Name: HiBiT 기반 바이오 리포터를 사용하여 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 항체 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 배우세요 HiBiT 기반 바이오 리포터를 활용한 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 항체 고감도 검출 방법을. 환자 혈청 샘플에서 신속하고 정확하게 항체를 분석하는 고처리량 분석 기법을 익혀보세요.

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우리는 샤오홍 허, 리카르도 마리우스, 줄리아 페트리크, 브래들리 오스틴, 크리스티안 타네즈 데 수자의 기술 적 도움을 주셔서 감사합니다. 그래픽 디자인에 대한 미나 가레마니에게도 감사드립니다. 우리는 또한 이 연구 결과에 참가하고 그들의 혈액 견본을 기증한 모든 개별에게 감사하고 싶습니다. DWC는 uOttawa 학부 및 의학과에 의해 부분적으로 지원됩니다.

참고: 아래에 설명된 프로토콜은 프로토콜 코드 20200371-01H에 따라 모든 윤리 지침을 준수합니다.
1. HiBiT-RBD 바이오 리포터의 생산 및 평가
<ol><li>HiBiT-RBD 바이오 리포터의 충분한 수량 생산<ol>
<li>세포 배양 준비<ol>
<li>10% 태아 소 혈청과 1% 페니실린/연쇄상 구균을 함유한 DMEM(DMEM)을 완성하십시오. 그런 다음, 37 °C 수조에서 미디어를 따뜻하게.</li>
			<li>생물학적 안전 캐비닛(BSC)을 켜고 캐비닛 표면을 살균하기 위해 70% v/v 에탄올을 사용한다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>세포줄을 배양합니다.<ol>
<li>-80°C 또는 액체 질소로부터 세포줄을 꺼내 37°C 수조에서 해동하십시오. 참고: 적절한 세포주 배양에서 유지 하기 쉽고, 높은 형질 효율을 가지고 있으며, 외인 성 단백질 생산에 적합 합니다. 인간 배아 신장, HEK293 세포는 이 프로토콜을 위해 사용되었다.</li>
			<li>해동된 세포를 완전한 배지의 최소 10mL와 혼합하고, 셀 현탁액을 10cm 페트리 접시에 피펫하고, 접시에 세포를 균일하게 분배하기 위해 플레이트를 소용돌이시다. 37°C, 5% CO2 및 85-95% 습도의 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓습니다.</li>
			<li>결합 수준이 80-90 %에 도달 할 때까지 현미경의 밑에 세포를 관찰하십시오. 높은 인플루언서에서, 매체를 제거하고, 따뜻한 인산염 완충식식염(PBS)으로 세포를 세척하고, 0.25% 트립신-에틸렌디아민 테트라아세산 1mL를 추가하여 표면으로부터 세포를 분리한다. 참고: HEK293 세포는 상당히 쉽게 분리됩니다. 따라서, 세척 단계는 우발적 인 분리 및 세포의 손실을 방지하기 위해 매우 부드럽게 수행해야합니다.</li>
			<li>약 5 분 후, 현미경의 밑에 세포를 보십시오. 모든 세포가 떠있는 경우, 적어도 4 mL의 배지를 추가하고, 새로운 멸균 튜브로 세포 현탁액을 전송합니다. 혈류계를 사용하여 세포를 계산하고, 1 × 106 세포를 6웰 플레이트의 각 웰에 추가하여 형질을 합니다. 참고: 24시간 이후에는 세포가 80% 이상 부유해야 합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>HiBiT-RBD 플라스미드의 트랜스페트<ol>
<li>적절한 경질 시약과 함께 HiBiT-RBD 발현 플라스미드의 1 μg를 사용하십시오. 실온에서 10-15 분 동안 배양 한 다음 접시의 각 우물에 총 부피를 드롭 와이즈로 추가합니다. 참고: 제조업체의 트랜스페션 프로토콜을 따릅니다. 이 경우, DMEM을 가진 형질산 시약의 혼합물(지정된 양)을 DMEM에서 희석된 플라스미드(1 μg)에 첨가하였다( 재료의 표 참조). 피감(예를 들어, 녹색 형광 단백질 [GFP])을 함유하는 마커를 피의자 시동 효율을 모니터링하는 대조군으로 사용한다.</li>
			<li>다음 날, 완전한 배지로 트랜스펙트 혼합물을 함유하는 배지를 교체한다. 형질 전환 후 48h의 경질 제어를 잘 관찰한다. 참고: 트랜스펙트가 긍정적이고 효율적인 경우(80% GFP 양성) 세포는 HiBiT-RBD 바이오 리포터를 수확할 준비가 되어 있어야 합니다. 이 구조에는 또한 총 상수 대신 정제 된 단백질을 얻는 데 사용할 수있는 His-tag가 포함되어 있습니다.</li>
