Name: 적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: 학습하세요 적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통해 세포 형태를 정밀하게 제어하는 방법을. 상용 다중광자 영상 시스템을 활용하여 전문 클린룸 장비 없이도 고처리량 정량 분석이 가능합니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 S.P.에 Connaught 기금 새로운 조사상에 의해 지원되었다, 혁신을위한 캐나다 재단, NSERC 디스커버리 보조금 프로그램 (보조금 RGPIN-2015-05114 및 RGPIN-2020-05881), 맨체스터 대학과 토론토 대학 공동 연구 기금, 토론토 XSeed 프로그램 대학. C.T.는 NSERC USRA 펠로우십의 지원을 받았습니다.

<ol><li>Harris, T. J. C., Sawyer, J. K., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+the+Cytoskeleton+Helps+Build+the+Embryonic+Body+Plan+Models+of+Morphogenesis+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">How the Cytoskeleton Helps Build the Embryonic Body Plan Models of Morphogenesis from Drosophila.</a> Current Topics in Developmental Biology. 89, 55-85 (2009).</li>
<li>Keren, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+shape+determination+in+motile+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of shape determination in motile cells.</a> Nature. 453 (7194), 475-480 (2008).</li>
<li>Castor, L. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+Division+by+Cell+Contact+and+Serum+Concentration+in+Cultures+of+3T3+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Control of Division by Cell Contact and Serum Concentration in Cultures of 3T3 Cells.</a> Experimental Cell Research. 68 (1), 17-24 (1971).</li>
<li>Jain, N., Iyer, K. V., Kumar, A., Shivashankar, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+geometric+constraints+induce+modular+gene-expression+patterns+via+redistribution+of+HDAC3+regulated+by+actomyosin+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell geometric constraints induce modular gene-expression patterns via redistribution of HDAC3 regulated by actomyosin contractility.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (28), 11349-11354 (2013).</li>
<li>Paluch, E., Heisenberg, C. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Physics+of+Cell+Shape+Changes+in+Development%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Biology and Physics of Cell Shape Changes in Development.</a> Current Biology. 19 (17), 790-799 (2009).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Motility+Driven+by+Assembly+and+Disassembly+of+Actin+Filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular Motility Driven by Assembly and Disassembly of Actin Filaments.</a> Cell. 112 (4), 453-465 (2003).</li>
<li>Ridley, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+Migration%3A+Integrating+Signals+from+Front+to+Back%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell Migration: Integrating Signals from Front to Back.</a> Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).</li>
<li>Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+cell+rear+retraction+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanism of cell rear retraction in migrating cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (5), 591-599 (2013).</li>
<li>Lee, J., Ishihara, A., Oxford, G., Johnson, B., Jacobson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+movement+is+mediated+by+stretch-activated+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell movement is mediated by stretch-activated calcium channels.</a> Nature. 400 (6742), 382-386 (1999).</li>
<li>Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrulation+Movements%3A+the+Logic+and+the+Nuts+and+Bolts%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Gastrulation Movements: the Logic and the Nuts and Bolts.</a> Developmental Cell. 8 (3), 305-320 (2005).</li>
<li>Chen, C. S., Mrksich, M., Huang, S., Whitesides, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+Control+of+Cell+Life+and+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Geometric Control of Cell Life and Death.</a> Science. 276 (5317), 1425-1428 (1997).</li>
<li>Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+Lithography+in+Biology+and+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Soft Lithography in Biology and Biochemistry.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 3, 335-373 (2001).</li>
<li>Cirelli, R. A., Watson, G. P., Nalamasu, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Techniques+and+Processing%3A+Surface%2C+Micro-%2C+and+Nanoscale+Processing%5BTitle%5D)+AND+%22Encyclopedia+of+Materials%3A+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Techniques and Processing: Surface, Micro-, and Nanoscale Processing.</a> Encyclopedia of Materials: Science and Technology. , 6441-6448 (2001).</li>
<li>Stricker, J., Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+Constraints+on+the+Force-Dependent+Growth+of+Focal+Adhesions%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal Constraints on the Force-Dependent Growth of Focal Adhesions.</a> Biophysical Journal. 100 (12), 2883-2893 (2011).</li>
<li>Azioune, A., Storch, M., Bornens, M., Théry, M., Piel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+rapid+process+for+single+cell+micro-patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Simple and rapid process for single cell micro-patterning.</a> Lab on a Chip. 9 (11), 1640-1642 (2009).</li>
