Name: 생체멤브레인 포스 프로브 분광법에 의한 분자 스프링 상수 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 학습하세요 생체멤브레인 포스 프로브(BFP)를 활용한 분자 스프링 상수 측정 방법을. 이 기술은 살아있는 세포에서 단일 분자 결합 역학을 분석하여 세포막 역학에 대한 기계적 정보를 제공합니다.

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도움이 되는 토론을 위한 기요메 트로아데크, 하드웨어 컨설팅을 위한 지하오 왕, 시드니 제조 허브, 그레그 수안닝, 사이먼 링거에게 실험실 스타트업을 지원해 주셔서 감사합니다. 이 작품은 호주 연구 위원회 디스커버리 프로젝트 (DP2000101970 - L.A.J.), NSW 심장 혈관 용량 구축 프로그램 (초기 중간 경력 연구원 그랜트 - L.A.J.), 시드니 연구 가속기 상 (SOAR - L.A.J.), 라마시오에 의해 지원되었다 티 재단 건강 투자 보조금 (2020HIG76 - L.A.J.), 국립 보건 및 의학 연구 위원회 아이디어 보조금 (APP2003904 - L.A.J.), 엔지니어링 시작 기금 및 주요 장비 계획의 시드니 학부 (L.A.J.). 라이닝 아놀드 주 호주 연구 위원회 DECRA 동료입니다 (DE190100609).

