Name: 시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 학습하세요 인간 치과 펄프 줄기 세포를 췌장 혈통으로 유도하는 통합 및 비통합 프로토콜을 비교하는 방법을. 이 연구는 제1형 당뇨병 치료를 위한 기능성 인슐린 생성 세포 생산에 활용됩니다.

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SK, WR, QDL은 수의학 줄기세포 및 생명공학 연구단위인 라타다피섹톰포트 엔다우먼트 펀드, 출라롱콘대학교의 지원을 받았습니다. TO와 PP는2세기 프로젝트로 출라롱콘 학술 발전에 의해 지원되었다. CS는 수의학 학부의 보조금을 지원하는 연구에 의해 지원되었다, 출라롱콘 학술 발전 2세기 프로젝트, 수의학 줄기 세포 및 생명 공학 연구 단위, Ratchadaphiseksomphot 엔다우먼트 기금, 출라롱콘 대학, 정부 연구 기금.

이 작품은 헬싱키 선언에 따라 수행되었으며, 출라롱콘 대학 치과 학부인 인간 연구 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 인간 DPSC (hDPSC)는 사랑니 문제로 인해 노모와 어금니 모두에서 추출 된 인간의 치과 펄프 조직에서 분리되었다. 승인된 프로토콜(HREC-DCU 2018/054)에 따라 환자로부터 통보된 동의를 얻었다.
1. 통합 유도 프로토콜
<ol><li>PDX1을 운반하는 렌티바이러스 벡터의 준비
	<ol>
<li>바이러스 성 포장을 위해 인간 배아 신장 (HEK) 293FT 세포를 사용하십시오. 배양 및 DMEM의 변형 된 독수리 매체 (DMEM)에서 이러한 세포를 유지 하여 10% 태아 소 혈청 (FBS), 1 % L-글루타민, 1 % 항생제 - 항진성으로 보충.</li>
		<li>PDX1-렌즈바이러스벡터를 각각 10μg의 공동 배분하여 각각 포장 및 봉투 플라스미드와 표적 유전자 플라스미드의 20 μg을 헤K293FT 세포로 결합하여 칼슘 인산염 트랜스퍼션 시스템(예를 들어, psPAX2, pMD2)을 생성한다. G, 및 인간 pWPT-PDX111. 감염 시 세포가 80%-90% 컨실수 있는지 확인합니다.</li>
		<li>렌티바이러스 입자를 함유하는 배지를 48 및 72h에서 배설 후 수집한다.</li>
		<li>0.45 μm 필터를 통해 수집된 매체를 필터링하는 행위; 100 kDa 명목 분자량 컷오프(NMWCO)에서 원심 필터로 바이러스를 농축한다.</li>
	</ol></li>
	<li>PDX1 과발현<ol>
<li>70-80% 컨할수 있는 통로 3-5 hDPSC를 사용합니다. 시도및 셀 카운터를 사용하여 세포를 계산합니다. 씨앗 1 x 106 hDPSC는 60mm 조직 배양 처리 접시에 하룻밤 동안 배양한다.</li>
		<li>24시간 후, 폴리브레인 전처리 셀(4 μg/mL 폴리브레네, 37°C 미만 30분, CO2 5%CO2)을원하는 복합감염성(MOI)에서 트랜스듀하기 위해 1.1.4단계에서 얻은 신선한 바이러스 입자를 첨가한다. 예를 들어, 이 경우 사용되는 MOI는 20입니다. 세포 배양인인큐베이터에서 세포를 37°C에서 5%CO2로유지한다.</li>
		<li>24h 감염 기간 후, 바이러스 성 입자를 포함하는 매체를 폐기하십시오. 신선한 배양 매체를 추가하고 48 h에 대한 세포를 계속 성장. 모든 배양은 37°C 및 5% CO2로유지됩니다.</li>
		<li>유도 단계로 진행하기 전에 감염된 세포의 집계 된 형태여부를 확인하십시오. PDX1 전염은 유전자 발현분석(보충도 1)에의해 확인된다. 참고: 다음 단계로 진행하기 전에 현미경으로 세포 형태학을 확인하십시오.</li>
		<li>수확및 미세환경 유도 접근법으로서 3단계 유도 프로토콜(단계 1.3)으로 진행한다.</li>
	</ol></li>
	<li>3단계 유도 프로토콜 참고: 3단계 유도 프로토콜은 혈청 이없는 매체(SFM)-A, SFM-B 및 SFM-C를 사용하여 hDPSC의 일련의 췌장 분화를 최종 엔데드럼, 췌장 내분비 및 췌장 베타 세포/IpC로 각각 발생시켰습니다.<ol>
<li>배양 배지를 폐기한 다음 1x 인산염 버퍼링 용액(PBS)으로 변환된 hDPSC를 세척합니다.</li>
		<li>세포에 0.25% 트립신-EDTA 용액을 추가하고 37°C, 5% CO2에서1분 동안 배양한다.</li>
		<li>배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지하고 세포를 부드럽게 플러시하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다. 각 수집 튜브에 세포와 알리쿼트 1 x 106 세포를 계산합니다.</li>
		<li>468 x g(상대 원심력: RCF), 4°C에서 셀 서스펜션을 원심분리하여 5분 동안 분리합니다. 상체를 버리고 셀 펠릿을 저장합니다.</li>
		<li>제1췌장 유도 배지, 즉 혈청이 없는 배지(SFM)-A. 낮은 부착 배양판(60mm)에 세포를 시드하는 제1췌도 유도 배지의 3mL에서 펠릿을 재연한다. 3일 동안 세포를 37°C 및 5% CO2로 유지한다. 참고: 다음 단계로 진행하기 전에 반전된 현미경으로 세포 형태학을 관찰합니다.</li>
		<li>SFM-A를 제거하고 두 번째 유도 매체, 즉 SFM-B의 3mL을 추가합니다. 37°C, 5% CO2에서다음 2일 동안 세포를 유지한다. 참고: 다음 단계로 진행하기 전에 반전된 현미경으로 세포 형태학을 관찰합니다.</li>
		<li>SFM-B를 제거하고 세 번째 유도 매체, 즉 SFM-C의 3mL을 추가합니다. 세포 배양에서 다음 5일 동안 세포를 유지하여 37°C에서 5%CO2로유지한다. 매 48 시간마다 매체를 변경합니다. 5 일 후에 그들의 형태를 관찰하십시오. 참고: 각 유도 매체는 설명된 바와 같이 상이한 시약으로 보충됩니다. SFM-A: 1% 소 혈청 알부민 (BSA), 1 x 인슐린 -transferrin-selenium (ITS), 4 nM 의 활성, 1 nM의 나트륨 부티레이트, 및 베타 메카포에탄올의 50 μM; SFM-B: 1% BSA, 1배 ITS, 0.3 mM 타우린; 및 SFM C: 1.5% BSA, 1x ITS, 3 mM 타우린, 글루카곤 같은 펩티드 (GLP)-1, 1 mM 니코티나미드, 1x 비필수 아미노산 (NEAA).</li>
		<li>각 단계 후에 반전된 현미경의 밑에 세포 형태학을 확인하십시오. 세포는 더 집계되고 식민지로 떠있을 것입니다.</li>
		<li>추가 분석을 위해 세포 식민지를 수집합니다. 식민지 형태와 크기를 확인합니다. 췌장 유전자 마커 발현 분석 및 기능 분석을 수행합니다(포도당 자극 C-펩티드 분비 분석).</li>
	</ol></li>
</ol>2. 비통합 유도 프로토콜
참고: 비통합 프로토콜은 미세환경 유도 접근법8,9로3단계 유도 프로세스를 가진 IC를 전달하기 위한 백본 프로토콜이다.
<ol><li>70%-80%의 인플루엔자에 3-5 hDPSC를 사용합니다.</li>
	<li>배양 매체를 폐기하고 1x PBS로 hDPSC를 세척합니다.</li>
	<li>세포에 0.25% 트립신-EDTA 용액을 넣고 37°C, 5% CO2에서1분 동안 배양한다.</li>
	<li>배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지하고 세포를 부드럽게 피펫하여 단일 셀 현탁액을 얻습니다. 각 수집 튜브에 세포 와 알리쿼트 1 x 106 세포를 계산합니다.<ol>
<li>468 x g (RCF), 4 °C, 5 분에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 상부체를 폐기합니다.</li>
		<li>SFM-A에서 펠릿을 다시 중단하고 낮은 부착 배양 플레이트(60mm)에 시드합니다. 3 일 동안 37 °C 및 5 % CO2에서 세포를 배양합니다. 반전된 현미경의 밑에 세포 형태학을 확인하십시오.</li>
		<li>SFM-A를 제거하고, SFM-B(3일차)를 추가한 다음, 37°C, 5% CO2하에서 다음 2일 동안 세포를 유지한다.</li>
		<li>SFM-B를 제거하고, SFM-C(5일)를 추가한 다음, 37°C, 5% CO2하에서 다음 5일 동안 세포를 유지한다. SFM-C는 48h마다 변경됩니다. 참고: 각 유도 매체는 설명된 바와 같이 상이한 시약으로 보충됩니다. SFM-A: 1% BSA, 1x ITS, 4 nM 의 활성A, 1 nM의 나트륨 부티레이트, 및 베타-메르카포에탄올의 50 μM; SFM-B: 1% BSA, 1배 ITS, 0.3 mM 타우린; 및 SFM C: 1.5% BSA, 1x ITS, 3 mM 타우린, GLP-1의 100 nM, 1 mM 니코티나미드, 1x NEAA.</li>
		<li>각 단계 후 와 10 일 반전 현미경에서 세포 형태학을 확인해야합니다. 참고: 세포가 더 집계되고 식민지로 떠들것입니다.</li>