<li>Chang, F., Atilgan, E., Burgess, D., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulating+Cell+Shape+by+Placing+Cells+into+Microfabricated+Chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Manipulating Cell Shape by Placing Cells into Microfabricated Chambers.</a> Methods in Molecular Biology. 1136, 281-290 (2014).</li>
<li>Takeuchi, S., DiLuzio, W. R., Weibel, D. B., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+Shape+of+Filamentous+Cells+of+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Controlling the Shape of Filamentous Cells of Escherichia Coli.</a> Nano Letters. 5 (9), 1819-1823 (2005).</li>
<li>Minc, N., Boudaoud, A., Chang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Forces+of+Fission+Yeast+Growth%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Mechanical Forces of Fission Yeast Growth.</a> Current Biology. 19 (13), 1096-1101 (2009).</li>
<li>Durand-Smet, P., Spelman, T. A., Meyerowitz, E. M., Jönsson, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoskeletal+organization+in+isolated+plant+cells+under+geometry+control%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cytoskeletal organization in isolated plant cells under geometry control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (29), 17399-17408 (2020).</li>
<li>Haske, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((65+nm+feature+sizes+using+visible+wavelength+3-D+multiphoton+lithography.pdf%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">65 nm feature sizes using visible wavelength 3-D multiphoton lithography.pdf.</a> Optics Express. 15 (6), 3426-3436 (2007).</li>
<li>Song, J., Michas, C., Chen, C. S., White, A. E., Grinstaff, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Simple+to+Architecturally+Complex+Hydrogel+Scaffolds+for+Cell+and+Tissue+Engineering+Applications%3A+Opportunities+Presented+by+Two-Photon+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">From Simple to Architecturally Complex Hydrogel Scaffolds for Cell and Tissue Engineering Applications: Opportunities Presented by Two-Photon Polymerization.</a> Advanced Healthcare Materials. 9 (1), 1901217(2020).</li>
<li>Torgersen, J., Qin, X., Li, Z., Ovsianikov, A., Liska, R., Stampfl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+Two-Photon+Polymerization%3A+A+Toolbox+for+Mimicking+the+Extracellular+Matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for Two-Photon Polymerization: A Toolbox for Mimicking the Extracellular Matrix.</a> Advanced Functional Materials. 23 (36), 4542-4554 (2013).</li>
<li>Doyle, A. D., Wang, F. W., Matsumoto, K., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-dimensional+topography+underlies+three-dimensional+fibrillar+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">One-dimensional topography underlies three-dimensional fibrillar cell migration.</a> The Journal of Cell Biology. 184 (4), 481-490 (2009).</li>
<li>Doyle, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+Micropatterned+Substrates+Using+Micro+Photopatterning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Generation of Micropatterned Substrates Using Micro Photopatterning.</a> Current Protocols in Cell Biology. 45 (1), 1-35 (2009).</li>
<li>Waterman-Storer, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule%2FOrganelle+Motility+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule/Organelle Motility Assays.</a> Current Protocols in Cell Biology. 00 (1), 1-21 (1998).</li>
<li>Inoué, S., Spring, K. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInou%C3%A9%2C+S+%22Video+Microscopy%3A+The+Fundamentals%22">Video Microscopy: The Fundamentals</a>. , Springer. US. (1997).</li>
<li>Schneider, I. C., Hays, C. K., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+Growth+Factor-induced+Contraction+Regulates+Paxillin+Phosphorylation+to+Temporally+Separate+Traction+Generation+from+De-adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Epidermal Growth Factor-induced Contraction Regulates Paxillin Phosphorylation to Temporally Separate Traction Generation from De-adhesion.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (13), 3155-3167 (2009).</li>
<li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+tissue+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li>
<li>Xing, J., Cao, Y., Yu, Y., Li, H., Song, Z., Yu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Micropatterned+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Test+%28%C2%B5P-hPST%29+for+Morphometric-Based+Teratogen+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">In Vitro Micropatterned Human Pluripotent Stem Cell Test (µP-hPST) for Morphometric-Based Teratogen Screening.</a> Scientific Reports. 7 (1), 8491(2017).</li>
<li>Ankam, S., Teo, B. K., Kukumberg, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+screening+to+investigate+the+interaction+of+stem+cells+with+their+extracellular+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">High throughput screening to investigate the interaction of stem cells with their extracellular microenvironment.</a> Organogenesis. 9 (3), 0-14 (2013).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 공개하지 않습니다.