			<li>1.5 mL 마이크로튜브에서 상수체를 수집합니다. 셀에 1x 수동 리시스 버퍼(PLB)의 500 μL을 추가합니다. 감양 하 고 셀 용 해 비에 대 한 실온에서 15 분 동안 접시를 흔들어. 참고: 상체 및 용액은 -20°C에서 보존할 수 있으며, 최소 6개월 동안 약간의 무결성 손실을 볼 수 있습니다. Azad et al.22에 따르면, 리포터는 광범위한 pH(4-12) 및 온도(4-42°C)에서 안정적입니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>루시파라제 분석에 의한 바이오 리포터로부터의 발광 신호 평가<ol>
<li>반응 구성 요소 준비<ol>
<li>상체를 바이오 리포터의 원천으로 사용하십시오. 참고: 상피와 용해는 HiBiT-RBD 바이오 리포터를 포함하고 있으며 분석에 사용할 수 있습니다. 그러나, 상체는 다음 노트에 설명 된 이유로 인해 소스로 권장됩니다.</li>
			<li>사용 전에 LgBiT및 기판을 1배로 희석합니다(재고 농도는 100배). 참고: LgBiT에 대한 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.</li>
		</ol>
</li>
		<li>루시파라제 분석<ol>
<li>각 우물 또는 튜브에서 96웰 플레이트로 상체의 50 μL을 옮기고 각 웰에 1x LgBiT의 50 μL을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 배양하십시오.</li>
			<li>루미노미터 소프트웨어를 열고 각 우물에 1배 기판(furimazine)의 50μL을 추가하고, 플레이트를 발광계에 놓고 소프트웨어를 실행합니다. 참고: 신호 측정 전에 활성 효소에 의한 기판의 소비를 방지하기 위해 플레이트를 읽기 직전에 기판을 추가합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 빠르고 민감한 분석으로 반 RBD 항체 검출
<ol><li>HiBiT-RBD 항체 검출 분석<ol>
<li>프로토콜의 섹션 1.1에 설명된 대로 HiBiT-RBD 바이오 리포터를 준비합니다. 참고 : 다음 분석에 상체를 사용하는 것이 좋습니다. 더욱이, lysate는 HiBiT-RBD 항체 상호 작용을 방해할 수 있는 몇몇 그밖 단백질이 있습니다.</li>
		<li>HiBiT-RBD 함유 슈퍼상체 50μL을 1.5mL 마이크로튜브에 상용 SARS-CoV-2-RBD 항체의 1 μg와 결합합니다. 용액에 면역글로불린 결합 단백질(단백질 G)의 20μL를 추가합니다. PBS를 추가하여 총 부피를 300 μL로 끌어올수 있습니다. 참고: 혼합물의 총 부피는 150μL로 감소될 수 있다.</li>
		<li>튜브 셰이커 또는 회전기에서 튜브를 30분 동안 배양합니다. 원심분리기는 12,000g 의 × 30초, 상체를 버리고 PBS로 세척합니다. 프로세스를 세 번 반복하여 무료 HiBiT-RBD를 제거합니다. PBS의 50 μL에서 다시 중단하고 96웰 플레이트로 옮김합니다.</li>
		<li>1x LgBiT의 50 μL을 추가하고 5 분 기다립니다. 그런 다음 1x NanoLuc 기판의 50 μL을 추가합니다. 발광계로 발광 신호를 즉시 읽으십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 환자 혈청 샘플에서 SARS-CoV-2 특이적 항체의 높은 처리량 검출
<ol><li>프로토콜의 섹션 1.1을 따라 고처리량 분석에 대한 HiBiT-RBD 바이오 리포터의 대량을 준비합니다.</li>
	<li>각 시료에 대해 96웰 플레이트의 우물에 HiBiT-RBD 상체의 50 μL과 자기 단백질 G 20 μL을 결합합니다. 각 우물에 혈청 샘플의 10 μL을 추가하고 PBS를 추가하여 총 부피를 150 μL로 올릴 수 있습니다. 참고: 2.1.2 단계에서 설명된 바와 같이 비특이적 IgG(음의 대조군) 및 중화 SARS-CoV-2 항체(양성 대조군)를 모두 사용한다. 더욱이, 예방 접종된 마우스로부터의 혈청 샘플도 항체에 대해 평가될 수 있다. 이 시험에서, 혈청 견본은 승인된 절차 및 개별에게서 통보된 동의에 따라 오타와 병원 종합 캠퍼스에서 얻어졌습니다.</li>
	<li>실온에서 셰이커에 30분 동안 배양하십시오. 단백질 G-항체 복합체를 침전시키기 위해 마그네틱 와셔에 플레이트를 놓습니다. 참고: 자기 와셔의 특정 구조는 각 우물의 측면 벽에 있는 복합체를 침전시합니다.</li>
	<li>각 우물의 중간 부분에 용액을 버리고 PBS를 추가하여 세척합니다. 초과 HiBiT-RBD를 제거하기 위해 적어도 세 번 세척 단계를 반복하십시오. 1x PBS 50 μL과 1x LgBiT의 50 μL을 추가합니다. 실온에서 최소 5분 동안 배양하십시오.</li>
	<li>발광계 소프트웨어를 준비한 다음 1배 기판의 50 μL을 추가합니다. 접시를 컴퓨터에 놓고 소프트웨어를 실행하고 신호를 기록합니다. 혈청 샘플, 제어 샘플 및 배경(빈 우물)의 신호를 비교합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