		<li>추가 분석을 위해 세포 식민지를 수집합니다. 식민지 형태와 크기를 확인합니다. 췌장 유전자 마커 발현 분석 및 기능 분석을 수행합니다(포도당 자극 C-펩티드 분비 분석).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Kuncorojakti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate%2FPluronic+F127-based+encapsulation+supports+viability+and+functionality+of+human+dental+pulp+stem+cell-derived+insulin-producing+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Engineering%22%5BJournal%5D)">Alginate/Pluronic F127-based encapsulation supports viability and functionality of human dental pulp stem cell-derived insulin-producing cells.</a> Journal of Biological Engineering. 14, 23(2020).</li>
<li>Ritz-Laser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+expression+of+the+beta-cell+specific+transcription+factor+Pdx1+inhibits+glucagon+gene+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Ectopic expression of the beta-cell specific transcription factor Pdx1 inhibits glucagon gene transcription.</a> Diabetologia. 46 (6), 810-821 (2003).</li>
<li>Pampusch, M. S., Skinner, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transduction+and+expansion+of+primary+T+cells+in+nine+days+with+maintenance+of+central+memory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Transduction and expansion of primary T cells in nine days with maintenance of central memory phenotype.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (157), (2020).</li>
<li>Fraga, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+transfection+efficiency+of+pIDUA%2Fnanoemulsion+complexes+in+a+mucopolysaccharidosis+type+I+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Factors influencing transfection efficiency of pIDUA/nanoemulsion complexes in a mucopolysaccharidosis type I murine model.</a> International Journal of Nanomedicine. 12, 2061-2067 (2017).</li>
<li>Balak, J. R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+ex+vivo+lentiviral+transduction+of+primary+human+pancreatic+exocrine+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Highly efficient ex vivo lentiviral transduction of primary human pancreatic exocrine cells.</a> Scientific Reports. 9 (1), 15870(2019).</li>
<li>Balaji, S., Zhou, Y., Opara, E. C., Soker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinations+of+Activin+A+or+nicotinamide+with+the+pancreatic+transcription+factor+PDX1+support+differentiation+of+human+amnion+epithelial+cells+toward+a+pancreatic+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Reprogramming%22%5BJournal%5D)">Combinations of Activin A or nicotinamide with the pancreatic transcription factor PDX1 support differentiation of human amnion epithelial cells toward a pancreatic lineage.</a> Cellular Reprogramming. 19 (4), 255-262 (2017).</li>
<li>Spaeth, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+a+novel+role+for+the+Pdx1+transcription+factor+in+islet+%CE%B2-Cell+maturation+and+proliferation+during+weaning%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Defining a novel role for the Pdx1 transcription factor in islet β-Cell maturation and proliferation during weaning.</a> Diabetes. 66 (11), 2830-2839 (2017).</li>
<li>Bastidas-Ponce, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxa2+and+Pdx1+cooperatively+regulate+postnatal+maturation+of+pancreatic+%CE%B2-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Foxa2 and Pdx1 cooperatively regulate postnatal maturation of pancreatic β-cells.</a> Molecular Metabolism. 6 (6), 524-534 (2017).</li>
<li>Zhu, Y., Liu, Q., Zhou, Z., Ikeda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDX1%2C+Neurogenin-3%2C+and+MAFA%3A+critical+transcription+regulators+for+beta+cell+development+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">PDX1, Neurogenin-3, and MAFA: critical transcription regulators for beta cell development and regeneration.</a> Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 240(2017).</li>
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MsC에서 더 높은 IpC 생산을 달성하는 것은 당뇨병 치료에 필수적인 역할을합니다. 통합 프로토콜의 중요한 단계는 변환 및 변환된 세포의 품질에 사용되는 세포의 품질에 의존합니다. 성공적인 트랜스퍼션을 위해 확인해야 하는 몇몇 세포 요구 사항은 세포 건강, 세포 은행 관리 및 세포가 미상 활성 상태에 있다는 것을 보장하고 있습니다. 또한, 트랜스듀스 된 세포의 생존가능성을 모니터링하는 것도 중요한 역할을 한다. 덜 성공적인 트랜스듀션은 자극된 세포의 열악한생존력(12)에기인한다. 비통합 프로토콜의 경우, 형태학적 외관과 부동 식민지는 췌장 분화9의성숙과 관련이 있기 때문에 달성되어야 한다.
통합 유도 프로토콜에 대한 기술의 수정 및 문제 해결 측면에서, 건강하고 양질의 세포는 3-5 및 70%-80% 인플루엔자에 있는 세포를 사용하여 얻을 수 있으며, 유도된 세포의 품질은 다음 단계로 이동하기...