1. 분석 가능한 DFS 이벤트를 획득
<ol><li>BFP 제어 및 파라미터설정(그림 S1A)에대한 소프트웨어(예: LabVIEW VI)에서 실험을 시작합니다.</li>
	<li>BFP모니터(도S1B)용소프트웨어에서 반복프로브 비드 표적 비드/셀 터치를 관찰한다.</li>
	<li>DFS 접착 이벤트의 89%≥ 89%가 단일 채권12,13,14에의해 중재되도록 하는 장애력 및 접촉 시간을 조정하여 처음 50터치 내에서 ≤ 접착주파수를 테스트하고달성한다. 참고: 각 비드 셀/비드 쌍에 대해 200번의 반복적인 터치 사이클을 수행합니다. 게시 가능한 데이터 품질을 얻으려면 일반적으로 n ≥ 3 비드 비드 또는 비드 셀 쌍을 수행합니다.<ol>
<li>데이터를 Force 대 Time 의 형태로 각 쌍의 끝까지 사용자 지시 폴더에 저장하여 BFP 제어 및 매개 변수 설정에 대한 소프트웨어의 메시지가 표시됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>BFP 획득플랫폼(도 S1C)을사용하여 도 2A에서예시된 바와 같이 본드 이벤트의 포스 대 시간 원시 데이터를 수집합니다.<ol>
<li>BFP 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다. 노란색 폴더 아이콘을 클릭하고 두 번 클릭하여 해당 원시 데이터 파일을 선택합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>프로그램을 실행한 다음 위쪽 및 아래 쪽 버튼을 클릭하여 이벤트 간에 전환합니다. 이상치 제외기준(그림 S2)을사용하여 잘못된 이벤트를 선별합니다. 내보내기 데이터 형식을 Force 대 시간 형식으로 선택하고 내보내기 플롯 데이터 단추를 클릭합니다.</li>
</ol>2. 포스 대 시간 곡선을 포스 대 변위 곡선으로 변환
<ol><li>리트랙트 단계에 해당하는 데이터 세그먼트를 스프링 상수 분석과 관련된 스프레드시트(그림2A, 정사각형 윤곽)로내보냅니다.</li>
	<li>스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 포스 대 시간 곡선을 플롯합니다. 포스 대 변위 곡선을 얻으려면 시간값(그림 2A,x-축)을 압조 이동 속도(예: 4,000 nm/s)로 시간 값을 배합하여 총 변위 값(Δx tot)으로변환합니다.</li>
	<li>획득한 각 변위 값에서 가장 작은 변위 값을 빼서 첫 번째 데이터 점을 0으로 설정합니다. 이 수평 변환은 Retract 단계의 상승 하는 경사 또는 후속 스프링 상수 계산에 영향을 주지 않습니다.</li>
	<li>특히, BFP는 RBC, ΔxRBC(표 1),분자 결합, Δxmol(표 1), 및 표적 셀, Δ x셀(표 1), Eq.2의 Δxtot(표 1)합계 변형이 있는 직렬 스프링 시스템으로 간주됩니다. <img alt="정적 평형 방정식 Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell, 수학 공식." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> (Eq. 2)</li>
	<li>도 2B에도시된 바와 같이포스(F)대 변위(Δ xtot)곡선을 플롯한다.</li>
</ol>3. 비드 셀 모드의 봄 Cnstant 분석
<ol><li>포스 대 변위 곡선에서는 각각 압축 상과 인장 상을 나타낼 수 있는 두 개의 뚜렷한 슬롭을 식별할 수 있습니다. 각 데이터그룹(도 2B)에회귀 선을 맞춥시면, 더 큰 선형 맞춤 경사가 압축 상에서 총 스프링 상수를 나타내는 경우(도2B, 빨간색), k1(표 1)으로표시됨); 그리고 더 작은 선형 맞춤 경사는 텐슬리상(도 2B,파란색)에서 총 스프링 상수를 나타내며( 도 2B, 파란색),k2(표 1)로기음부된다. </li>
	<li>단계 당 계열로 연결된 스프링의 경우 2.2 설명, 총 스프링 상수,k토트(표 1)의상호계를 RBC, kRBC(표 1), 분자 결합, k몰(표 1),및 표적 셀,K셀(표 1)의합으로 표현한다. 비드 셀 모드의 압축 단계 동안 분자 결합이 늘어나지 않으므로 k몰을 고려하지 않습니다. 이 시나리오에서 K 토트의 상호(1/k1)가표현됩니다. <img alt="생물학에서 세포 동역학을 나타내는 방정식; 운동 상수 다이어그램: k1, kRBC, kcell." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3"> (Eq. 3). 예제 데이터에서 kRBC는 미리 결정됩니다(기본적으로 0.25 pN/nm). k셀은 획득된 k1 및 k RBC(도 3B)를가진 Eq. 3로부터 유래될 수 있다.</li>
	<li>인장 단계 동안, 리간드 수용체 쌍 사이에 접착력이 형성된다. 이 시나리오에서 K토트의 상호를 표현 (1/k2) <img alt="동역학 연구에 사용되는 1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcell을 보여주는 직렬 저항 방정식." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"> (Eq. 4) 여기서 k2 (표 1)는인장 상시 총 스프링 상수를 나타낸다.</li>
	<li>1/k2에서 1/k1을 빼는 k몰을 파생시킵니다(Eq. 3 대 Eq. 4를 비교).</li>
</ol>4. 비드 비드 모드의 봄 상수 분석
<ol><li>회귀 선을 압축 상 데이터에 맞게 k 1을 얻습니다(도 2B, 빨간색과유사). 참고로, 비드-비드 모드에서, 대상 셀은 관심 수용체로 코팅된 유리 비드로 대체된다(도1C). 비드 변형은 무시할 수 있기 때문에,1/k세포 용어는 Eq. 3 및 Eq. 4에서 그에 따라 제거될 수 있다. 압축 상(1/k1)의상호 K토트는 다음과 같이 표현될 수 있다. <img alt="관계를 보여주는 방정식: 1/k1 = 1/kRBC; 생화학 분석에서 운동 속도 상수의 핵심입니다." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> (Eq. 5)</li>
	<li>회귀 선을 인장 상 데이터에 맞추어 k2(도 2B, 파란색과유사)를 얻습니다. 인장 상(1/k2)의 상호 k토트는 다음과 같이 표현될 수 있다. <img alt="반응 속도 방정식, 역속도 상수 다이어그램; 동역학 분석을 위한 k2, kRBC, kmol 항." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> (Eq. 6)</li>
	<li>1/k2에서 1/k1을 빼는 k몰을 파생시킵니다(Eq. 5 대 Eq. 6을 비교).</li>
</ol>

<ol><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe%3A+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).</li>
<li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li>
<li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li>
<li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li>
<li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+cell+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li>
<li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580(1995).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li>
<li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+regulated+conformational+change+of+integrin+%CE%B1V%CE%B23%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Force regulated conformational change of integrin αVβ3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+force+spectroscopy+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li>
<li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447(2016).</li>
</ol>

저자는 현재 연구 결과에 관하여 보고하는 경쟁 관심사가 없다고 선언합니다.