상기 결과는 기술된 IR 레이저 보조 마이크로패터닝(microphotopatterning) 프로토콜이 세포 형상 및 세포골격계 건축의 조작을 가능하게 하는 다양한 형상의 재현가능한 부착 패턴을 제공한다는 것을 보여준다. 마이크로포토패싱이 시작되기 전과 이후에 수많은 마이크로패턴 방법이 개발되었지만, 이 방법은 몇 가지 장점을 가지고 있다. 첫째, 일반적으로 엔지니어링 부서 내에서만 발견되는 특수 장비와 클린룸이 필요하지 않습니다. 사실, 다광현미경이 생물학 부서에서 더 흔한 광경이 되고 있기 때문에, 마이크로포토패터닝은 다광현미경의 적용을 확장하고 사용자의 잠재적인 풀에 추가합니다. 또한 패턴은 긴 리소그래피 프로세스를 수반하는 새 마스터 웨이퍼를 제작하는 대신 필요에 따라 변경하고 즉시 인쇄할 수 있습니다.
기존의 microphotopatterning 프로토콜에 비해, 우리의 프로토콜의 한 가지 개선은 커버 슬립 준비 중에 몇 가지 시간이 많이 걸리는 경화 단계를 제거하는 것입...

세포 형상은 조직 형태발생1,세포 이동2,세포 증식3및 유전자 발현4와같은 근본적인 생물학적 과정의 주요 결정자이다. 세포 형상의 변화는 혈장 막과 세포 세포 및 세포 매트릭스 유착의 기하학과 같은 외장 적 인자를 변형시키는 세포 골격의 동적 재배열 사이의 복잡한 균형에 의해 구동된다5. 예를 들어, 중간엽 세포를 마이그레이션하는 것은 플라즈마 멤브레인을 앞으로 밀어 내고 넓은 라멜리포디아6을생성하는 최첨단 액틴 네트워크를 중합하고, actomyosin 수축은 세포의 좁은 후행 가장자리를 후퇴시켜 현재 위치7,8에서세포를 분리한다. 이러한 특수 시토셀레탈 구조를 초래하는 신호 이벤트를 방해하여 모양과 극성을 분산시키고 세포 이동9을느리게 합니다. 또한, 위화 중에 상피 시트굽힘은 세포와 이웃이 쐐기 모양10이되는 원인이 되는 actomyosin 기반 의 정압 수축을 필요로 한다. 이 연구 결과는 세포 모양의 중요성을 강조하더라도, 세포 모양에 있는 내재된 이질성은 기능에 형태학을 연결하는 기계장치를 확인하기 위하여 노력을 방해했습니다.
이를 위해 지난 3년 동안 세포 모양을 조작하기 위한 수많은 접근법이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 세포세포를 3차원 몰드로 제한하거나 세포외 매트릭스(ECM) 단백질의 패턴 침착을 통해 세포 부착 기하학을 제어하는 것으로 목표를 달성하며,마이크로패터닝(11)이라고불리는 기술이다. 여기에서 우리는 수년에 걸쳐 인기를 얻은 기술의 숫자를 검토합니다.
원래 마이크로 전자 응용 프로그램에 대한 접근 으로 개척, 소프트 리소그래피 기반 마이크로 접촉 인쇄는 명백하게 컬트좋아하는되고있다 12. 마스터 웨이퍼는 먼저 포토레지스트 코팅 실리콘 기판의 영역을 광조사에 선택적으로 노출시켜 패턴표면(13)을남겨두고 제작된다. PDMS와 같은 탄성중합체는 마스터 웨이퍼에 부어 ECM 단백질을 원하는기판(11,14)으로전달하는 부드러운 "스탬프"를 생성한다. 일단 제작되면 마스터 웨이퍼를 사용하여 많은 PDMS 스탬프를 캐스팅하여 매우 재현 가능한 마이크로패턴(12)을유발할 수 있습니다. 그러나 긴 포토리소그래피 프로세스로 인해 패턴을 쉽게 조정할 수 없습니다. 이 과정은 또한 생물학 부에서 일반적으로 사용할 수없는 고도로 전문화된 장비와 클린룸이 필요합니다.