당뇨병은 지속적인 글로벌 관심사입니다. 국제 당뇨병 연맹(IDF) 보고서에 따르면 당뇨병의 전 세계 보급률은 2000년 1억 5,100만 명에서 2015년 4억 1,500만 명으로 증가할 것으로추정했다. 최신 역학 기지를 둔 연구 결과는 추정된 세계적인 당뇨병 보급이 2017년에 4억 5천1백만에서 2045년1년에693,000,000로 증가할 것이라는 점을 예측했습니다. 에드먼튼 프로토콜을 이용한 췌장적 이식의 성공은 2000년에 처음 입증되었으며, 내인성 인슐린 생산을 유지하고 I형 당뇨병 환자3에서노모글리세믹 상태를 안정화시키는 것으로 나타났다. 그러나 Edmonton 프로토콜의 적용은 여전히 병목 현상에 직면해 있습니다. 타입-I 당뇨병을 가진 각 환자는 적어도 2-4 islet 기증자를 필요로 하기 때문에 cadaveric 췌장 기증자의 제한된 수는 주요 문제점입니다. 더욱이, 면역억제제의 장기간 사용은 생명을 위협하는부작용4,5를유발할 수 있다. 이를 해결하기 위해 지난 10년간 당뇨병에 대한 잠재적 치료법의 개발은 주로 다양한 줄기 세포6에서효과적인 인슐린 생산 세포(IpC)의 생성에 초점을 맞추고 있다.
줄기 세포는 베타 세포의 손실에 기인하는 당뇨병 타입 I를 포함하여 많은 질병에서 대체 처리가 되었습니다. IpC의 이식은 이들 환자에서 혈당을 조절하는 새로운 유망한 방법입니다7. 통합 및 비통합 유도 프로토콜인 IpC 생성을 위한 두 가지 방법이 이 문서에서 제시됩니다. 유도 프로토콜은 성숙하고 기능적인 IPC8,9를얻기 위해 자연 췌장 발달 과정을 모방했다.
이 연구를 위해, hDPSC는 MSC 표면 마커 검출, 다중리 분화 전위 및 RT-qPCR을 위한 유동 세포측정을 특징으로 하여 줄기 성질 및 증식 유전자 마커(data)의 발현을 결정하기 위해8,9,10. hDPSC는 최종 내막, 췌장 내분비, 췌장 내분비 및 췌장 베타 세포 또는 IpC(도 1)를향해 각각7을유도하였다. 세포를 유도하기 위해, 3단계 유도 접근법은 백본 프로토콜로 사용되었다. 이 프로토콜을 통합되지 않는 프로토콜이라고 합니다. 통합 프로토콜의 경우, 필수 췌장 전사 인자 인 PDX1은hDPSC에서 과발현된 PDX1을 3단계 분화 프로토콜을 사용하여 hDPSC에서 과도하게 발현되었다. 통합되지 않는 프로토콜과 통합 프로토콜의 차이점은 통합 프로토콜이 아닌 통합 프로토콜에서 PDX1의 과발현입니다. 췌장 분화는 이 연구에서 통합 및 비 통합 프로토콜 사이에서 비교되었습니다.