요약하자면, 우리는 DFS 원시 데이터를 전처리하고 BFP 비드 비드 및 비드 셀 분석 모드에서 분자 스프링 상수를 도출하기 위한 상세한 데이터 분석 프로토콜을 제공했습니다. 분자 및 세포 스프링 상수를 결정하는 데 필요한 생체 역학 모델 및 방정식이 제시됩니다. 상이한 통합이 연구되고 있기는 하지만, 비드-비드 모드와 비드셀 모드에 의해 측정된 k몰은 상당한 범위 차이를 가지고 있다(도3A 대 도 3C). 참고, 비드 비드 모드와 함께, 수용체는 유리 비드에 공유 연결됩니다. 대조적으로, 비드 셀 모드와 함께, 표면 수용체는 측정 된 k몰에가장 가능성이 영향을 미치는 기본 플라즈마 멤브레인 과 사이토 스켈레톤에 의해 적응된다.
데이터 품질 관리는 재현성을 보장하는 데 매우 중요합니다. 이를 위해 포스 ...

살아있는 세포 DFS 기술로, BFP는 인간 적혈구 (RBC)를 엔지니어; 그림 1) 0.1-3 pN/nm1,2,3의호환 스프링 상수 범위의 초감도 및 튜닝 가능한 힘 트랜스듀서로. 리간드 수용체 상호 작용을 조사하기 위해 BFP는 DFS 측정을 ~1 pN(10-12 N), ~3nm(10-9m), ~0.5ms(10-3s)로, 유효및 측두해상도 4,5에서가능하게 한다. 실험 구성은 프로브와 대상이라는 두 개의 반대 마이크로파이프로 구성됩니다. 프로브 마이크로피펫은 RBC를 흡인하고 비드는 비오틴 스트렙타비딘 상호 작용을 통해 정점에 붙어 있습니다. 비드는 관심의 리간드로 코팅된다(그림 1A). 대상 마이크로피펫은 비드셀(도1B)과비드비드(도1C)모드에 대응하는 관심 수용체를 베어링하는 셀 또는 비드(dad)를흡인한다.
BFP 시공, 조립 및 DFS 실험 프로토콜은 이전에1,6을상세히 기술하였다. 간단히, BFP 터치 주기는 5 단계로 구성되어 있습니다 : 접근, 임프, 접촉, 철회 및 해리(그림 1D). 수평 RBC 정점 위치는 ΔxRBC로표시됩니다. 처음에, 미스트레스(제로포스) RBC 변형 ΔxRBC는 0(표1)이다. 대상은 프로브 비드(그림 1D)에서충돌하고 철회하는 압조 번역기에 의해 구동됩니다. RBC 프로브는 먼저 음수 RBC 변형 ΔxRBC &lt; 0으로 대상에 의해 압축된다. 본드 이벤트에서, 철회 단계는 압축에서 인장 상으로 전환되며, 양성 RBC 변형 ΔxRBC &gt; 0(도2C 및 D). Hooke의 법칙에 따르면, BFP 베어링 힘은 F = kRBC × ΔxRBC로측정할 수있으며, 여기서 kRBC(표 1)는BFP의 RBC 스프링 상수이다. 본드 파열 및 원터치 사이클이 완료되면 프로브 비드는 ΔxRBC = 0(도1D)으로제로 포스 위치로 돌아갑니다.
kRBC를결정하기 위해, 우리는 RBC와 프로브 비드(도1A)사이의프로브 마이크로피펫 내부 오리피스(Rp),RBC(R0)및 원형 접촉영역(Rc)의반을 측정하고 기록한다. 그런 다음 kRBC는 에반의 모델(Eq. 1)7,8에 따라 BP(도S1A)8,9를작동시키는 가상 계측기(VI)역할을 하는 LabVIEW 프로그램을 이용하여 계산된다.
<img alt="유체 역학에서 kRBC에 대한 정적 평형 방정식, 변수 및 로그 항을 보여줍니다." src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> (Eq. 1)
BFP가 확립되고 DFS 원시 데이터가 얻어지므로, 이에 따라 리간드 수용체 쌍 또는 세포의 스프링 상수를 분석하는 방법을 제시한다. DFS 원시 데이터는 글리코처단백질 Thy-1 및 K562 세포 베어링 인테그린 α5 β1(thy-1-α5β1)의상호작용에 관한 것입니다. 도 3A 및 3B)10 및 피브리노겐 및 비드 코팅 인테그린 αIIbβ3 (FGN-αIIbβ3; 도 3C) 11,12는 각각 비드 셀 및 비드-비드 분석 모드를 시연하는 데 사용되어 왔다.
BFP 실험 준비 BFP 실험 준비 및 계측에 대한 자세한 내용은 이전에 게시된 프로토콜3을참조하십시오. 간단히 말해서, 인간 RBC는 탄소/중탄산염 완충제에서 비오틴-PEG3500-NHS를 사용하여 바이오티니징되었습니다. 관심있는 단백질은 인산염 완충제에서 MAL-PEG3500-NHS를 사용하여 보로실리케이트 유리 구슬에 공동으로 결합되었습니다. 생체작 RBC에 부착하기 위해, 프로브 비드는 또한 MAL-SA를 사용하여 스트렙타비딘(SA)으로 코팅된다. 재료 및 표 2의 테이블을 참조하십시오.
