대다수는 감도 또는 그 반대의 경우도 마찬가지에 대한 속도를 희생.

우리의 데이터는 우리의 분석이 모두 민감하고 빠른 응답 시간이 있음을 보여줍니다. 높은 HiBiT-RBD 바이오 리포터의 충분한 양을 생산하기 위해, 세포 배양에 대한 준비로 시작합니다. 먼저, 10%의 태아 소 혈청과 1%페니실린 및 연쇄상 구균을 함유한 Dulbecco의 수정된 독수리 배지를 준비하십시오.

그런 다음 37도 의 수조에서 미디어를 따뜻하게하십시오. 생물학적 안전 캐비닛을 켜고 캐비닛 표면을 살균하기 위해 70%에탄올을 사용하십시오. 세포수를 배양하려면 영하 80도 또는 액체 질소에서 꺼내 37도 의 수조에서 해동하십시오.

해동된 세포를 완전한 배지의 최소 10밀리리터와 혼합합니다. 15센티미터 페트리 접시에 세포 현탁액을 피펫하고 접시를 소용돌이치면 세포를 균일하게 분배합니다. 세포 배양 인큐베이터에 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 85~95%로 배치합니다.

공업 수준이 80~90%에 도달할 때까지 현미경하에서 세포를 관찰하고, 매체를 제거하고, 따뜻한 PBS로 세포를 세척하고, 표면에서 세포를 분리하기 위해 0.25%의 트립신-EDTA의 3~5밀리리터를 추가한다. 약 5 분 후, 현미경의 밑에 세포를 보십시오. 모든 세포가 떠있는 경우, 배지의 적어도 4 밀리리터를 추가하고 새로운 멸균 튜브로 세포 현탁액을 전송합니다.

혈류계를 사용하여 세포를 계산하고 형질을 위해 6 웰 플레이트의 각 우물에 백만 개의 세포를 추가하십시오. HiBiT-RBD 플라스미드의 트랜스페션을 수행하려면 적절한 트랜스펙트 시약으로 HiBiT-RBD 발현 플라스미드의 마이크로그램 1개를 사용하십시오. 실온에서 10~15분 동안 배양한 다음, 플레이트의 각 우물에 총 부피를 드롭와이즈로 추가합니다.

다음 날, 완전한 배지로 트랜스펙트 혼합물을 함유하는 배지를 교체한다. 경질 후 48시간 후에 투명 도제 제어를 잘 관찰한다. 1.5 밀리리터 마이크로튜브에서 상수체를 수집합니다.

셀에 1X 수동 용해 버퍼 또는 PLB의 500 마이크로리터를 추가한 다음, 세포 용해용실온도에서 15분 동안 플레이트를 배양하고 흔들어 줍니다. 다음으로, 루시파아제 분석체를 이용하여 바이오 리포터로부터 발광 신호를 평가하기 위해 먼저 반응 성분을 준비하고 상퍼탄을 바이오 리포터의 원천으로 사용한다. 사용하기 전에 큰 BiT와 기판을 1X로 희석합니다.

각 웰 또는 튜브에서 96웰 플레이트로 50마이크로리터를 옮기고 각 웰에 1X 대형 BiT50 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 5분간 배양하세요. 광미계 소프트웨어를 열고 각 우물에 1X 기판 50 마이크로리터를 추가하고, 접시를 광미계에 놓고 소프트웨어를 실행합니다.

HiBiT-RBD 항체 검출 분석기를 수행하기 위해, 이전에 설명한 대로 HiBiT-RBD 바이오 리포터를 준비하고 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 상용 SARS-CoV-2 RBD 항체의 1마이크로그램과 상전자를 함유한 HiBiT-RBD의 50마이크로리터를 결합한다. 면역글로불린 결합 단백질 또는 단백질 G의 20 마이크로리터를 용액에 추가합니다. PBS를 추가하여 총 볼륨을 300 마이크로리터로 가져옵니다.

튜브 셰이커 또는 회전기에서 튜브를 30분 동안 배양합니다. 원심분리기 는 12, 000 G에서 30초 동안. 그런 다음 상체를 버리고 PBS로 씻으십시오.

프로세스를 세 번 반복하여 무료 HiBiT-RBD를 제거합니다. PBS의 50 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 96 웰 플레이트로 전송합니다. 1X 대형 BiT의 마이크로리터 50기를 추가하고 5분 간 기다립니다.

그런 다음 1X NanoLuc 기판의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 발광계로 발광 신호를 즉시 읽으십시오. 높은 처리량 분석에 대한 HiBiT-RBD 바이오 리포터의 대량을 준비하고 각 샘플에 대한 96 웰의 각 우물에서 HiBiT-RBD 상체의 50 마이크로 리터와 자기 단백질 G20 마이크로 리터를 결합합니다.

각 우물에 혈청 샘플 10 마이크로리터를 추가하고 PBS를 추가하여 총 부피를 150 마이크로리터에 가져옵니다. 실온에서 셰이커에 30분 동안 배양하세요. 그런 다음 단백질 G 항체 복합체를 침전시키기 위해 마그네틱 와셔에 플레이트를 놓습니다.

각 우물의 중간 섹션에서 용액을 버리고 세척을 위해 PBS를 추가하십시오. 초과 HiBiT-RBD를 제거하기 위해 적어도 세 번 세척 단계를 반복하십시오. 1X PBS 50마이크로리터와 1X 대형 BiT50 마이크로리터를 추가하고 실온에서 최소 5분 동안 배양합니다.

발광계 소프트웨어를 준비합니다. 그런 다음 1X 기판의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 접시를 기계에 놓고 소프트웨어를 실행하고 신호를 기록합니다.

빈 우물에서 혈청 샘플, 제어 샘플 및 배경 신호에서 신호를 비교합니다. 전감염된 세포의 세포 용해 및 상수체를 함유하는 HiBiT-RBD 모두에서 신호는 적절한 단백질 공급원을 평가하기 위해 기록되었다. 이 데이터는 두 부품을 결합했을 때 강한 신호에 비해 낮은 배경을 보였다.

단백질 G의 첨가는 항체 강수량을 돕습니다. 분석체는 시판되는 SARS-CoV-2 중화 항체로부터의 신호를 대조군 IgG와 비교하는 데 사용되었다. 특정 항체 신호는 견고했고, 대조체 항체는 발광 배경 수준에 가까웠다.

재조합 은용성 성구 구내염 바이러스 또는 VSV가 외인성 RBD를 발현하는 M 단백질의 위치 51에서 돌연변이를 가진 것으로 암축하여 마우스를 예방 접종하는 데 사용하였다. 예방 접종 된 마우스에서 수집 된 혈청은 대조군 VSV를 주입 한 마우스에서 신호가없는 것과 비교하여 견고한 신호를 생산했습니다. 이 프로토콜은 환자 혈청 샘플에서 SARS-CoV-2 항체의 검출을 위해 사용될 수 있다.

단백질 G로 배양후의 세척 단계는 배경을 줄이는 데 중요합니다. 또한 신호 손실을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 기판을 추가하는 것이 중요합니다. 몇 가지 추가 최적화 단계를 통해 동일한 분석체를 사용하여 혈액 샘플을 분석할 수 있으며 환자 혈액 샘플에서 항 SARS-CoV-2 항체를 결정하는 효과적인 방법이 될 수 있다.