<table><tbody><tr><td>Cell Culture</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation, 미국</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>Corning&reg; 60mm TC 처리 배양 접시</td><td>Corning&reg;</td><td></td><td></td>430166</tr><tr><td>둘베코' Thermo</td> <td>Fisher Scientific Corporation</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX&trade;</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS) 분말, pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813-10PAK</td> 멸균 DDI 트립신-EDTA(0.25%)<td>가 포함된 PBS 용액 1L를 준비하는 데 1팩이 사용됩니다</td></tr><tr><td></td><td>.Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral Vector Carrying PDX1 Preparation</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>아미콘&reg; Ultra-15 원심 필터</td><td>Merck Millipore, 미국</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>Human pWPT-PDX1 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>12256</td><td>Didier Trono의 선물; http://n2t.net/addgene:12256; RRID: Addgene_12256</td></tr><tr><td>Millex-HV 주사기 필터 유닛, 0.45&nbsp; &마이크로; m</td><td>Merck Millipore</td><td>SLHV033RB</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td>Didier Trono의 선물; http://n2t.net/addgene:12259; RRID: Addgene_12259</td></tr><tr><td>폴리브레네 감염 / 트랜스펙션 시약</td><td>Merck Millipore</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2 plasmid</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Didier Trono의 선물; http://n2t.net/addgene:12260; RRID:</td></tr> <tr><td>Addgene_12260Three-step Induction Protocol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Activin A 재조합 인간 단백질</td><td>Merck Millipore</td><td>GF300</td><td></td></tr><tr><td>베타-메르캅토에탄올</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA, Cohn fraction V, 지방산 무료)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6003</td><td></td></tr><tr><td>글루카곤 유사 펩타이드(GLP)-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G3265</td><td></td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS)</td><td>Invitrogen</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>시그마-알드리치</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>비필수 아미노산(NEAA)</td><td>Thermo Fisher Scientific Corporation</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>비처리 세포 배양 접시, 60mm</td><td>Eppendorf</td><td>30701011</td><td></td></tr><tr><td>부티르산나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>타우린</td><td>시그마-알드리치</td><td>T0625</td><td></td></tr></tbody></table>