BFP(도1, 왼쪽)를조립하기 위해, '도우미'라고 불리는 세 번째 마이크로피펫은 프로브 비드를 전달하고 RBC의 정점1,3에접착제를 붙이는 데 사용됩니다. SA 코팅 프로브 비드와 바이오티니저드 RBC 사이의 공유 상호 작용은 리간드 수용체 의 결합보다 훨씬 강하다. 따라서, 해리시아트 단계는 RBC로부터 프로브 비드의 분리보다는 리간드 수용체 결합 파열로 해석될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>3-메르캅토프로필트리메톡시실란(MPTMS)</td><td>Uct, Specialties, llc</td><td>4420-74-0</td><td>유리 구슬 기능화</td></tr><tr><td>Anhy. 인산나트륨 이염기성(Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>인산염 완충액 준비</td></tr>, <tr><td>BFP 데이터 수집 VI</td>, <td>LabVIEW</td><td></td><td>BFP 제어 및 파라미터 설정</td></tr><tr><td>BFP 데이터 분석 VI</td>, <td>LabVIEW</td><td></td><td>BFP 원시 데이터 분석</td></tr>, <tr><td>Biotin-PEG3500-NHS,</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>RBC 비오틴화</td></tr><tr><td>붕규산 유리 구슬</td><td>Distrilab Particle Technology, 네덜란드</td><td>9002</td><td>유리 구슬 기능화</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>리간드 기능화</td></tr><tr><td>카메라 VI</td><td>LabVIEW</td><td></td><td>BFP 모니터링</td></tr> <tr><td>D-glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>Tyrode ' s 완충액 제제</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode ' s 완충액 제제</td></tr><tr><td>MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>유리 구슬 기능화</td></tr><tr><td>염화칼륨(KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Tyrode' s 완충액 제제</td></tr><tr><td>중탄산나트륨(NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>탄산염/중탄산염 완충액 제제; 티로드' s 완충액 제제</td></tr><tr><td>탄산나트륨(Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>탄산염/중탄산염 완충액 준비</td></tr><tr><td>물 염화나트륨(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Tyrode' s 완충액 제제</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물 (NaH2PO4&bull; H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>인산염 완충액 제</td></tr><tr><td>제 Streptavidin-Maleimide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>유리 구슬 기능화</td></tr></tbody></table>

생체멤브레인 포스 프로브 분광법에 의한 분자 스프링 상수 분석

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

생체멤브레인 힘 프로브(BFP)는 최근 단일 분자 결합 운동학을 측정하고, 리간드 수용체 상호 작용의 기계적 특성을 평가하고, 단백질 동적 형성 변화를 시각화하고, 보다 흥미롭게도 해명 수용체 매개 세포 메카노센싱 메커니즘을 측정할 수 있는 토종 세포 표면 또는 시투 동적 힘 분광법(DFS) 나노툴로 부상했습니다. 최근에는 BFP가 분자 결합의 봄 상수를 측정하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 분자 스프링 상수 DFS 분석을 수행하기 위한 단계별 절차를 설명합니다. 특히 두 개의 BFP 작동 모드, 즉 비드 셀 및 비드 비드 모드에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 DFS 원시 데이터로부터 분자 결합 및 세포의 스프링 상수를 도출하는 데 중점을 둡니다.