SARS-CoV-2에 감염된 사람들의 증가와 글로벌 예방 접종을 위한 지속적인 노력은 대규모 혈청 조사에서 사용될 수 있는 민감하고 빠른 혈청학 시험을 필요로 합니다. 최근 연구에 따르면 나노루시피파아제 계 바이오리포터를 분할하여 이러한 소사를 개발할 수 있습니다. 최근에는 HiBiT-RBD 바이오 리포터를 개발하여 빠르고 신뢰할 수 있는 방식으로 환자 혈청에서 SARS-CoV-2 특이적 항체를 검출하는 데 사용할 수 있는 테스트를 설계했습니다(도 4C).
이 분석서에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 시스템의 효율성은 RBD 단백질 발현에 따라 달라지므로 단백질 수준은 서부 블로팅에 의해 검증되어야 합니다. 더욱이, RBD에 대한 상용 항체, 및 음의 대조군 항체와 같은 양성 대조군을 사용해야 한다. Nanoluciferase 단백질의 추가는 생물 발광 검출을 위한 긍정적인 통제로 이용될 것을 추천합니다. 단백질 제품에는 ...

새로운 코로나바이러스, SARS-CoV21의 최근 출현은 20212년 3월 30일 현재 2,800,000명 이상의 사망자와 1억 2,800만 건의 감염을 일으켰습니다. SARS-CoV-2 임상 치료에 대한 신뢰할 수 있고 잘 확립된 치료 절차의 부족으로 인해, 효과적이고 강력한 치료 또는 백신3을 개발하기 위해 더 많은 바이러스 전달및 더 중요한 것은 많은 노력을 하고있다. 현재까지 세계보건기구(WHO4)가 보고한 임상시험에서 50명 이상의 COVID-19 백신 후보가 있습니다. SARS-CoV-2에 대하여 항체의 검출은 COVID-195의 복구한 환자에서 뿐만 아니라 백신의 행정에 유머 반응의 장기적인 안정성을 결정하는 것이 가장 중요합니다. 일부 연구는 SARS-CoV-2 환자가 1 년 5,6,7,8,9 후에 RBD 결합 항체의 대부분을 분실할 가능성이 있다는 것을 보여주었습니다. 지속적인 면역을 더 잘 이해하기 위해서는 추가 조사가 필요하며, 보다 민감한 항체 검출 플랫폼은 그러한 작업을 더 많이 도울 수 있습니다. 장기 항체 반응을 건의하는 온화한 SARS-CoV-2 감염의 지속적인 면제의 보고는 또한 연구 결과의 흥미롭고 가치 있는 지역입니다. 빠르고 정확한 검출 방법은 개체의 세라에서 항체를 모니터링하여 인구 내 면역에 대한 자세한 정보를 제공하는 데 필수적입니다.
다른 코로나바이러스와 마찬가지로 SARS-CoV-2는 튀어나온 스파이크 당단백질을 사용하여 안지오텐신 변환 효소-2(ACE2)에 결합하여 바이러스 및 세포막6,7의 융합으로 이어지는 일련의 이벤트를 시작합니다. 몇몇 연구 결과는 최근에 SARS-CoV28,9,10,11에 대하여 강력하고 특정 항체 반응을 유도에 있는 중요한 역할을 하는 스파이크 단백질의 RBD를 증명했습니다. 특히, Premkumar 외에서 관찰된 상관관계는 RBD 결합 항체와 SARS-CoV-2 중화 능력 사이의 환자 혈장의 면역원성 구획인 RBD와 일치한다9. 이를 염두에 두고 SARS-CoV-2 항체 검출에 사용할 수 있는 많은 진단 테스트는 시간과 비용 집약적이며, 인큐베이션 및 세척의 긴 절차가 필요하거나(효소 연계 면역 소르벤트 분석[ELISA]), 또는 감도 및 정확도 부족(측면 흐름 면역분석술[LFIA])12. 따라서, 고감도, 빠른 반응 및 상대적으로 낮은 비용으로 COVID-19 유래 항체 검출의 정량적이고 신속한 상보적 세로로지컬 방법은 SARS-CoV-2 역학 감시를 위한 신뢰할 수 있는 혈청학적 검사의 필요성을 제공할 것이다.
총체적으로, 현재 의 혈청 분석의 한계는 미래 혈청 조사에서 잠재적인 진단 에이전트로 생물 발광 보고 시스템의 조사를 자극했습니다. 생물 발광은 광 방출과 함께 자연적으로 발생하는 효소 / 기질 반응입니다. 나노루크 루시파라제는 가장 작은(19kDa)이지만 레닐라와 반딧불 루시파라제(각각 36kDa, 61kDa)에 비해 가장 밝은 시스템입니다.13,14. 또한, Nanoluc는 이전에 언급 된 시스템 중 노이즈 비율및 안정성에 가장 높은 신호가 있습니다. Nanoluc의 높은 신호 강도는 매우 낮은 양의 리포터 fusions15의 검출을 지원합니다. 나노 루크 바이너리 기술 (나노 BiT)는 나노 루크 시스템의 분할 버전입니다, 이는 두 부분으로 구성되어 있습니다: 작은 BiT (11 아미노산; SmBiT) 및 상대적으로 낮은 친화성 상호 작용 (KD = 190 μM)를 가진 대형 BiT (LgBiT)는 발광 복합체를 형성한다16. NanoBiT는 단백질-단백질 상호 작용15,17,18,19 및 세포 신호 경로11,20,21의 식별을 포함하는 다양한 연구에서 광범위하게 사용됩니다.