시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도

In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages

2000년 현재, 에드먼튼 프로토콜을 사용하여 췌장 이식의 성공은 여전히 몇 가지 장애물에 직면했습니다. 이들은 cadaveric 췌장 기증자의 제한된 수 및 면역 억제제의 장기 사용을 포함합니다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC) islet 같은 세포 생성의 대체 소스로 잠재적인 후보로 간주 되었습니다. 우리의 이전 보고서는 성공적으로 인슐린 생산 세포 (CFC)에 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 유도 프로토콜의 설립을 설명했다. 그러나 유도 효율은 크게 다양했습니다. 이 논문에서는 hDPSC 유래 IpC(hDPSC-IpC)를 전달하기 위한 통합(마이크로 환경 및 유전 조작) 및 비통합(microenvironmental 조작) 유도 프로토콜을 통한 hDPSCs 췌장 유도 효율의 비교를 시연합니다. 결과는 다중 복용량 포도당 도전에 3 차원 식민지 구조, 수율, 췌장 mRNA 마커 및 기능성 속성의 관점에서 유도 접근 둘 다에 대한 뚜렷한 유도 효율을 건의합니다. 이러한 사실 인정은 임상적으로 적용 가능한 IpC 및 췌장 계보 생산 플랫폼의 미래 설립을 지원할 것입니다.

이 문서에서는 유도 프로토콜의 결과를 비교했습니다. 두 유도 프로토콜의 다이어그램은 그림 2A,C에 설명되어있습니다. 두 프로토콜 모두에서, 평가는 가벼운 현미경으로 수행되었고, 이미지는 ImageJ로 분석되었다. hDPSC는 유도 프로토콜 모두에서 유도 첫날부터 식민지와 같은 구조를 형성할 수 있었습니다. 식민지의 형태는 둥글고 조밀했으며, 모든 식민지는 유도 기간 동안 배양 용기에 떠있었다(그림 2B,D). 두 프로토콜의 총 식민지 수도 결정되었다; 그 결과 통합 유도 프로토콜의 경우 전체 콜로니 수가 비통합 유도프로토콜(도 2E)에비해 약간 높았다는 것을 보여주었다. 그러나, 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. 더욱이, 두 유도 프로토콜 모두에서 콜로니 크기 분포도 평가하였다(도<strong class="...