이 작품에서, 우리는 BFP 스프링 상수 분석의 프로토콜을 입증했다. 비드 세포 분석 모드의 경우, 프로브 비드상에 코팅된 글리코시드 단백질 Thy-1과 표적 K562 세포(Thy-1-integrin α5β1)에발현된 α5 β1 사이의 분자 결합의 k몰을 분석했다. 그림 3A) 10. k셀은 또한 비드 셀 모드(K562 셀)로부터 유래된다; 그림 3B). 비드 비드 모드의 경우, fibrinogen과 integrin αIIbβ3 (FGN-integrin αIIbβ3사이에 형성된 분자 결합; 도 3C) <...

생체멤브레인 힘 프로브(BFP)는 시투 동적 힘 분광법(DFS) 기술이다. BFP는 살아있는 세포에 분자 상호 작용의 봄 상수를 측정하기 위하여 이용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 BFP에 의해 검출된 분자 결합에 대한 스프링 상수 분석을 제시합니다.

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

이 비디오는 분자 스프링 상수를 측정하기 위해 생체 막 힘 프로브 또는 BFP를 사용하는 단계별 절차를 설명합니다. 힘 프로브에서, BFP는 최근 네이티브 셀 표면 또는 SITU 동적 힘 분광법 분석에서 나타났다. 이 기술의 주요 목표는 결합하는 단일 분자 유전학을 측정하는 것입니다.이 데이터 분석 절차는 간단하지만 강력한 메시지이며 분자를 표현하는 세포막의 동적 힘과 염증, 특히 기계적 정보를 제공합니다. BFP 실험 주기 동안, 프로브 미생물군유전체는 적혈구 및 유언 검인, 표적 세포 및 프로브와 표적 사이의 리간드 수용체 분자 결합을 결합하는 계열 연결된 뇌 시스템으로 간주될 수 있다. Hooke의 법칙에 따라, 계열 커넥티드 스프링 시스템의 총 스프링 상수의 상호는 방정식이 보여주는 바와 같이 각 단일 구성 요소의 역 스프링 상수의 합과 같습니다.적혈구의 스프링 상수는 오리피스내의 프로브 마이크로피펫의 방사형에 의존하는 이벤트 모션을 기반으로 계산됩니다. 적혈구, 적혈구와 유언 검인 및 마이크로 파이펫 흡입 압기 사이의 원형 접촉 영역. BFP 도로 데이터는 PA 번역기에 의해 대상 마이크로 파이펫의 움직임을 제어하는 홈메이드 왼쪽 뷰 가상 계측기에 의해 얻어진다.전체 PFP 터치 주기는 5단계로 구성됩니다. 접근 방식.Impinge.Contact. 철회 및 해리. 처음에는 로부도 APICS 위치가 X가 검은 색 디샤인 0과 같기 때문에 표시되는 것을 강조합니다.대상은 다음 에 충돌하고 부정적인 유언 검인 움직임을 일으킬 로브도 압축 조각이나 번역기에 의해 구동된다. 빨간색 대시 라인에서 0보다 작은 X로 유의하십시오. 철회 단계에서 빨간색 버스토 정점은 X에서 0 위치보다 작은 X에서 압축 상이라고 하는 0 위치와 동일한 X위치로 이동합니다.결합이 리간드 수용체 분자 복합체 사이에서 형성되는 경우에, 적혈구는 그밖 긍정적인 방향과 더 상이할 것입니다. 이 X는 0 기간보다 큰 것을 후퇴 단계의 인장 단계라고 합니다. 후퇴 단계는 결합 분자의 스프링 상수를 결정하는 가장 중요한 부분입니다.BSP 데이터 수집 플랫폼을 사용하여 힘 대 시간 도로 데이터를 수집합니다. 각 실험은 일반적으로 50~200개의 터치 주기를 기록하고 PFP 데이터 분석 소프트웨어를 엽니다. 노란색 폴더 아이콘을 클릭하고 두 번 클릭하여 해당 행 데이터 파일을 선택합니다.우리는 프로그램에 있어. 그런 다음 위쪽 및 아래쪽 화살표 버튼을 클릭하여 이벤트 간에 전환합니다. 이상값 제외 기준을 사용하여 잘못된 이벤트를 차단합니다.