최근에는 SmBiT 대신 HiBiT 나노 글로 시스템, 즉 LgBiT(KD = 0.7 nM)에 명백히 높은 친화력을 가진 또 다른 소형 펩타이드가 도입되었다. 나노 글로의 높은 친화력과 강한 신호 "추가 혼합 읽기" 분석으로 HiBiT는 적합하고 정량적이며 발광 펩타이드 태그가 됩니다. 이러한 접근법에서 HiBiT 태그는 최소한의 구조적 간섭을 부과하는 구조를 개발하여 표적 단백질에 추가됩니다. HiBiT-protein fusion은 LgBiT 대응에 적극적으로 결합하여 검출 시약의 존재에서 검출 가능한 생체 발광을 생성하는 고활성 루시파아제 효소를 생성합니다(도 1). 유사하게, 우리는 SARS-CoV-2 회수 개인의 세라에서 중화 항체 티터를 쉽게 측정하는 HiBiT 나노 글로 계의 시스템을 개발하고 최근에 HiBiT 태그 SARS-CoV-2 RBD를 개발했다. 이 논문은 표준 실험실 절차 및 장비를 사용하여 HiBiT-RBD 바이오 리포터를 생산하기위한 프로토콜을 설명하고, 이 바이오 리포터가 SARS-CoV-2 RBD 표적화 항체를 검출하기 위해 빠르고 효율적인 분석에서 어떻게 사용될 수 있는지 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>5x 패시브 용해 버퍼</td><td>Promega</td><td>E194A</td><td>30 mL</td></tr><tr><td>Bio-Plex 휴대용 마그네틱 세척기</td><td>Bio-Rad</td><td>171020100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo luciferase Assay System</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td>100 mL kit</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HiBiT-RBD Plasmid</td><td></td><td></td><td>gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgtgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgtgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgcgcgattgattgattattgactagttattaatgt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaacaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta 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catttccgaaaagtgccacctgacgtc</td></tr><tr><td>LgBiT</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88848</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td><td>Signagen</td><td>SL100688.5</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) 스파이크 중화 항체, 마우스 Mab</td><td>SinoBiological</td><td>40592-MM57</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Mx Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>96-well plate reader luminometer</td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>써모 피셔 사이언티픽</td><td>2520056</td><td>0.25%</td></tr></tbody></table>