최근에는 딥 UV를 이용한 직접 인쇄는 기존의 리소그래피 기반 접근법에 의해 야기되는 한계를 우회하는 것으로 보고되었습니다. 딥 UV 광은 포토마스크를 통해 폴리 L-리신-이식-폴리에틸렌 글리콜으로 코팅된 유리 커버슬립의 선택적영역으로 전달됩니다. 깊은 UV에 노출된 화학 군은 ECM단백질(15)의결합을 가능하게 하기 위해 감광성 링커를 사용하지 않고 광변환된다. 감광성 링커가 부족하여 패턴 커버립이 7개월 이상 실온에서 안정적으로 유지될 수있습니다. 이 방법은 클린룸과 포토리소그래피 장비의 사용을 방지하고 덜 전문적인 교육이 필요합니다. 그러나 포토마스크에 대한 요구 사항은 여전히 패턴의 쉽게 사용할 수 있는 변경이 필요한 실험에 상당한 장애물이 됩니다.
2D 표면에 ECM 단백질의 제어 된 증착을 통해 세포 기하학을 조작하는 방법 외에도, 다른 3D 미세 구조에 세포를 제한하여 세포 모양을 제어하는 방법을 추구한다. 많은연구는 배아, 박테리아, 효모 및 식물16,17,18,19에서모양 의존성 생물학적 과정을 조사하기 위해 2D, PDMS 챔버가 아닌 3D를 생성하기 위해 위에서 설명한 소프트 리소그래피 기반접근법을조정하였다. 2-광자 중합(2PP)은 또한 나노미터분해능(20)을가진 복잡한 3D 하이드로겔 스캐폴드를 생성할 수 있는 미세 제조 기술로 주도권을 잡았다. 2PP는 펨토초 펄스에서 전달되는 두 개의 광자가 동시에 흡수되는 2광광흡착의 원리에 의존하며, 이 경우광중합체(21)의국소 중합화를 가능하게 한다. 이 기술은 인간 조직의 네이티브 ECM 구조를 모방하는 3D 스캐폴드를 인쇄하기 위해 크게 사용되었으며세포(22)에낮은 광화학적 손상을 유도하는 것으로 나타났다.
10년 전 마이크로포토패싱의 데뷔는 연구원들에게 접근이 불가능하고 특수장비가 없는 동시에 마이크로패턴을 제작할 수 있는 기회를 제공했습니다. 마이크로포토패터닝은 적외선레이저(23,24)를이용하여 활성화된 유리 표면에 코팅된 폴리비닐 알코올(PVA)의 선택적 영역을 열적으로 제거하여 미크로톤 스케일에 패턴을 생성한다. PVA가 아닌 기본 유리 표면만을 부착하는 ECM 단백질은 제어된 확산 역학 및 세포 모양을 가능하게 하는 생화학적 단서역할을 합니다. 이 방법은 패턴을 실시간으로 쉽게 변경할 수 있기 때문에 뛰어난 유연성을 제공합니다. 여기서, 우리는 상업적다광화상 영상을 이용하여 마이크로포토패싱의 단계별 프로토콜을 제공한다. 설명된 프로토콜은 대형 패턴의 신속하고 자동화된 제조를 위해 설계되었습니다. 우리는 이러한 패턴이 세포-ECM 접착력의 형상을 제한하여 셀 모양을 효율적으로 제어한다는 것을 입증했습니다. 마지막으로, 설명된 패터닝 기술이 액틴 세포골격의 조직과 역학을 조절한다는 것을 입증합니다.