시간 형식으로 강제되는 내보내기 데이터 형식을 선택하고 적절한 상태 범위를 선택합니다. 내보내기 플롯 데이터 버튼을 클릭합니다. 내보낸 데이터는 기본적으로 텍스트 파일로 저장됩니다.이 텍스트 파일에는 두 개의 데이터 열이 포함되어 있습니다. 그것은 시간 아빠를 나타내는 첫 번째 열과 각 시점에서 해당 힘을 나타내는 두 번째 열입니다. 스프레드시트 소프트웨어를 사용하여 힘 대 시간 곡선을 플롯하여 강제 대 변위 곡선을 가져옵니다.윌로우 스틸 PSO 이동을 통해 각 데이터 포인트의 시간 값을 곱합니다. 각 데이터 포인트에서 가장 작은 변위 값을 빼서 첫 번째 데이터 점을 0으로 설정합니다. 이 가로 변환은 후속 스프링 상수 계산에 영향을 주지 않습니다.힘 대 변위 곡선에서 새 힘 경사를 식별할 수 있는 경우 두 개의 서로 다른 액터 그룹이 다릅니다. 각각 압축 단계와 10 스타일 단계를 나타냅니다. 각 데이터 그룹에 회귀 선을 맞춥시게 합니다.가파른 경사면선이 K1로 표시된 압축기 상에서 총 스프링 상수를 나타냅니다. 그리고 가장 작은 상단이었던 라인은 내가 언급 한 K2.As 바와 같이 표시된이 10 스타일 단계에서 라인을 나타내며, 총 스프링 상수는 각 구성 요소의 시리즈 스프링 상수의 아들의 상호입니다. 박동의 압축 단계에서 세포 모드로, 분자 결합은 늘어나지 않으므로 분자 결합 스프링 상수가 고려되지 않습니다. 대상 셀의 스프링 상수는 압축기 상중 동안 K1이 총 스프링 상수를 나타내는 위치를 나타내는 방정식으로 설명됩니다.판매 모드의 10 스타일 단계에서, 총 스프링 상수는 적혈구 분자 결합의 uverse 봄 상수의 태양이다. 그리고 표적 셀은, K2가 전체 스프링 상수를 나타내는 분자 결합 스프링 상수를 계산하기 위해 표시된 방정식을 사용합니다. 10개의 정지 단계를 읽습니다.비트에서 비트에서, B 변형은 무시할 수 있기 때문에, 표적 세포 스프링상수접근제로의 역구를 설명하는 용어, 따라서 압축기 상세의 총 스프링 상수는 다음 방정식으로 나타나는 적혈구 스프링 상수와 동일하다. 인장 단계에서, 분자 결합의 스프링 상수는 다음 방정식으로 나타나는 적혈구의 효과를 빼서 계산될 수 있다. 측면 바람 통합 태도 B, 베타 3 복합체, K562 세포 및 열혈분리 태도 B 베타 3 복합체의 스프링 상수를 수집하여, 뉴턴 또는 나노미터 스케일을 선택하여 유래된 스프링 상트의 평균 및 표준 편차를 계산한다.이제 VFD 데이터에서 측정 및 스프링 상수에 대한 요구 사항이 무엇인지 더 잘 이해해야 합니다. 비트에서 셀 모드까지의 차이와 비트를 이길 수 있는 모드의 차이점을 알아차려 야 합니다. 다른 분자 제시 서비스는 스프링 상수의 측정에 다른 방어를 해야합니다.결론적으로, 이 단계별 절차는 BFP를 사용하여 분자 스프링 상수 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 우리는 BFP 데이터 수집 및 DFS 분석을 하나의 컴퓨터 휴게 프로그램에 자동화하고 통합하기 위한 향후 노력이 이루어질 것으로 예측합니다. 전체 BFP 작업 데이터 분석을 전체적으로 사용자 친화적이고 높게 만듭니다.

molecular-spring-constant-analysis-biomembrane-force-probe

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 문서에서 우리는 높은 parallelizable 방식으로 단일 분자 수준에서 효소 proteolysis에 대한 힘의 효과를 공부하는 자기 족집게의 사용을 설명합니다.