hibit 기반 바이오 리포터를 사용하여 sars-cov-2 수용체 결합 도메인 항체 검출

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

COVID-19 전염병의 출현은 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2 (SARS-CoV-2)의 역학적 영향을 결정하기 위해 더 나은 혈청 학적 검출 방법의 필요성을 증가시켰습니다. SARS-CoV-2 감염의 증가 수는 더 나은 항체 탐지 소의를 위한 필요를 제기합니다. 현재 항체 검출 방법은 속도에 대한 감도를 손상시키거나 민감하지만 시간이 많이 걸립니다. SARS-CoV-2 중화 항체의 큰 비율은 SARS-CoV-2의 1차 면역원체 구획 중 하나인 수용체 결합 도메인(RBD)을 표적으로 한다. 우리는 최근에 SARS-CoV-2 항체를 검출하기 위하여 고과민한 생물 발광 태그 RBD (NanoLuc HiBiT-RBD)를 설계하고 개발했습니다. 다음 텍스트는 HiBiT-RBD 복합체를 생성하는 절차와 이 도구를 사용하여 RBD 표적화 항체의 존재를 평가하는 빠른 분석방법을 설명합니다. HiBiT-RBD 단백질 생성물의 내구성과 1시간 이내에 완료할 수 있는 실험 절차가 짧기 때문에, 이 프로토콜은 환자 혈청 시료에서 SARS-CoV-2 항체를 검출하는 보다 효율적인 대안으로 간주될 수 있다.

HiBit-RBD 함유 세포 용해 및 전월체로부터의 신호(도 2)가 기록되어 적절한 단백질 공급원을 평가하였다. HiBiT-RBD와 LgBit는 별도로 컨트롤로 사용되었으며, 두 부분이 결합되었을 때 데이터가 강한 신호에 비해 낮은 배경을 보였습니다. 따라서, LgBiT와의 HiBiT-RBD 상호 작용은 기질 소화 및 생물 발광 활성을 위한 활성 효소를 생성하기 위해 필요하다(도 1).
단백질 G의 첨가는 항체 강수량에 도움이 될 것입니다 (도 3). 분석체는 시급SARS-CoV-2 중화 항체로부터의 신호를 대조군 IgG와 비교하는 데 사용되었다. 특정 항체 신호는 견고했고, 대조체 항체는 발광 배경 수준에 가까웠다(도 4A). 재조합 감쇠 된 종양용용성 성세포 구내염...

설명된 프로토콜은 HiBiT 수용체 결합 도메인 단백질 복합체를 생성하고 SARS-CoV-2 항체의 빠르고 민감한 검출을 위한 그것의 응용을 생성하기 위한 절차를 기술합니다.