<table><tbody><tr><td>(3-Aminopropyl)trimethoxysilane</td><td>Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 세포 배양 접시</td><td>VWR</td><td>10062-880</td><td>폴리스테렌, TC 처리, 통풍</td></tr><tr><td>25X Apo LWD 물 담그는 목표</td><td>Nikon</td><td>MRD77225</td><td></td></tr><tr><td>3.5 cm 세포 배양 접시</td><td>VWR</td><td>10861-586</td><td>폴리스테렌, TC 처리, 통풍</td></tr><tr><td>4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)</td><td>Thermo</td><td>62248</td><td>1mg/mL 디하이드로클로라이드 용액</td></tr><tr><td>소 세린 알부민</td><td>BioShop</td><td>ALB005</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphate-Buffered</td><td>Saline Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>에탄올아민</td><td>시그마-알드리치</td><td>E9508</td><td></td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>FC010</td><td>1mg/mL in pH 7.5 buffer</td></tr><tr><td>Fibronectin 항체</td><td>BD</td><td>610077</td><td>마우스</td></tr><tr><td>피지</td><td>ImageJ</td><td></td><td>버전 1.53c</td></tr><tr><td>형광 팔로이딘</td><td>인비트로젠</td><td>A12380</td><td>568nm</td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td>22 &times; 22 mm</td></tr><tr><td>글루타르알데히드</td><td>전자 현미경 과학</td><td>16220</td><td>25% 수용액</td></tr><tr><td>염산</td><td>칼레돈</td><td>6025-1-29</td><td>37% 수용액</td></tr><tr><td>IR 레이저</td><td>코히런트</td><td>카멜레온 비전</td><td></td></tr><tr><td>미니멀 에센셜 매체 &알파;</td><td>Gibco</td><td>12561-056</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디엄</td><td>시그마</td><td>F4680</td><td></td></tr><tr><td>마우스 2차 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>4408S</td><td>염소, 488nm</td></tr><tr><td>다광자 현미경</td><td>Nikon</td><td>A1R MP+</td><td></td></tr><tr><td>Myosin 경쇄 항체</td><td>세포 신호 기술</td><td>3672S</td><td>토끼</td></tr><tr><td>NIS 요소</td><td>Nikon</td><td></td><td>버전 5.21.03</td></tr><tr><td>질산</td><td>Caledon</td><td>7525-1-29</td><td>70% 수용액</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe</td><td></td><td>버전 21.2.1</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma</td><td>P2443</td><td>분말</td></tr><tr><td>폴리(비닐 알콜)</td><td>Aldrich</td><td>341584</td><td>MW 89000-98000, 98% 가수분해</td></tr><tr><td>토끼 2차 항체</td><td>세포 신호 전달 기술</td><td>4412S</td><td>염소, 488nm</td></tr><tr><td>셰이커</td><td>VWR</td><td>10127-876</td><td>아날로그 로커로도 알려진</td></tr><tr><td>수소화붕소나트륨</td><td>알드리치</td><td>452882</td><td>분말</td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>시그마</td><td>S5136</td><td>분말</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성</td><td>시그마</td><td>S5011</td><td>분말</td></tr><tr><td>스파이더</td><td>아나콘다</td><td>4.1.4</td><td></td></tr><tr><td>0.53mM EDTA를 함유한</td> <td>Trypsin</td><td>Wisent</td><td>325-042-CL</td> 0.05% 수용액</tr></tbody></table>

