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방법 논문

환자 유래 오가노이드를 사용한 중간 처리량의 약물 및 방사선 요법 스크리닝 분석

3.9K 조회수

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DOI:

10.3791/62495

⸱

2021년 4월 30일

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Crown Bioscience Netherlands B.V., 2Oncode Institute, Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) and University Medical Center Utrecht, 3Hubrecht Organoid Technology (HUB), 4Pathology dept, University Medical Center Utrecht, 5Department of Clinical Sciences - Companion Animals, Faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University, 6Crown Bioscience Inc.

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

중간 처리량 치료 민감도 스크리닝을 위해 환자 유래 오가노이드를 사용하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 시험된 치료법에는 화학 요법, 방사선 요법 및 화학 방사선 요법이 포함됩니다. 아데노신 삼인산 수치는 기능적 판독값으로 사용됩니다.

초록

환자 유래 오가노이드(PDO) 모델은 3차원으로 성장하고 거의 네이티브 상태로 자란 일차 상피 세포의 장기 확장 및 유지를 가능하게 합니다. 절제 또는 생검된 종양 조직에서 유래한 오가노이드는 in vivo 종양 형태를 밀접하게 재현하며 in vitro 치료 반응을 연구하는 데 사용할 수 있습니다.종양 오가노이드의 바이오뱅크는 다양한 임상 종양과 환자를 반영하므로 전임상 및 임상 응용 분야에 큰 가능성을 가지고 있습니다. 이 논문은 두경부 편평세포암과 결장직장 선암종 오가노이드를 사용한 중간 처리량의 약물 스크리닝 방법을 제시합니다. 이 접근법은 정상 및 질환을 포함한 모든 조직 유래 오가노이드 모델과 함께 사용하기 위해 쉽게 채택할 수 있습니다. 오가노이드를 화학요법 및 방사선요법에 체 외 로 노출하는 방법(단일 치료 방식 또는 조합)에 대한 방법이 설명되어 있습니다. 약물 노출 5일 후 세포 생존율은 아데노신 삼인산(ATP) 수치를 측정하여 평가합니다. 약물 감수성은 절반 최대 억제 농도(IC50), 곡선 아래 면적(AUC) 및 성장률(GR) 메트릭으로 측정됩니다. 이러한 매개변수는 오가노이드 배양이 특정 치료에 민감하거나 내성이 있는 것으로 간주되는지에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

서론

성체 줄기세포에서 확립되고 3차원(3D) 세포외 기질(ECM) 및 특정 성장 인자 칵테일(HUB 오가노이드라고도 함)에서 성장한 오가노이드 모델은 전임상 종양학 스크리닝 플랫폼으로 주목받고 있습니다. 환자 유래 오가노이드(PDO) 배양은 정상 조직 생검과 질병 조직 생검 모두에서 1-2주 이내에 확립할 수 있으며 최소 1-2개월에서 최대 무제한까지 확장할 수 있습니다. 냉동 보존을 통해 잘 특성화된 배양을 장기간 사용할 수 있습니다. 클론 유래된 기존의 2차원 세포주 모델과 달리, PDO 모델은 표현형적으로나 유전적으로 원래의 종양 조직을 밀접하게 재현하고 종양 이질성을 보존합니다. PDO에 대한 중간 처리량의 약물 스크리닝은 광범위한 치료법을 테스트하여 맞춤형 의약품을 위한 고유한 플랫폼을 제공합니다.

이전 연구에서는 다양한 유형의 종양에서 확립된 모델에서 치료 스크리닝, 특히 약물 및 방사선 요법을 위한 오가노이드 모델의 사용을 설명하고 오가노이드의 예측 잠재력이 임상적 의사 결정을 안내하는 데 도움이 되는 잠재력을 보여줍니다 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11

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프로토콜

참고: 이 프로토콜을 사용하기 전에 해당 기관의 인간 연구 윤리 위원회의 지침을 따르고 있는지 확인하십시오. 이 프로토콜에 설명된 환자 조직 및 데이터 수집은 EUREC 지침과 유럽, 국가 및 지역 법률에 따라 수행되었습니다. 모든 오가노이드는 동의한 환자로부터 파생되었으며 동의는 언제든지 철회할 수 있습니다.

1. 상영 전

  1. 정상 세포 과증식 가능성을 배제하기 위해 새로 확립된 모델(예: 조직학 및/또는 DNA 염기서열분석 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11)의 동일성을 확인하고, 종양 오가노이드 배양에 대해 약물 스크리닝이 수행되는지 <....

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결과

이 실험의 목적은 단일 제제로서 화학요법 및 방사선 요법에 대한 HNSCC 오가노이드의 민감도를 조사하는 것이었습니다. 또한 일주일 간격으로 실험을 여러 번 실행하여 결과의 재현성을 테스트하여 여러 생물학적 복제(실험 1-3)를 수행했습니다(그림 2). 프로토콜에 따라, 0일차에 HNSCC PDO를 6웰 플레이트의 6웰에서 수확하고 효소 및 기계적으로 단일 세포(또는 70μm< 작은 오가노이드)로 전단하고 1:2의 분할 비율로 80%(v/v) ECM으로 재플레이팅했습니다. 2일차에는 dispase를 사용하여 오가노이드를 수확하고, 오가노이드를 70μm < 유지하도록 여과하고, 시약 디스펜서의 튜브 하나를 사용하여 7개의 384웰 플레이트로 구성된 두 줄의 웰당 1000개의 오가노이드를 파종했습니다. 하나의 플레이트는 시스플라틴을 조사되지 않은 플레이트(0 Gy)로만 포함했습니다. 다른 6 개의 플레이트는 방사선 조사 (1-10 Gy)에 사용되었습니다.