마그네틱 족집게를 사용하여 다중 단일 분자 강제 Proteolysis 측정

이 비디오에서는 BFP(biomembrane force probe)를 사용하여 수용체와 리간드 사이의 힘을 측정합니다. 이 기술은 프로브 비드에 접합된 pMHC와 표적 세포의 TCR 사이의 결합을 끊는 데 필요한 압력을 모니터링하여 상호 작용을 감지할 수 있습니다.

수용체-리간드 상호작용을 정량화하기 위한 Biomembrane Force 프로브

셀룰로솜은 셀룰로오스를 소화하도록 설계된 다효소 복합체입니다. AFM 기반 SMFS는 셀룰로솜 관련 단백질 어셈블리의 기계적 특성과 접힘 구성을 연구하는 데 사용되었습니다. 우리는 셀룰로솜 조립에 관여하는 개별 수용체-리간드 복합체의 상호 작용을 연구하기 위해 단백질 고정화, 데이터 수집 및 데이터 분석을 위한 완전한 워크플로우를 제시합니다.

AFM 기반 Single-molecule Force Spectroscopy를 사용한 셀룰로솜의 수용체-리간드 시스템 조사

다양한 단일 분자를 AFM 팁에 공유 결합하는 프로토콜이 제시됩니다. 고체 지지체 및 생체 계면에서 이러한 분자의 접착력과 자유 에너지를 결정하기 위한 절차와 예가 제공됩니다.

원자 힘 분광학에 의해 단일 ​​분자 접착 조사

우리는 단일 T 림프구에서 힘 조절 단일 수용체-리간드 결합 역학과 칼슘 신호의 실시간 이미징을 동시에 측정하는 기술을 설명합니다.

형광 생체막 포스 프로브 : 하나의 세포에서 수용체 - 리간드 속도론의 동시 정량 및 바인딩에 의한 세포 내 신호

여기서 우리는 원 자간 력 현미경 (AFM)을 사용하여 단일 분자 힘 분광법 측정에 의해 잘 정의 된 무기 표면 중 펩티드 또는 아미노산의 상호 작용의 힘을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다. 측정으로부터 얻어진 정보는 더 펩타이드 무기물 계면을 이해하는 것이 중요하다.

단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력

우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

이 프로토콜에 설명 합니다 heterobifunctional 실 란 커플링 에이전트와 원자 힘 현미경 검사 법 기반 단일 분자 힘 분광학을 위한 실리콘 산화물 표면에 의해 궁 행 되는 단백질의 화학식 동원 정지는 RrgA의 상호 작용 (pilus-1 팁 adhesin의 S. 균) fibronectin 함께.

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

원자력 현미경 검사법 (AFM) 캔틸레버 팁에 프로브 분자의 공유 부착은 물리적 특성의 조사를위한 필수적인 기술입니다. 이를 통해 높은 재현성을 가진 AFM 기반 단일 분자 힘 분광학을 통해 연신력, 탈착력 및 폴리머 길이를 결정할 수 있습니다.

AFM 기반 힘 분광학을 위한 단일 분자의 공유 부착

이 프로토콜은 분자 질량의 동시 조사 및 지질 막과 상호 작용하는 거대 분자의 확산 거동을 가능하게하는 iSCAT 기반 이미지 처리 및 단일 입자 추적 접근법을 설명합니다. 샘플 준비, 질량 대비 변환, 영화 수집 및 사후 처리에 대한 단계별 지침이 잠재적 인 함정을 방지하기위한 지침과 함께 제공됩니다.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

학습하세요 생체멤브레인 포스 프로브(BFP)를 활용한 분자 스프링 상수 측정 방법을. 이 기술은 살아있는 세포에서 단일 분자 결합 역학을 분석하여 세포막 역학에 대한 기계적 정보를 제공합니다.

생체멤브레인 포스 프로브 분광법에 의한 분자 스프링 상수 분석

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