HiBiT 기반 바이오 리포터를 사용하여 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 항체 검출

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

내 실험실은 COVID-19 연구에서 일하고 있다, 우리는 최근에 우리가 빠르고 정확하게 SARS-CoV-2 항체를 검출할 수 있는 새로운 분석서를 개발했습니다. 이 프로토콜은 현재 전염병을 감안할 때 중요한 환자 혈청 샘플에서 항 SARS-CoV-2 항체를 검출하기위한 높은 처리량 분석서를 간략하게 설명합니다. 현재 의 혈청 학적 학적 극의 대다수는 감도 또는 그 반대의 경우도 마찬가지에 대한 속도를 희생.우리의 데이터는 우리의 분석이 모두 민감하고 빠른 응답 시간이 있음을 보여줍니다. 높은 HiBiT-RBD 바이오 리포터의 충분한 양을 생산하기 위해, 세포 배양에 대한 준비로 시작합니다. 먼저, 10%의 태아 소 혈청과 1%페니실린 및 연쇄상 구균을 함유한 Dulbecco의 수정된 독수리 배지를 준비하십시오.그런 다음 37도 의 수조에서 미디어를 따뜻하게하십시오. 생물학적 안전 캐비닛을 켜고 캐비닛 표면을 살균하기 위해 70%에탄올을 사용하십시오. 세포수를 배양하려면 영하 80도 또는 액체 질소에서 꺼내 37도 의 수조에서 해동하십시오.해동된 세포를 완전한 배지의 최소 10밀리리터와 혼합합니다. 15센티미터 페트리 접시에 세포 현탁액을 피펫하고 접시를 소용돌이치면 세포를 균일하게 분배합니다. 세포 배양 인큐베이터에 접시를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 85~95%로 배치합니다.공업 수준이 80~90%에 도달할 때까지 현미경하에서 세포를 관찰하고, 매체를 제거하고, 따뜻한 PBS로 세포를 세척하고, 표면에서 세포를 분리하기 위해 0.25%의 트립신-EDTA의 3~5밀리리터를 추가한다. 약 5 분 후, 현미경의 밑에 세포를 보십시오. 모든 세포가 떠있는 경우, 배지의 적어도 4 밀리리터를 추가하고 새로운 멸균 튜브로 세포 현탁액을 전송합니다.혈류계를 사용하여 세포를 계산하고 형질을 위해 6 웰 플레이트의 각 우물에 백만 개의 세포를 추가하십시오. HiBiT-RBD 플라스미드의 트랜스페션을 수행하려면 적절한 트랜스펙트 시약으로 HiBiT-RBD 발현 플라스미드의 마이크로그램 1개를 사용하십시오. 실온에서 10~15분 동안 배양한 다음, 플레이트의 각 우물에 총 부피를 드롭와이즈로 추가합니다.다음 날, 완전한 배지로 트랜스펙트 혼합물을 함유하는 배지를 교체한다. 경질 후 48시간 후에 투명 도제 제어를 잘 관찰한다. 1.5 밀리리터 마이크로튜브에서 상수체를 수집합니다.셀에 1X 수동 용해 버퍼 또는 PLB의 500 마이크로리터를 추가한 다음, 세포 용해용실온도에서 15분 동안 플레이트를 배양하고 흔들어 줍니다. 다음으로, 루시파아제 분석체를 이용하여 바이오 리포터로부터 발광 신호를 평가하기 위해 먼저 반응 성분을 준비하고 상퍼탄을 바이오 리포터의 원천으로 사용한다. 사용하기 전에 큰 BiT와 기판을 1X로 희석합니다.각 웰 또는 튜브에서 96웰 플레이트로 50마이크로리터를 옮기고 각 웰에 1X 대형 BiT50 마이크로리터를 추가합니다. 실온에서 5분간 배양하세요. 광미계 소프트웨어를 열고 각 우물에 1X 기판 50 마이크로리터를 추가하고, 접시를 광미계에 놓고 소프트웨어를 실행합니다.HiBiT-RBD 항체 검출 분석기를 수행하기 위해, 이전에 설명한 대로 HiBiT-RBD 바이오 리포터를 준비하고 1.5 밀리리터 마이크로튜브에 상용 SARS-CoV-2 RBD 항체의 1마이크로그램과 상전자를 함유한 HiBiT-RBD의 50마이크로리터를 결합한다. 