적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어

Control of Cell Geometry through Infrared Laser Assisted Micropatterning

Micropatterning은 자연적인 세포 대 세포 변이에서 발생하는 합병증을 우회하면서 세포 구획의 형태와 기능 사이의 연결을 연구하는 데 사용되는 세포 생물학 커뮤니티에서 확립 된 기술입니다. 세포 모양을 표준화하기 위해 세포는 3D 금형에 국한되거나 접착제 섬을 통해 접착제 형상을 제어합니다. 그러나 포토리소그래피와 딥 UV 에칭을 기반으로 하는 기존의 마이크로패턴 기술은 클린룸이나 특수 장비에 크게 의존합니다. 여기서 우리는 도일 외에서 변형된 적외선 레이저 보조 마이크로패터닝 기술(microphotopatterning)을 제시하여 시판되는 이미징 시스템으로 편리하게 설정할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 Nikon A1R MP+ 이미징 시스템을 사용하여 폴리 비닐 알코올 코팅 커버립의 사전 설정 영역을 축산하는 적외선(IR) 레이저를 통해 미크론 정밀도로 마이크로패턴을 생성합니다. 우리는 하드웨어 자동 초점이 장착되지 않은 시스템에서 고효율과 정확도로 자동화 된 패턴 제작을 가능하게하기 위해 사용자 정의 스크립트를 사용합니다. 우리는 이 IR 레이저 보조 마이크로패터닝(microphotopatterning) 프로토콜이 세포가 독점적으로 부착하고 원하는 모양을 취하는 정의된 패턴을 초래한다는 것을 보여줍니다. 더욱이, 셀 형상의 표준화로 인해 많은 수의 세포로부터의 데이터를 평균화할 수 있다. 고해상도 이미징 및 정량 분석과 결합된 이 프로토콜과 함께 생성된 패턴은 상대적으로 높은 처리량 스크린에 사용하여 형태와 기능 간의 연결을 중재하는 분자 플레이어를 식별할 수 있습니다.

마이크로패터닝을 통해 얻은 실험 데이터의 품질은 패턴의 품질에 크게 좌우됩니다. 위의 방법으로 생성 된 패턴의 품질을 결정하기 위해 먼저 반사 현미경 검사를 사용하여 커버 슬립의 사진 압착 영역의 모양과 크기를 평가했습니다. 우리는 각 개별 패턴이 절제 마스크와 매우 유사하게 보였고 선명한 보더와 균일하게 빛을 반사하는 표면을 표시한 것으로나타났습니다(그림 2B). 원하는 사이토스켈레톤 아키텍처에 따라 다양한 모양과 크기를 인쇄할 수 있지만, 우리의 목적에 가장 적합한 석궁 모양을 사용했습니다. 원자력 현미경 검사법(AFM)은 이러한 패턴이 높이약 140nm이고전체(도 2F)에걸쳐 최소한의 토폴로지 변화로 매끄러운 표면을 가지고 있음을 밝혔다. 낮은 레이저 전력 및 잘못된 초점 평면과 같은 최적이 아닌 패터닝 설정은 고르지 않은 토폴로지(그림2C)를사용하여 어둡고 부분적...

여기에 제시된 프로토콜은 포유류 세포 내의 세포골격 구조를 연구하기 위하여 세포 모양을 표준화하는 micro패턴의 자동화된 제조를 가능하게 합니다. 이 사용자 친화적 인 기술은 시판되는 이미징 시스템으로 설정할 수 있으며 표준 세포 생물학 실험실에 접근 할 수없는 특수 장비를 필요로하지 않습니다.

Micropatterning is an established technique in the cell biology community used to study connections between the morphology and function of cellular ...