이 프로토콜은 생체 외에서췌장 계보로 인간 치과 펄프 줄기 세포 (hDPSC)를 분화하기위한 두 가지 다른 유도 프로토콜 사이의 비교를 제시합니다 : 통합 프로토콜 및 비 통합 프로토콜. 통합 프로토콜은 더 많은 인슐린 생산 세포(IPC)를 생성합니다.

As of 2000, the success of pancreatic islet transplantation using the Edmonton protocol to treat type I diabetes mellitus still faced some obstacles. ...

이 비디오는 췌장 혈통을 향해 인간 치과 펄프 줄기 세포의 체외 유도를 보여줍니다. 줄기 세포는 베타 세포의 생체 래그닝을 일으키는 당뇨병 타입 I를 포함하여 많은 질병에서 대체 처리를 줍니다. 인슐린 생성 세포의 이식은 평생 을 일으키는 원인이 되기 위한 새로운 유망한 방법이 될 것입니다.이 비디오에서는 통합 및 비 통합 유도 프로토콜을 포함하여 인슐린 생성 세포를 생성하기 위한 두 가지 접근법이 설명되어 있다. 그리고 이 부분에서 인간 치과 펄프 줄기 세포로부터 인슐린 생성 세포를 유도하기 위한 통합 프로토콜이 설명된다. 유도 프로토콜의 경우 자연 췌장 발달 과정을 혼합하기 위한 것입니다.자연및 기능성 인슐린 생성 세포를 얻으려면. 치과 펄프 줄기 세포와 같은 중간 엽 줄기 세포로부터 인슐린 생성 세포를 생성하기 위해 다단계 유도 프로토콜이 사용됩니다. 중간 엽 줄기 세포는 단어 최종 엔데드름, 췌장 내분비, 다음 췌장 베타 세포 또는 인슐린 생산 세포 각각에 사용된다.세포를 유도하기 위해, 3단계 유도 접근법은 백본 프로토콜로 사용된다. 통합 프로토콜은 인간의 치과 펄프 줄기 세포에 의해 필수 췌장 전사 인자 PDX-1의 이상 만료를 사용하였다. 그런 다음 PDX-1 이상 발현 된 줄기 세포는 3 단계 분화 프로토콜을 사용하여 추가로 유도될 것이다.통합 프로토콜에 의한 췌장 분화 잠재력은 애니메이션에 설명된 비 통합 프로토콜과 비교됩니다. 이 아이디어는 인간의 연구 윤리위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다, 치과 학부, 환자의 통보 동의출라롱콘 대학. 이 프로토콜은 PDX-1의 만료 이상으로 시작되었습니다.70-80%의 합류로 2~5의 부분에서 인간 치과 펄프 줄기 세포가 트랜스듀션에 사용된다. 세포는 트립시게되고 계산됩니다. 그런 다음 백만 개의 세포가 경질 용기에 앉아 하룻밤 동안 배양됩니다.24시간 후 PDX-1 유전자를 운반하는 갓 준비된 바이러스 백신은 원하는 복합감염에 따라 배양용기에 첨가된다. 감염된 세포는 24시간 동안 인큐베이터에 보관됩니다. 그런 다음 신선한 배양 매체가 다른 48 기간 동안 변경되고 유지됩니다.감염된 세포의 형태는 추가 유도 단계를 사용하기 전에 검사됩니다. PDX-1이 만료되는 인간 치과 펄프 줄기 세포는 첫 번째 췌장 유도 매체에서 트립티컬화 및 중단되며, 이 단계의 배지 A.In, 낮은 부착 배양 용기가 사용된다. 미디엄 A 유도 후 3일째에 발현된 인

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

현재의 연구는 인간 배아 줄기 세포를 췌장 분화를 유도으로 이동 차별화 접근 방식에 대해 설명합니다. 큰 의미 중 인슐린을 표현하는 세포로 췌장 progenitors을 얻은​​ 인간 배아 줄기 세포를 찾는 것이 내피 세포 공동 배양 mediates의 성숙입니다.