면역글로불린 결합 단백질 또는 단백질 G의 20 마이크로리터를 용액에 추가합니다. PBS를 추가하여 총 볼륨을 300 마이크로리터로 가져옵니다.튜브 셰이커 또는 회전기에서 튜브를 30분 동안 배양합니다. 원심분리기 는 12, 000 G에서 30초 동안. 그런 다음 상체를 버리고 PBS로 씻으십시오.프로세스를 세 번 반복하여 무료 HiBiT-RBD를 제거합니다. PBS의 50 마이크로 리터에서 세포를 다시 중단하고 96 웰 플레이트로 전송합니다. 1X 대형 BiT의 마이크로리터 50기를 추가하고 5분 간 기다립니다.그런 다음 1X NanoLuc 기판의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 발광계로 발광 신호를 즉시 읽으십시오. 높은 처리량 분석에 대한 HiBiT-RBD 바이오 리포터의 대량을 준비하고 각 샘플에 대한 96 웰의 각 우물에서 HiBiT-RBD 상체의 50 마이크로 리터와 자기 단백질 G20 마이크로 리터를 결합합니다.각 우물에 혈청 샘플 10 마이크로리터를 추가하고 PBS를 추가하여 총 부피를 150 마이크로리터에 가져옵니다. 실온에서 셰이커에 30분 동안 배양하세요. 그런 다음 단백질 G 항체 복합체를 침전시키기 위해 마그네틱 와셔에 플레이트를 놓습니다.각 우물의 중간 섹션에서 용액을 버리고 세척을 위해 PBS를 추가하십시오. 초과 HiBiT-RBD를 제거하기 위해 적어도 세 번 세척 단계를 반복하십시오. 1X PBS 50마이크로리터와 1X 대형 BiT50 마이크로리터를 추가하고 실온에서 최소 5분 동안 배양합니다.발광계 소프트웨어를 준비합니다. 그런 다음 1X 기판의 50 마이크로 리터를 추가합니다. 접시를 기계에 놓고 소프트웨어를 실행하고 신호를 기록합니다.빈 우물에서 혈청 샘플, 제어 샘플 및 배경 신호에서 신호를 비교합니다. 전감염된 세포의 세포 용해 및 상수체를 함유하는 HiBiT-RBD 모두에서 신호는 적절한 단백질 공급원을 평가하기 위해 기록되었다. 이 데이터는 두 부품을 결합했을 때 강한 신호에 비해 낮은 배경을 보였다.단백질 G의 첨가는 항체 강수량을 돕습니다. 분석체는 시판되는 SARS-CoV-2 중화 항체로부터의 신호를 대조군 IgG와 비교하는 데 사용되었다. 특정 항체 신호는 견고했고, 대조체 항체는 발광 배경 수준에 가까웠다.재조합 은용성 성구 구내염 바이러스 또는 VSV가 외인성 RBD를 발현하는 M 단백질의 위치 51에서 돌연변이를 가진 것으로 암축하여 마우스를 예방 접종하는 데 사용하였다. 예방 접종 된 마우스에서 수집 된 혈청은 대조군 VSV를 주입 한 마우스에서 신호가없는 것과 비교하여 견고한 신호를 생산했습니다. 이 프로토콜은 환자 혈청 샘플에서 SARS-CoV-2 항체의 검출을 위해 사용될 수 있다.단백질 G로 배양후의 세척 단계는 배경을 줄이는 데 중요합니다. 또한 신호 손실을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 기판을 추가하는 것이 중요합니다. 몇 가지 추가 최적화 단계를 통해 동일한 분석체를 사용하여 혈액 샘플을 분석할 수 있으며 환자 혈액 샘플에서 항 SARS-CoV-2 항체를 결정하는 효과적인 방법이 될 수 있다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