마이크로패터닝은 세포 모양과 세포 간 기계의 활동 사이의 연결을 이해하기 위해 과학자들이 사용하는 강력한 기술입니다. 몇몇 기술은 연구원이 세포 모양을 조절하는 것을 허용하더라도, 이 기술은 수시로 몇몇 생물학 실험실에 접근할 수 없는 특화된 장비를 요구합니다. 이 비디오는 시판되는 다광화상 이미징 시스템에서 마이크로패터닝을 자동화하는 데 필요한 단계를 안내합니다.이 프로토콜의 한 가지 장점은 특수 장비의 사용을 피한다는 것입니다. 또한 일반적으로 마이크로패턴에서 가장 시간이 많이 소요되는 공정인 포토마스크를 재구성하지 않고도 패턴을 쉽게 변경할 수 있습니다. 당사의 이미지 처리 도구는 공정하고 자동화된 방식으로 단백질의 대표적인 분포를 반영하는 평균 세포 이미지를 생성합니다.실험에서 커버립을 사용하지만 자동화된 워크플로우를 사용하면 슬라이드와 유리 바닥 접시에 패턴을 표시할 수도 있습니다. 적절한 현미경 설정이 시스템이 올바른 초점 평면을 식별하고 자동화 된 방식으로 패턴을 식별하는 데 매우 중요하기 때문에이 방법의 시각적 데모는 중요합니다. 지시에 따라 PVA 솔루션을 준비합니다.8개 부품 PVA에 HCL 1부를 추가합니다. 튜브를 조심스럽게 혼합하려면 몇 번 반전하십시오. 용액 2밀리리터를 작은 페트리 접시에 붓고 깨끗한 전처리된 커버슬립을 액체에 담급니다.셰이커에서 실온에서 5분간 배양하세요. 조심스럽게 솔루션에서 커버 슬립을 제거합니다. 커버슬립 스피너를 사용하여 40초 동안 코트를 회전시십시오.그 동안, 핀셋을 청소. 커버슬립을 상자에 옮기고 하룻밤 사이에 4도건조합니다. 현미경 소프트웨어를 켭니다.먼저 레이저 라인을 750나노미터로 설정합니다. 그런 다음 이미지라는 새 광학 구성을 설정합니다. 이것은 우리가 반사체를 통해 커버 슬립을 이미지 할 수있는 기준 광학 구성입니다.다른 옵션을 기본값으로 두고 적절한 목표를 선택합니다. 이 광학 구성에서 하드웨어 설정을 구성합니다. 적외선 레이저를 자극 레이저로 설정합니다.광선 스플리터를 광선 경로에 배치하여 이미징을 위해 IR 레이저를 사용합니다. 갈바노 스캐너 장치와 적절한 D 스캔 감지기를 선택합니다. 커버슬립의 작은 피처를 캡처하기에 충분한 스캔 크기와 거주 시간을 선택합니다.IR 레이저 사용 상자가 선택되어 있는지 확인합니다. 커버슬립 표면의 밝지만 포화되지 않은 이미지를 얻기 위해 획득 레이저 전력 및 검출기 민감도를 조정합니다. 스캔 영역 창에서

control-cell-geometry-through-infrared-laser-assisted

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 그런가 2 세포 패터닝 미세 호환 방법을 설명합니다. 미리 정의 된 파릴 렌-C 디자인은 포토 리소그래피의 SiO2 웨이퍼에 인쇄되어 있습니다. 혈청 (또는 다른 정품 인증 솔루션)와 함께 배양 한 다음 세포에 특이 적으로 부착 (과의 적합성에 따라 성장) 그런가 2 지역으로 격퇴하는 동안 기본 파릴 렌-C.

포토 리소그래피 정의 파릴 렌-C에 대한 세포 패터닝 : 그런가<sub&gt; 2</sub&gt; 기판

이 원고는 단방향 스트레칭을 사용하여 부착 세포 나 조직에 힘을 적용하거나 해제하는 방법을 제시한다.

PDMS 막에 마이크로 패턴 세포를 스트레칭

여기에서는 직접 레이저 쓰기를 사용하여 모양과 분자 정렬을 나노미터 규모의 정확도로 엔지니어링할 수 있는 3D 고분자 마이크로/나노 구조를 제작합니다. 여러 유형의 액정 엘라스토머 미세 구조의 광 유도 변형은 미시적 규모로 제어 할 수 있습니다.