인간 배아의 내피 세포 공동 배양 Mediates의 성숙은 감독 차별화 접근법에서 췌장 인슐린 생산 세포로 세포를 줄기

방법 중 하나를 사용하여 인간의 치과 펄프의 줄기 세포 (hDPSCs)의 분리 및 특성...

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

여기서는 하류 어플리케이션 및 상기 분화의 개선을위한 결정적인 내배엽으로 분화 노력하고 인간 배아 줄기 세포의 정제를위한 방법을 설명한다.

인간 배아 줄기 세포로부터 생성 된 내배엽 세포의 정제를위한 신속하고 효율적인 방법

여기에서는 시험 관내 NKX6-1 + 췌장 전구 세포에 인간 배아 줄기 세포가 분화하는 4 단째의 프로토콜을 설명한다. 이 프로토콜은, 인간 다 능성 줄기 세포의 종류에 적용될 수있다.

능성의 효율적인 분화 NKX6-1에 줄기 세포<sup&gt; +</sup&gt; 췌장 전구 세포

여기, 우리 췌 장/십이지 homeobox 단백질 1+ 로 인간의 만능 줄기 세포 (hPSCs)를 차별화 하는 상세한 프로토콜을 제시 (PDX1+) 췌 장 계보의 세대에 대 한 셀의 비 식민지 유형 단층 성장에 따라 단일 세포를 해리 했다. 이 메서드는 생산 하는 동종 hPSC 파생 된 세포, 유전자 조작 및 심사에 적합 합니다.

효율적인 세대의 췌 장/십이지 Homeobox 단백질 1+ 뒤 Foregut/췌 장 창시자 접착 문화에 hPSCs에서

여기 우리는 프리온 단백질 표정 신경 분화 과정을 평가 하기 위해 인간의 치과 펄프의 줄기 세포 분리 및 전파에 대 한 프로토콜을 제시.

절연, 전파, 그리고 인간의 치과 펄프의 줄기 세포의 신경 분화 동안 프리온 단백질 표정

본 프로토콜은 평면 단일층에서 인간 만능 줄기 세포 (hPSC)로부터 유래된 췌장 전구세포에서 PDX1 및 NKX6.1 전사 인자의 동시 발현을 증가시키는 향상된 방법을 기술한다. 이것은 신선한 매트릭스를 보충하고, 세포 밀도를 조작하고, 내배엽 세포를 해리시킴으로써 달성됩니다.

2D 배양 시스템에서 인간 만능줄기세포를 췌장 베타세포 전구체로 분화

이 논문은 외식물 배양 방법을 사용하여 치수 줄기세포의 1차 배양을 확립하고 ICSCRT 지침에 따라 이러한 세포의 특성을 분석하기 위한 단계별 가이드를 제공합니다. 이 프로토콜에 의해 분리된 세포는 추가 응용을 위한 중간엽 줄기 세포로 간주될 수 있습니다.

치과용 치수줄기세포의 1차 배양

이 기사에서는 β-cell 유사 세포의 유도 분화 및 기능 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다. 인슐린을 생산하는 췌장 세포를 생성하기 전에 인간 만능 줄기세포에 대한 최적의 배양 조건과 통로를 설명합니다. 6단계 분화는 최종 내배엽 형성에서 포도당에 반응하여 인슐린을 분비하는 세포와 같은 기능적 β세포로 진행됩니다.

인간 만능 줄기세포에서 기능성 췌장 인슐린 분비 세포를 생성하기 위한 최적화된 프로토콜

이 프로토콜은 효소 소화를 통해 치수에서 다분화능 줄기 세포의 추출, 배양 및 보존을 강조합니다. 또한 조골세포, 지방세포 및 연골세포로 분화할 수 있는 잠재력을 보여주며 공정에서 정밀도와 일관성의 중요성을 강조합니다.

Isolation, Culture, and Characterization of Dental Pulp Stem Cells from Human Deciduous and Permanent Teeth(인간 낙엽 및 영구치에서 치과용 치수 줄기 세포의 분리, 배양 및 특성화)

학습하세요 인간 치과 펄프 줄기 세포를 췌장 혈통으로 유도하는 통합 및 비통합 프로토콜을 비교하는 방법을. 이 연구는 제1형 당뇨병 치료를 위한 기능성 인슐린 생성 세포 생산에 활용됩니다.

시험관 내 췌장 혈통을 향한 인간 치과 펄프 줄기 세포의 유도

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