그런가에 대한 정량, 높은 처리량, 실시간 및 레이블이없는 biomolecular 감지 (DNA, 단백질...

Interferometric 반사율 이미징 센서 (IRIS)를 채용 Biomolecular 감지

이 동영상은 루시페라아제 태그가 지정된 단백질을 정량화하는 데 사용되는 루시페라아제 분석을 보여줍니다. 이 분석은 관심 단백질과 접합된 작은 단편과 결합하는 큰 단편으로 구성된 엔지니어링된 루시페라아제 효소를 사용합니다. 결합된 소단위체는 기질이 있을 때 발광 신호를 방출하는 활성 효소를 형성합니다. 그런 다음 이 신호는 광도계를 사용하여 정량화됩니다.

Luciferase Assay: 엔지니어링된 Nanoluciferase 시스템 기반 바이오리포터를 사용하여 발광 신호를 측정하는 고처리량 분석

이 비디오에서는 SARS-CoV-2 중화 항체를 검출하기 위한 HiBit-RBD 바이오리포터 시스템 기반 분석을 보여줍니다. 이 시스템은 RBD 도메인에 융합된 HiBiT를 포함하는 생물 발광 리포터 시스템을 사용하여 바이러스 RBD 도메인을 표적으로 합니다.

Bioreporter Assay: SARS-CoV-2 항체를 검출하기 위해 생물발광 리포터 시스템을 사용하는 민감한 기술

여기서 설명된 프로토콜은 스파이크 당단백질로 의사형인 향상된 녹색 형광 단백질 표지 된 정맥낭염 바이러스에 의해 감염을 억제하는 병류 혈청 샘플의 능력을 평가함으로써 SARS-CoV-2 스파이크 단백질에 대한 중화 항체를 측정하는 빠르고 효과적인 방법을 설명합니다.

의사 바이러스 감염의 높은 처리량 형광 화상 진찰을 사용하여 SARS-CoV-2 중화 항체의 검출

2리포터 판독값을 제공하는 비드계 멀티플렉스 분석분석을 위한 유량 분석 시스템은 SARS-CoV-2에 대한 중화 IgG 및 IgM 항체를 동시에 측정할 수 있는 멀티플렉스 세론및 항체 중화 분석분석의 개발에 사용되었다.

멀티플렉스 비드 기반 유량 분석 시스템을 위한 신속한 멀티플렉스 듀얼 리포터 IgG 및 IgM SARS-CoV-2 중화 분석

이 프로토콜에서, 재조합 SARS-CoV-2 스파이크에 접합된 양자점은 세포-기반 분석을 가능하게 하여 원형질막에서 hACE2에 대한 스파이크 결합 및 세포질 내로의 결합된 단백질의 후속 엔도사이토시스를 모니터링한다.

HEK293T 세포에서 결합 및 엔도사이토시스를 추적하기 위한 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체의 고처리량 공초점 이미징

이 기사에서는 SARS-CoV-2 감염 또는 백신 접종에 대한 면역 반응으로 인해 발생하는 두 개의 면역글로불린 이소형(IgA, IgM 또는 IgG)에 대한 항체 역가의 동적 변화를 동시에 모니터링하는 편리한 방법을 설명합니다. 이 '다중 분석 물질 Covid-19 면역 반응 패널'은 '이중 채널'기능을 갖춘 흐름 기반 멀티플렉스 리더를 사용하여 판독되는 코딩된 미소 구체를 기반으로 구축된 세 가지 간접 면역 분석법을 사용합니다.

Covid-19에 대한 다중 분석 물질 면역 비드 분석을 사용한 혈청 전환의 동적 모니터링

본 프로토콜은 HA, S 당단백질, 관련 하이브리드형 글리칸 및 고만노스 올리고당에 대한 CV-N 결합을 검사하기 위한 SPR 결합 분석을 위한 새로운 도구를 설명합니다. SPR은 이량체 또는 단량체 CV-N을 이들 글리칸에 결합시키기 위한KD 를 결정하기 위해 사용된다.

표면 플라즈몬 공명을 통한 항바이러스제 엔지니어링

여기에서는 이중 리포터 유세포 분석 시스템을 사용하여 안지오텐신 변환 효소-2 결합 자기 마이크로스피어에 의해 포착된 온전한 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스 입자에서 두 개의 고유한 스파이크 단백질 에피토프를 동시에 검출하는 새로 개발된 다중 형광 면역분석법에 대해 설명합니다.

Multiplex Dual-Reporter Strategy를 통한 바이러스 입자의 표면 단백질 에피토프 프로파일링

우리는 cell-free 합성 생물학의 원리와 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응의 맞춤형 검출을 위한 dot-blot 기술을 기반으로 최근에 개발된 면역분석 플랫폼에 대해 설명합니다.

Cell-free Dot Blot은 인간 및 동물 혈청에서 항체 반응을 검출하기 위한 실용적이고 적응 가능한 면역분석 플랫폼입니다.

배우세요 HiBiT 기반 바이오 리포터를 활용한 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 항체 고감도 검출 방법을. 환자 혈청 샘플에서 신속하고 정확하게 항체를 분석하는 고처리량 분석 기법을 익혀보세요.

HiBiT 기반 바이오 리포터를 사용하여 SARS-CoV-2 수용체 결합 도메인 항체 검출

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