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토론

이 기사와 비디오는 PDO를 사용하여 중간 처리량의 약물 스크리닝을 수행하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 최적화를 통해 여기에 설명된 것과 다른 조직 유형에서 파생된 오가노이드를 스크리닝하는 데 채택될 수 있습니다. 스크리닝 전에 이상적인 통과 기간을 결정하는 것은 개별 오가노이드 배양에 따라 다르고 조직 유형에 따라 다르기 때문에 중요합니다. 웰당 파종된 오가노이드의 밀도와 크기는 더 빠르게 성장하는 모델이 웰 내에서 더 많은 공간을 필요로 하고 크기 차이로 인해 더 많은 변동이 발생할 수 있으므로 최적화해야 하는 중요한 요소입니다. 테스트 화합물만이 오가노이드 생존율에 영향을 미치도록 하려면 처리되지 않은(음성 대조군) 오가노이드가 실험 과정에서 결핍을 겪지 않도록 하는 것이 중요합니다. 처리되지 않은 오가노이드는 처리된 집단에 비해 부피가 방해받지 않고 증가하기 때문에 이 분석은 치료로 인한 세포 사멸과 세포 증식 억제를 모두 평가합니다. 따라서 이 방법을 .......

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공개 사항

MP와 QXL은 Crown Bioscience의 정규직 직원입니다. RO와 SB는 Hubrecht Organoid Technology(HUB)의 정규직 직원입니다. HC는 오가노이드 기술과 관련된 여러 특허의 발명자입니다. 그의 전체 공개는 https://www.uu.nl/staff/JCClevers/ 에서 제공됩니다. ED는 HN 오가노이드 기술과 관련된 특허의 발명자입니다. HC는 약물 개발에 오가노이드를 사용하는 OrganoidZ의 설립자입니다.

감사의 글

토론과 귀중한 의견을 제시해 주신 Annemarie Buijs, Xiaoxi Xu, Federica Parisi에게 감사드리며, 기술 지원을 제공해 주신 Ingrid Boots와 Marjolijn Gross에게도 감사드립니다.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
필요한 장비
384-well 생물 발광 플레이트리더; 예: Tecan Spark 10M 플레이트 리더
명시야 현미경
Elekta 모델 Synergy, Elekta 스웨덴
대형 노즐이 있는 액체 처리기(" 표준 튜브") 카세트;  
예: 멀티드롭 콤비 시약 디스펜서Thermo Scientific
방사선 치료용 플레이트 홀더 인서트가 있는 플라스틱 용기집에서 만든
Spark 제어 방법 편집기 소프트웨어
표준 조직 배양 장비(LAF 캐비닛, 인큐베이터, 원심분리기, 수조 등)
필요한 재료
1.5 mL 플라스틱 튜브
15 및 50 mL 플라스틱 튜브
5, 10 및 25 mL 멸균 플라스틱 피펫
6웰 세포 배양 플레이트
검은색 384웰 초저 부착성 투명 바닥 플레이트; 예: Corning 384 플랫 블랙Corning4588
Breathe-Easy  밀봉 멤브레인Merck프리컷 폴리우레탄 의료용 멤브레인, 아크릴 접착제 포함
유리 슬라이드혈구계 그리드가 있는 10챔버 슬라이드
멀티드롭 콤비 시약 디스펜서, 표준 튜브 디스펜싱 카세트Thermo Scientific
Plugged Pasteur' 팁이 화염
뒤집을 수 있는 20/40/70/100 µ m 필터: PluriStrainerPluriselect예: 43-50020-03
Sterile P1000, P200, P20 및 P2 피펫 팁 및 저잔류 필터 팁(예: 사파이어 팁)Greiner750266
T8 Plus 및 D4 Plus 케이스HP/Tecan
필요한 시약
100 x GlutamaxL-glutamine
Advanced-DMEM/F12
CellTiter-Glo 3D 세포 생존도 분석PromegaG9681
Dispase IISigma-AldrichD4693
DMSO
ECM: 성장 인자 감소 Matrigel, HNSCC PDO용 페놀 프리코닝356231
ECM: BME, Cultrex RGF 기저막 추출물, R1R& 유형 D Systems3433-005-R1
팽창 성장 배지(각 오가노이드 유형에
오가노이드 성장 인자(각 오가노이드 유형에
PBS
Pen/Strep(100 U/mL)
ROCK 억제제: Y-27632AbmoleM1817
TrypLE
필요한 소프트웨어 패키지:
GraphPad Prism
Microsoft Excel
, 넓은 시야 렌즈(2.5x)가 있는 Tecan , 디지털 디스펜서, 예: Tecan D300e Tecan 약물 분주 6MV 광자 빔 조사기 , , , 으로 조여진 피펫 PBS 70% EtOH 에 희석된 1 M HEPES 30%(v/v) Tween-20 Thermo Scientific 12634-010 Staurosporin 또는 기타 양성 대조군을 포함한 스크리닝 테스트 스크리닝 화합물 대체 CRC용 특이) 특이)

참고문헌

  1. Tiriac, H., et al. Organoid profiling identifies common responders to chemotherapy in pancreatic cancer. Cancer Discovery. 8 (9), 1112-1129 (2018).
  2. Sachs, N., et al. A Living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity.....

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