인간 골수성 U937 세포에서 유세포 분석에 의한 SAMHD1 제한 분석

대식세포의 HIV 감염에서 세포 인자의 역할에 대한 관심이 증가함에 따라 특히 U937 세포에서 발현되지 않는 SAM HG 1에 대한 유연한 분석 시스템을 개발했습니다. 이 시스템의 가장 큰 장점은 유연성입니다. 설정이 완료되면 다양한 단백질, 세포 또는 표적 바이러스를 분석하는 데 사용할 수 있습니다.

세포의 건강을 유지하고 다색 유세포분석에 익숙해지는 것이 중요합니다. 분석을 시작하기 10 분 전에 세포 분석기와 컴퓨터를 켜십시오. 폐기물이 비어 있고 외피 탱크가 가득 찼는지 확인하십시오.

그런 다음 로그인하여 분석 소프트웨어를 엽니다. 팔을 움직인 후 물 튜브를 제거하십시오. 유량을 높음으로 설정하고 프라임을 누릅니다.

불이 꺼질 때까지 기다렸다가 이 과정을 세 번 더 반복합니다. 물 튜브를 다시 놓고 3 분 동안 높은 유속으로 움직입니다. 그런 다음 유량을 낮음으로 설정하고 획득할 때까지 대기를 누릅니다.

실험, 새 실험을 선택하고 확인을 눌러 빈 실험을 선택하고 실험을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 표본을 추가합니다. 확인을 눌러 빈 패널로 이동합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 적절한 이름으로 이름을 바꾸고 더하기 기호를 클릭하여 시편을 열어 새 튜브를 표시합니다.

튜브를 두 번 클릭하면 인스펙터에서 세포분석기 설정을 볼 수 있습니다. 매개변수 메뉴에서 청색 레이저 53030 및 황색 레이저 61020을 제외한 불필요한 형광 색소를 삭제합니다. 워크시트에서 해당 아이콘을 클릭하고 축 레이블을 클릭하여 축을 변경하여 전방 분산 영역 대 측면 산점도 도트, YFP 히스토그램, RFP 히스토그램 및 RFP 대 YFP 점도표를 만듭니다.

감염되지 않은 변환되지 않은 컨트롤을 로드하고 컴퓨터에서 run을 누릅니다. 그런 다음 획득 대시보드에서 획득을 누릅니다. 대시보드에서 전방 및 측면 산란 전압을 조정하여 셀을 왼쪽 아래 사분면에 배치합니다.

이 인구 주위에 게이트를 만들고 P one으로 표시합니다. 다른 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 P one 표시를 선택하여 후속 분석에서 파편을 제거합니다. 피크가 히스토그램의 왼쪽에 오도록 RFP 및 YFP 전압을 아래로 조정합니다.

YFP용 단색 컨트롤을 로드하고 획득을 누릅니다. 대부분의 형광 셀이 검출기 범위 내에 있도록 대시보드에서 YFP 전압을 조정합니다. 그런 다음 RFP 컨트롤에 대해 동일한 작업을 반복합니다.

실험을 선택합니다. 보정 설정으로 이동하여 보정 컨트롤 만들기를 선택하고 확인을 선택하여 일반 워크시트로 전환한 다음 얼룩이 없는 일반 워크시트를 선택합니다. 실행을 누르고 얼룩지지 않은 컨트롤을 획득하십시오.

온전한 세포 주위에 게이트 P를 그리고 기록합니다. 튜브를 제거하고 기계를 대기 상태로 두십시오. P one을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하십시오.

모든 보상 컨트롤에 적용을 클릭하고 RFP 일반 워크시트로 전환합니다. 실행을 누르고 단색 RFP 제어를 기록하면 소프트웨어가 자동으로 양극 셀을 게이트합니다. 기기를 대기 상태로 설정하고 YFP 제어에 대해 동일한 작업을 반복합니다.

실험을 선택하고 보정 설정으로 이동하여 보정 계산을 선택한 다음 링크를 클릭하고 저장합니다. 전역 워크시트로 전환하고 시편 튜브로 돌아갑니다. HIV RFP에 감염된 야생형 SAM HD 1로 형질도입된 세포를 획득하고, YFP 및 RFP에 대해 수직 및 수평으로 정렬된 사분면의 모서리에서 4개의 별개의 집단을 볼 수 있는지 확인한다.

튜브를 제거하고 대기 모드를 누릅니다. 형질전환되지 않고 감염되지 않은 샘플을 다시 로드하고 실행을 누릅니다. 획득 대시보드에서 정지 게이트를 P 1로 설정하고 이벤트를 설정하여 30, 000개의 이벤트를 기록합니다.

녹음을 누릅니다. 각 튜브 사이의 다음 튜브를 눌러 다른 샘플 및 대조군에 대해 동일한 작업을 반복합니다. 실행 중 또는 사후 호크 중에 샘플의 이름을 바꾸고 데이터를 dot FCS 파일로 내보냅니다.

소프트웨어를 열고 모든 FCS 파일을 대시 보드로 드래그하십시오. 보정 컨트롤을 선택하고 보정 하위 폴더로 드래그합니다. 변환되지 않은 감염되지 않은 튜브를 두 번 클릭하여 파일을 열고 전방 산란 대 측면 산란 플롯을 수행합니다.