자유 형식 등 엑츄에이터 - 현미경 규모의 제조 및 개폐 제어

인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 차별화 별개의 조직 패턴으로 자기 조직하는 고유 능력을 가지고; 이 공간 환경 그라데이션의 표현을 필요로하지만. 우리 hPSC 분화 패턴을 제어하기위한 생화학 적 및 기계적 그라디언트를 생성하는 간단하고 강력한 방법으로서 공판 미세 패턴을 제시한다.

차별화 운명의 공간 조직을 프로빙에 대한 인간 다 능성 줄기 세포의 스텐실 미세화

이 보고서는 저압 진공을 사용하여 생물학 연구를 위한 세포와 기질로 미세유체 채널을 채우는 간단하고 수행하기 쉬운 기술을 설명합니다.

패터닝 단백질과 세포의 다목적 방법

이 프로토콜은 생물 공학 적 배경이 제한된 사람들이 간단하고 접근 할 수있는 리소 그래피프리 마이크로 패터닝 방법을 소개합니다. 이 방법은 세포 형태를 변조하기 위한 관심있는 모양의 마이크로 패턴 세포 외 매트릭스 단백질에 맞춤형 레이저 컷 스텐실을 활용합니다. 미세 패터킹에 대한 절차는 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 입증된다.

레이저 컷 스텐실을 사용한 간단한 리소그래피 없는 단일 셀 마이크로패터닝

이 프로토콜의 목표는 극저온 전자 현미경 검사법을 위한 그리드의 표적 영역에 세포 접착 및 성장을 지시하는 것입니다. 이는 세포 종자 전에 패턴화된 영역에서 세포외 매트릭스 단백질의 증착에 따라 사용자 지정 패턴에서 절제되는 항 파울링 층을 적용함으로써 달성된다.

전세포 극저온-전자 단층 촬영 워크플로우 내의 직접 세포 위치지정에 마이크로패턴 전송 전자 현미경 검사기 그리드

거의 UV 리소그래피 및 견인력 현미경 검사법은 마이크로패턴 하이드로겔의 세포력을 측정하기 위해 결합됩니다. 단일 셀의 표적 광 유도 방출은 동일한 샘플에서 많은 수의 측정을 가능하게 합니다.

견인력 현미경 검사법의 응용을 위한 하이드로겔 패터닝 기술을 사용하여 세포 접착 제어

우리는 소프트 하이드로젤 상의 세포외 매트릭스 단백질의 도트 어레이의 단일 감산 패터닝 단계를 사용한 마이크로접촉 프린팅을 기반으로 세포 견인력을 측정하는 표준 방법에 대한 개선을 설명합니다. 이 방법은 세포 군집 모양을 제어하는 데 필수적인 섬 패턴을보다 간단하고 일관되게 제작할 수 있습니다.

마이크로패턴 견인 현미경을 위한 패턴 생성

전통적으로, 세포 배양은 생체 내에서 세포의 자연 환경을 잘 모방하지 못하는 평면 기질에서 수행됩니다. 여기서 우리는 생리적으로 관련된 곡선 기하학과 미세 패턴화 된 세포 외 단백질을 가진 세포 배양 기질을 생산하는 방법을 설명하여 이러한 세포 외 단서의 세포 감지에 대한 체계적인 조사를 가능하게합니다.

삼차원 세포 배양 기질의 UV-광패터닝에 의한 다큐 세포 미세환경 생성

레이저 미세 가공을 사용하여 빛 흡수 복합 고분자 재료, 특히 자기 활성 엘라스토머(MAE)의 표면 지형을 부과하는 방법이 제시됩니다. 이 방법은 지형 설계 및 신속한 프로토타이핑에서 큰 유연성을 가능하게 합니다. MAE 표면 구조화, 특성화 및 외부 자기장에 대한 반응의 예가 시연됩니다.

폴리머 표면 지형 설계를 위한 레이저 미세 가공

학습하세요 적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통해 세포 형태를 정밀하게 제어하는 방법을. 상용 다중광자 영상 시스템을 활용하여 전문 클린룸 장비 없이도 고처리량 정량 분석이 가능합니다.

적외선 레이저 보조 마이크로패터닝을 통한 세포 지오메트리 제어

더 많은 동영상 탐색