다각형 도구를 선택하고 왼쪽 아래 모서리에 있는 파편을 제외한 온전한 세포 집단을 게이트하고 이름을 셀로 지정합니다. 셀을 가리지 않도록 레이블을 이동합니다. 이 게이트를 모든 표본 막대의 전체 튜브 모집단으로 끕니다.

수평 화살표 버튼을 사용하여 전체 모집단을 스크롤하여 각 튜브에 적절한 게이팅을 확인하십시오. 셀을 두 번 클릭하고 축을 높이 대 영역으로 조정합니다. 직사각형 게이트를 사용하여 단일 큰 모집단을 선택하여 이중선을 제외하고 소프트웨어가 자동으로 단일 셀로 이름을 지정하도록 제안합니다.

그런 다음 이 게이트를 모든 세포 모집단으로 끌어 놓고 게이팅이 모든 샘플에 적합한지 확인합니다. 감염되지 않은 형질도입된 샘플에 대한 단일 세포 집단을 선택합니다. Y축을 YFP에 대해 보정된 청색 레이저로 변경하고 X축을 RFP에 대해 보상된 노란색 레이저로 변경합니다.

사분면 게이팅 도구를 선택하고 음수 셀 모집단의 오른쪽 위 극단을 클릭합니다. 이 예비 게이팅을 모든 샘플 막대의 부모 게이트로 끌어 모든 단일 세포 집단에 적용합니다. 사분면 게이트가 모집단을 만족스럽게 분리하지 못하면 다각형 도구를 사용하여 개별 사분면을 게이트합니다.

야생형 SAM HD 원온리 샘플로 스크롤하여 형질도입되지 않은 YFP 음성 셀과 YFP 양성 셀 사이의 올바른 게이팅을 확인합니다. 등고선 보기를 사용하여 음수 세포를 희미한 YFP 세포와 구별합니다. 모든 샘플에 유효한 YFP 음성과 양성 간의 최상의 분할을 사용하고 샘플을 스크롤하여 YFP 양성과 관련하여 게이팅을 확인합니다.

형질도입되지 않은 HIV RFP 감염 샘플로 스크롤하여 감염되지 않은 RFP 음성과 감염된 RFP 양성 사이의 게이팅이 올바른지 확인합니다. 필요한 경우 등고선 보기를 사용하고 나머지 샘플을 스크롤하여 게이팅이 모든 샘플에 유효한지 확인합니다. 각 샘플에는 4개의 사분면이 필요합니다.

Q1 YFP 양성, Q2 이중 양성, Q3 RFP 양성 및 Q4 이중 음성. 테이블 편집기를 열고 4개의 사분면 게이트를 대시보드로 끕니다. 드롭다운에서 파일을 선택하고 엑셀을 선택합니다.

파일 대상을 선택하고 테이블 생성을 클릭하십시오. 생성된 스프레드시트를 로컬 파일 명명 규칙에 따라 저장합니다. 배치 편집기 아이콘을 클릭하여 플롯 및 게이팅 전략의 표현을 내보냅니다.

각 모집단을 선택하고 필요한 축, 레이블 및 간격을 사용하여 편집기로 드래그합니다. 배치 섹션 아래의 모든 샘플에 대해 표시된 동일한 플롯으로 배치를 생성하려면 열에 하나를 입력하고 배치 보고서 작성을 누릅니다. 파일 메뉴에서 너비에 맞게 배율을 선택하고 페이지 나누기를 방지합니다.

그런 다음 필요한 파일 형식으로 저장합니다. 내보낸 스프레드시트에서 텍스트 원고에 설명된 대로 열을 생성합니다. 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 각 SAM HD 하나의 구성에 대한 복제 데이터의 평균을 구하고 제한 비율 값을 계산합니다.

최적 및 차선의 데이터에 대해 대표적인 YFP 대 RFP 플롯이 생성되었습니다. 최적이 아닌 데이터 플롯은 HIV 감염이 너무 낮아 보상 및 게이팅에 어려움을 겪었음을 나타냅니다. 제한비율은 0.5로 예상비율 0.3보다 높았다.

야생형 및 음성 대조군에 대하여 SAM HD의 변이체에 대한 제한 비율의 플롯을 최적 및 차선의 데이터에 대해 생성하였다. 최적 데이터에서, 야생형은 대략 0.2의 예상 제한을 나타내었고, 음성 대조군 HD 206 내지 7 AA는 1.0의 제한비를 가졌다. 변이체 R372D는 야생형과 유의하게 상이하였으나, 음성 대조군과는 유의하게 상이하지 않았으며 제한하는 능력을 상실하였다.

차선의 데이터에서 음성 대조군은 예상대로 행동했지만 야생형은 낮은 감염률로 인해 0.5의 제한 비율을 보였습니다. R143D는 야생형 및 음성 대조군과 통계적으로 상이한 중간 표현형을 보였다. 변이체 G209S는 야생형과 유의하게 상이하였으나 음성 대조군과는 유의하게 상이하지 않았고, 따라서 제한하는 능력을 상실하였다.

특히 유세포분석을 처음 접하는 경우 많은 대조 세포를 보유하는 것이 중요합니다. 이에 따라 또는 병렬로 동일한 돌연변이 체의 생화학 적 분석을 수행하여 전체 론적 그림을 형성 할 수 있습니다.